Effects and mechanisms of allogeneic epidermal stem cells on the survival of allogeneic full-thickness skin grafts in nude mice with full-thickness skin defect wounds
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摘要:
目的 探讨异体表皮干细胞（ESC）对裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮成活的影响及其机制。 方法 采用实验研究方法。采用酶消化法从1只4周龄雄性BALB/c-NU裸鼠（品系、鼠龄与性别下同）中获取培养7 d呈铺路石状原代ESC，其第3代细胞经流式细胞仪鉴定阳性表达ESC标志物CD44且阴性表达CD45，经免疫荧光法鉴定阳性表达ESC标志物p63与整合素6α且阴性表达CD71。取对数生长期的第3代ESC进行后续实验。取26只裸鼠，采用随机数字表法平均分为磷酸盐缓冲液（PBS）组和ESC组，在每只裸鼠背部制备全层皮肤缺损创面后，2组创面分别喷涂等体积的PBS、ESC，创面上均移植从另外4只裸鼠背部切取制备的全厚皮。分别取2组10只裸鼠，观察术后0（即刻）、3、7、14、21 d创面愈合与皮片存活情况并计算术后3、7、14、21 d皮片存活比和皮片收缩率（样本数为各时间点存活皮片数），采用激光散斑血流成像仪检测术后3、7、14 d皮片的血流灌注情况并计算各时间点ESC组与PBS组裸鼠皮片血流灌注比（样本数为各时间点2组配对均存活皮片对数）；分别取2组剩余3只裸鼠，取术后7 d皮片组织，分别采用实时荧光定量反转录PCR法和蛋白质印迹法检测组织中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素8（IL-8）、IL-10、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原与基质金属蛋白酶9（MMP-9）的mRNA和蛋白表达。对数据行Log-rank检验、重复测量方差分析、单因素方差分析、独立样本t检验与Bonferroni校正。 结果 以术后0 d情况为参照，2组裸鼠术后3、7、14、21 d创面逐渐愈合，皮片收缩情况逐渐明显，其中PBS组裸鼠创面收缩愈合情况较ESC组明显。术后3 d，ESC组1只裸鼠皮片移植失败，PBS组3只裸鼠皮片移植失败；术后7 d，PBS组又有1只裸鼠皮片移植失败。2组裸鼠术后3、7、14、21 d皮片存活比相近（P>0.05）。术后3、7、14、21 d，ESC组裸鼠皮片收缩率分别为（9.2±0.4）%、（19.7±1.2）%、（53.6±3.5）%、（62.2±5.1）%，显著低于PBS组的（11.0±0.9）%、（47.8±2.8）%、（86.1±7.1）%、（89.7±9.0）%（t=5.719、26.650、11.940、7.617，P<0.01）。术后3、7、14 d，2组裸鼠皮片均有血流灌注信号；ESC组与PBS组裸鼠皮片血流灌注比均值均大于1，3个时间点总体比较，差异无统计学意义（P>0.05）。术后7 d，与PBS组比较，ESC组裸鼠皮片组织中TNF-α、IL-8、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA（t=2.823、2.934、2.845、2.860，P<0.05）和蛋白表达均明显降低，IL-10和MMP-9的mRNA（t=3.877、2.916，P<0.05）和蛋白表达均明显升高。 结论 异体ESC可减轻裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮片收缩，促进移植皮片与创面之间新生血管的形成，减轻炎症反应，降低胶原蛋白表达，促进MMP-9的表达，从而提高移植皮片的成活质量。 Abstract:Objective To investigate the effects and mechanisms of allogeneic epidermal stem cells (ESCs) on the survival of allogeneic full-thickness skin grafts in nude mice with full-thickness skin defect wounds. Methods Experimental research methods were applied. Primary ESCs that appeared paving stone-like after being cultured for 7 d were obtained by enzymatic digestion method from one 4-week-old male BALB/c-NU nude mouse (the same strain, age, and sex below). The cells of third passage were identified by flow cytometry to positively express ESC marker CD44 and negatively express CD45, meanwhile, the positive expression of ESC markers of p63 and integrin 6α, and negative expression of CD71 were identified by immunofluorescence method. The ESCs of third passage in the logarithmic growth phase were used for the following experiments. Twenty-six nude mice were equally divided into phosphate buffered saline (PBS) group and ESCs group according to the random number table. A full-thickness skin defect