Effects of Astragaloside Ⅳ on exosome secretion and its microRNA-126 expression in human endothelial progenitor cells
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摘要: 目的 探讨黄芪甲苷对人内皮祖细胞(EPC)分泌外泌体及外泌体中微小RNA-126(miRNA-126)表达的影响。 方法 取湖南中医药大学第一附属医院妇产科2019年出生的1名足月健康新生儿脐带血，采用密度梯度离心法分离单个核细胞并培养7 d，其间行形态学观察；取第3代细胞，采用CD31免疫磁珠分选法和双荧光染色法鉴定。将鉴定成功的EPC按照随机数字表法分为黄芪甲苷组和磷酸盐缓冲液(PBS)组。黄芪甲苷组细胞加入终质量浓度100 mg/L的黄芪甲苷培养24 h，PBS组细胞加入等体积的PBS培养24 h。培养结束后收集2组细胞培养上清液中的外泌体，采用蛋白质印迹法检测外泌体特征性标志物CD9、CD63和CD81表达，于透射电子显微镜下观察EPC外泌体(EPC-Exo)形态，采用纳米颗粒跟踪分析技术检测EPC-Exo的粒径，采用二辛丁酸法测定EPC-Exo的浓度(样本数为3)，采用反转录PCR法测定EPC-Exo中与血管新生相关miRNA-126-3p和miRNA-126-5p的表达(样本数为3)。对数据行独立样本
t 检验。 结果 (1)培养第4天，细胞开始贴壁生长，圆形、梭形、条形等多形态同时出现；继续培养至第7天时，细胞边缘清晰，呈铺路石样排列，中央细胞呈圆形，周边细胞呈梭形。(2)CD31免疫磁珠分选法显示细胞膜染绿色，细胞核染蓝色；双荧光染色法显示细胞呈橙黄色。经以上鉴定，细胞被证实为EPC。(3)培养24 h，2组EPC-Exo的CD9、CD63和CD81表达均呈阳性，证实本实验已成功提取EPC-Exo。(4)培养24 h，2组EPC-Exo均呈圆形膜囊泡，形态无明显差异。(5)培养24 h，黄芪甲苷组中98.7%的EPC-Exo粒径为84.7～143.1 nm，PBS组中98.0%的EPC-Exo粒径为88.7～123.5 nm。(6)培养24 h，黄芪甲苷组EPC-Exo的质量浓度为(310±5)μg/mL，明显高于PBS组的(257±5)μg/mL，t ＝13.369，P <0.01。(7)培养24 h，黄芪甲苷组EPC-Exo中miRNA-126-3p(t ＝16.062，P <0.01)和miRNA-126-5p(t ＝3.252，P <0.05)均明显多于PBS组。 结论 黄芪甲苷可改善人EPC分泌外泌体的功能，且所分泌的外泌体负载miRNA-126。Abstract: Objective To investigate the effects of Astragaloside Ⅳ on the secretion of exosomes in human endothelial progenitor cells (EPCs) and the expression of microRNA (miRNA)-126 in exosomes. Methods The umbilical cord blood from one healthy full-term newborn from the Department of Obstetrics and Gynecology of the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine in 2019 was harvested for isolating mononuclear cells by density gradient centrifugation and cultured for 7 days. Morphological observation was performed during this period. Cells of the third passage were collected for identification by CD31 immunomagnetic bead sorting and double fluorescence staining. According to the random number table, the identified EPCs were divided into Astragaloside Ⅳ group and phosphate buffer solution (PBS) group. The cells in Astragaloside Ⅳ group were cultured with Astragaloside Ⅳ in final mass concentration of 100 mg/L for 24 hours, and the cells in PBS group were cultured with the same volume of