wound was made on the back of each nude mouse, and then the wounds of the two groups were sprayed with equal volumes of PBS and ESCs, respectively. The wounds were transplanted with full-thickness skin grafts cut from the backs of 4 other nude mice. Each ten nude mice from the two groups were selected, the wound healing and skin survival on post surgery day (PSD) 0 (immediately), 3, 7, 14, and 21 were observed, and the survival ratio and shrinkage rate of skin grafts on PSD 3, 7, 14, and 21 were calculated (the number of sample was the number of surviving skin grafts at each time point); the blood perfusion in the skin grafts on PSD 3, 7, and 14 was detected by the laser speckle blood flow imager, and the blood flow ratio of nude mice skin grafts in ESCs group to PBS group at each time point was calculated (the number of sample was the pair number of surviving skin grafts in group pairing at each time point). The skin graft tissue of each 3 nude mice remained in the two groups were collected on PSD 7, and the mRNA expressions and protein expressions of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 8 (IL-8), IL-10, type Ⅰ collagen, type Ⅲ collagen, and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) in the tissue were detected by real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction and Western blotting, respectively. Data were statistically analyzed with Log-rank test, analysis of variance for repeated measurement, one-way analysis of variance, independent sample t test, and Bonferroni correction. Results Taking the condition on PSD 0 as a reference, the wounds of nude mice in the two groups healed gradually on PSD 3, 7, 14, and 21, and the shrinkage of skin grafts was gradually obvious. Among them, the shrinkage healing of wound of nude mice in PBS group was more significant than that in ESCs group. On PSD 3, the skin graft of 1 nude mouse failed in ESCs group, while the skin graft of 3 nude mice failed in PBS group. On PSD 7, the skin graft of another nude mouse failed in PBS group. The survival ratio of skin grafts of nude mice in the two groups was similar on PSD 3, 7, 14, and 21 (P>0.05). On PSD 3, 7, 14, and 21, the shrinkage rates of skin grafts of nude mice in ESCs group were (9.2±0.4)%, (19.7±1.2)%, (53.6±3.5)%, and (62.2±5.1)%, respectively, which was significantly lower than (11.0±0.9)%, (47.8±2.8)%, (86.1±7.1)%, and (89.7±9.0)% in PBS group (t=5.719, 26.650, 11.940, 7.617, P<0.01). On PSD 3, 7, and 14, blood perfusion signals were observed in the skin grafts of nude mice in the two groups. The average blood perfusion ratios of the skin grafts of nude mice in ESCs group to PBS group were greater than 1, and there was no statistically significant difference