PBS for 24 hours. After culture, the exosomes from the cell culture supernatant of the two groups were collected, and the expressions of characteristic markers of exosomes CD9, CD63, and CD81 were detected by Western blotting, the morphology of EPC exosomes (EPC-Exos) was observed under transmission electron microscope, and the particle size of EPC-Exos was detected by nanoparticle tracking analysis technique. The concentration of EPC-Exos was determined by dioctyl butyric acid method (the sample number was 3), and the expressions of miRNA-126-3p and miRNA-126-5p related to angiogenesis in EPC-Exos were determined by reverse transcription polymerase chain reaction (the sample number was 3). Data were statistically analyzed with independent samplet test. Results (1) On the 4th day of culture, the cells began to adhere to the wall, and the multi-forms such as circle, fusiform, and strip appeared at the same time. On the 7th day of culture, the edge of the cells was clear and arranged like a paving stone, the central cells were round, and the surrounding cells were fusiform. (2) CD31 immunomagnetic beads sorting method identification showed that the membrane was stained with green fluorescence and the nucleus was stained with blue fluorescence. Double fluorescence staining method showed that the cells were orange-yellow. The cells were identified as EPCs. (3) After 24 hours of culture, the expressions of CD9, CD63, and CD81 in EPC-Exos were all positive, confirming that EPC-Exos were extracted successfully in this experiment. (4) After 24 hours of culture, the EPC-Exos of the two groups showed round membrane vesicles, and there was no significant difference in morphology. (5) After 24 hours of culture, the particle size of 98.7% EPC-Exos in Astragaloside Ⅳ group was 84.7 to 143.1 nm, and that of 98.0% EPC-Exos in PBS group was 88.7 to 123.5 nm. (6) After 24 hours of culture, the mass concentration of EPC-Exos in Astragaloside Ⅳ group was (310±5) μg/mL, which was significantly higher than (257±5) μg/mL in PBS group,t =13.369,P <0.01. (7) After 24 hours of culture, there were more miRNA-126-3p (t =16.062,P <0.01) and miRNA-126-5p (t =3.252,P <0.05) in EPC-Exos of Astragaloside Ⅳ group than in PBS group. Conclusions Astragaloside Ⅳ can improve the function of human EPC secretory exosomes, and the secreted exosomes are loaded with miRNA-126. -
窦道型慢性创面是临床中比较常见的慢性创面，目前尚无统一定义［1］，通常是指开口于体表，向深部组织走行的慢性创面。近年来，窦道型慢性创面的诊断和治疗受到了多位学者的关注［2, 3, 4, 5］，也已引起各国卫生组织的高度重视［6］。创面测量在监测创面愈合过程和评估治疗效果方面具有重要意义［2，7, 8］，付小兵［9］院士也指出对创面进行客观准确的评估是判断疾病状况、评价各种治疗方式的根本。明确窦道型慢性创面的窦道长度、形态及内部病理学特征将有助于此类创面的诊治，但是传统方法通过探针凭经验探查创面，既无法充分获得窦道的真实长度［10］，又无法观测到窦道内部的病理特征。
本课题组引入了内镜联合CT造影检查的方法，其中CT造影检查基本可以反映窦道型慢性创面中窦道的真实长度，内镜通过窦道外口伸入可观察到窦道内部的情况，该方法有望成为此类创面有效且微创的诊治手段［11, 12］。本课题组前期研究使用的是硬性内镜，在临床实践中了解到当窦道型慢性创面的窦道出现一定程度的弯曲时，通过硬性内镜无法观察到完整的窦道内部情况［10］，因此本课题组进一步引入了软性内镜进行研究。本研究旨在比较软性内镜和硬性内镜在不同形态窦道型慢性创面临床检查中的应用价值。
1. 对象与方法
本回顾性观察性研究经上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准，批号：20170701。
1.1 入选标准
纳入标准：创面表现为皮肤表面溃疡并向深部组织走行者，病程30 d以上者，完成CT造影、硬性内镜及软性内镜全部检查者。排除标准：窦道型慢性创面已进入体腔者，有认知障碍无法配合研究者。
1.2 临床资料
2019年1月1日—12月23日，上海交通大学医学院附属瑞金医院创面修复中心收治的46例窦道型慢性创面患者符合入选标准，纳入本研究。患者中男、女各23例，年龄18~81（48±21）岁。窦道型慢性创面病因分类：医源性23例、感染性16例、压力性7例。在回顾性收集数据前，入组患者签署书面知情同意书。
1.3 主要材料来源
用于CT检查的对比剂为质量浓度350 mg/mL的碘海醇注射液，购自通用电气药业（上海）有限公司。uCT 510型CT机购自上海联影医疗科技有限公司，Mimics 17.0 CT图像测量软件购自比利时Materialise公司，千牧Q8000-L25型内窥镜系统（含长18 cm、0°、直径2.7 mm、光学放大倍率20倍的硬性内镜和图像显示仪及冷光源）购自广州市千牧电子有限公司，电子鼻咽喉内镜系统（含长51 cm、0°、直径2.6 mm、光学放大倍率20倍的软性内镜和图像显示仪及冷光源）购自日本奥林巴斯株式会社。
1.4 检测方法
入院时，对患者行CT造影、硬性内镜和软性内镜检查，其中硬性内镜和软性内镜检查免费。CT造影检查过程如下：（1）清除窦道内渗出物和脱落的坏死组织；（2）注射对比剂碘海醇注射液填充窦腔；（3）保持患者在一个适当的位置1 min；（4）采用CT机行CT检查。利用Mimics17.0 CT图像测量软件对图像进行三维重建，得到窦道的长度。硬性内镜检查过程如下：采用千牧Q8000-L25型内窥镜系统，将硬性内镜伸入窦道型慢性创面内部至可见视野最远端，并用直尺测量硬性内镜的进入长度。软性内镜检查过程如下：采用电子鼻咽喉内镜系统，将软性内镜伸入窦道型慢性创面内部至可见视野最远端，并用直尺测量软性内镜的进入长度。
1.5 统计分析指标
（1）根据CT造影及三维重建的形态结果，对窦道型慢性创面进行分类；将含明显弯曲、无明显弯曲窦道的创面分别归入曲线组、直线组。（2）记录“CT造影检查测得的创面窦道长度”（下称参考长度），计算各组创面中软性内镜或硬性内镜检查测得的“创面窦道长度与参考长度的偏差率”（下称长度偏差率），长度偏差率=（参考长度-软性内镜或硬性内镜检查测得的创面窦道长度）÷参考长度×100%，比较各组创面中软性内镜与硬性内镜检查测得的长度偏差率及二者与参考长度偏差率（0）之间的差异。
1.6 统计学处理
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料数据符合正态分布者以
2. 结果
2.1 窦道型慢性创面形态及分组
CT造影及三维重建显示，本组患者创面窦道形态大致可分为4种，包括管状（36/46）、片状（4/46）、棒槌状（4/46）及不规则状（2/46），其中，管状进一步分为I型（23/36）、L型（4/36）和Y型（9/36）。见图1。共31个含I型管状、片状或棒槌状窦道的创面归为直线组，占67.4%；共15个含Y型管状、L型管状或不规则状窦道的创面归为曲线组，占32.6%。
1 窦道型慢性创面CT造影及三维重建形态。1A.I型管状；1B.L型管状；1C.Y型管状；1D.片状；1E.棒槌状；1F.不规则状注：各图中左下角红框中图片为箭头指示处创面形态的放大图2.2 长度偏差率
在直线组中，硬性内镜、软性内镜检查测得的长度偏差率均为0。在曲线组中，软性内镜检查测得的长度偏差率为0（0，0.58%），明显低于硬性内镜检查测得的41.18%（31.68%，48.41%），Z=-3.408，P=0.001；硬性内镜检查测得的长度偏差率（40±19）%明显高于参考长度偏差率（t=8.343，P<0.001），软性内镜检查测得的长度偏差率与参考长度偏差率相近（Z=-1.342，P=0.180）。
2.3 典型病例
患者男，80岁，主诉骶尾部窦道创面形成3个月入院。该患者因大面积脑梗死卧床4年，3个月前骶尾部出现破溃，自行处置后未见愈合并形成窦道创面，无其他系统疾病和长期服药史，诊断为压力性窦道型慢性创面。门诊即行一般检查，骶尾部偏左侧可见约1.0 cm×0.5 cm皮肤破溃，创周质韧，色白，窦口未见明显渗出。入院时，CT造影及三维重建检查显示该创面窦道呈L型管状（曲线组），测得窦道长度为5.04 cm；应用硬性内镜只能检查从窦口到窦道拐点处，无法了解窦道内部全部情况，测得窦道长度为2.50 cm，长度偏光率为49.41%；应用软性内镜检查测得窦道长度为4.95 cm，与CT造影及三维重建检测结果相近，长度偏光率为1.79%。见图2。
2 不同方法检查患者压力性窦道型慢性创面情况。2A.骶尾部偏左侧可见约1.0 cm×0.5 cm皮肤破溃，创周色白，窦口未见明显渗出；2B.CT造影及三维重建检查显示窦道呈L型管状，长度为5.04 cm；2C.硬性内镜检查测得窦道长度为2.50 cm；2D.软性内镜检查测得窦道长度为4.95 cm3. 讨论
关于窦道型慢性创面的窦道实际长度及形态的获得方法，理论上应在外科完整切除窦道后测量［4］，但考虑到伦理要求和实际处理情况，不能为了测量而切除所有患者的窦道型慢性创面。研究显示CT造影及三维重建对创面的范围和形状有一定的判断价值，还可以明确其与周围组织器官的关系［13, 14, 15, 16, 17］，因此本研究选用了CT造影检查后三维重建来获得窦道的长度及形态，以做参考。随着硬性内镜的普及和成本的降低［18, 19］，本课题组在前期研究中将其引入窦道型慢性创面的诊治研究中，以获得窦道型慢性创面内部病理特征。将硬性内镜从窦道型慢性创面体表的伤口伸入窦道，可以清晰地观察到部分窦道型慢性创面的内部病理特征，包括渗出情况、有无异物、有无坏死组织及纤维增生等情况。
在前期研究的基础上，本课题组引入了一种能控制前端弯曲的软性内镜，在CT造影检查的配合下，希望可以利用其获得所有窦道型慢性创面的窦道有效长度、形态及内部病理特征。为了消除个体差异和主观偏倚，最大限度地提高统计效率［20］，本研究比较了同一个窦道型慢性创面通过硬性内镜和软性内镜检查测得的长度偏差率。本课题组前期研究已经证实硬性内镜测量的长度偏差率优于传统的探针测量［2］，所以如果软性内镜检查测得的长度偏差率优于硬性内镜，那么则可以说明软性内镜更适合用于窦道型慢性创面的诊疗。CT造影及三维重建检查结果显示，本组窦道型慢性创面可分为I型管状、L型管状、Y型管状、片状、棒槌状及不规则状，其中窦道路径表现出明显弯曲的占32.6%。本课题组观察到在曲线组窦道型慢性创面中，软性内镜检查测得的长度偏差率明显低于硬性内镜，进一步分析得知，软性内镜检查测得的长度偏差率与CT造影及三维重建所得相近，这说明软性内镜基本可以充分观察到弯曲型窦道型慢性创面的内部情况。在直线组窦道型慢性创面中，软性内镜、硬性内镜及CT造影检查所得的长度偏差率均为0，这说明硬性内镜及软性内镜均可以充分观察到直线型窦道型慢性创面的内部情况。
需要指出的是，虽然本研究结果证实软性内镜在窦道型慢性创面的测量和观察方面具有优势，有望成为窦道型慢性创面诊断和治疗的有效手段；但目前我国软性内镜相关市场几乎被国外内镜公司垄断［21］，导致软性内镜价格普遍高于硬性内镜，这可能不利于软性内镜在基层医院的推广和使用。软性内镜及硬性内镜在直线型窦道型慢性创面内部病理特征的观察方面无明显差异，此类创面可以选用成本较低的硬性内镜作为诊疗工具。对于弯曲型窦道型慢性创面，如无软性内镜条件，建议到上级医院检查，否则可能延误治疗。
综上所述，软性内镜在窦道型慢性创面的临床检查中能更大范围地观察窦道内部特征，尤其对于弯曲型窦道的探查具有明显优势，这种方法的推广将有利于窦道型慢性创面的诊断及治疗。本研究也存在一定的局限性，首先样本量较小，其次没有进行前瞻性研究，下一步本课题组将进行大样本、多中心的临床研究，以进一步说明软性内镜在窦道型慢性创面诊疗中的优势。此外，本研究仅提供了窦道型慢性创面窦道长度、形态及可视范围的相关诊断方法，此类创面的其他诊断内容，包括超声诊断、病理诊断等有待进一步研究。
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参考文献
(0) 期刊类型引用(10)
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