in the overall comparison of 3 time points (P>0.05). On PSD 7, compared with those of PBS group, the mRNA and protein expressions of TNF-α, IL-8, type Ⅰ collagen, and type Ⅲ collagen in the skin graft tissue of nude mice in ESCs group were significantly reduced, while the mRNA and protein expressions of IL-10 and MMP-9 in the skin graft tissue of nude mice in ESCs group were significantly increased (in mRNA comparison, t=2.823, 2.934, 2.845, 2.860, 3.877, 2.916, P<0.05). Conclusions Allogeneic ESCs can reduce the shrinkage of allogeneic full-thickness skin grafts transplanted on full-thickness skin defect wounds in nude mice, promote the formation of new blood vessels between the skin graft and the wound, reduce inflammation and collagen protein expression, and promote the expression of MMP-9, thus improving the survival quality of skin grafts. -
Key words:
- Stem cell transplantation /
- Skin transplantation /
- Wound healing /
- Epidermal stem cells
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创面若发生异常愈合可出现瘢痕挛缩而影响正常的皮肤功能和外观，因此寻找合适的创面治疗方式而避免异常愈合极为重要［1, 2, 3, 4］。对于全层皮肤损伤的患者，皮片移植是优先考虑的创面治疗方式。皮片移植可分为由表皮和部分真皮组成的刃厚皮移植（STSG）、由表皮和全层真皮组成的全厚皮移植（FTSG）。STSG能够在血管较少的移植部位存活，但因真皮成分较薄可能导致创面愈合后出现瘢痕和皮片挛缩。FTSG虽然不容易出现皮片挛缩，但创面需要有更好的血供才能保障较高的皮片成活率［5, 6, 7, 8, 9, 10］。
目前，有不少研究将干细胞用于治疗皮肤创伤。干细胞可以与复合材料联合使用，也可以直接应用于创面。干细胞的特征在于其多向分化能力和自我更新能力。不少实验对不同干细胞促进伤口愈合和组织再生的能力进行检测，结果显示干细胞可以修复细胞基质、减轻炎症、增加血管生成等，证明了干细胞的使用是安全并且有效的［11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19］。本课题组前期研究观察到，伤后7 d异体大鼠表皮干细胞（ESC）可以在大鼠全层皮肤缺损创面床中增殖和分化；并且，大鼠ESC能提高全层皮肤缺损创面愈合率，而其中的机制之一是ESC可促进创面新生血管的增加［20］。然而，ESC是否能影响皮片移植质量（包括血运情况和胶原形成情况等）从而影响创面愈合效果尚不清楚。本研究提取异体ESC应用于裸鼠全层皮肤缺损创面后移植异体全厚皮，探究ESC对皮片移植效果的影响，为临床实现用ESC治疗创面提供前期科学依据。
1. 材料与方法
本实验研究符合中山大学附属第一医院和国家关于动物实验的相关规定。
1.1 动物及主要试剂与仪器来源
31只4周龄无特殊病原体级健康雄性（体重12~15 g）BALB/c-NU裸鼠购于江苏集萃药康生物科技有限公司，许可证号：SCXK（苏）2018-0008。
青霉素、链霉素购于杭州弗德生物科技有限公司，PBS、KC SFM无血清培养基购于美国Gibco公司，即用型高浓度胰蛋白酶替代物Tryple购于美国Thermo Fisher Scientific公司，纤维连接蛋白、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购于美国Sigma公司，山羊血清购于上海碧云天生物技术有限公司，兔抗小鼠CD44多克隆抗体、兔抗小鼠CD45单克隆抗体、兔抗小鼠整合素6α单克隆抗体、大鼠抗小鼠p63多克隆抗体、大鼠抗小鼠CD71多克隆抗体、兔抗小鼠基质金属蛋白酶9（MMP-9）多克隆抗体、兔抗小鼠Ⅰ型胶原单克隆抗体、大鼠抗小鼠Ⅲ型胶原多克隆抗体、大鼠抗小鼠IL-10多克隆抗体、兔抗小鼠TNF-α多克隆抗体购于美国Abcam公司，兔抗小鼠IL-8单克隆抗体、Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体、Alexa Fluor 594标记的山羊抗鼠IgG抗体、兔抗小鼠GAPDH单克隆抗体购于美国Affinity公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体购于美国CST公司，抗荧光淬灭剂购于北京索莱宝科技有限公司，异氟烷购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司，宝生物染料法荧光定量试剂盒购于日本TaKaRa公司。
细胞分选仪购于广州市麦施缔医疗科技有限公司，HERAcell 150i型二氧化碳培养箱购于美国Thermo Fisher Scientific公司，BDS-200型倒置相差显微镜购于重庆奥特光学仪器有限责任公司，CytoFLEX型流式细胞仪购于美国Beckman Coulter Gallios公司，LEXT OLS4500型激光扫描共聚焦显微镜购于日本Olympus公司，SpectraMax i3型多功能酶标仪购于美国SpectraMax公司，PeriCam PSI型激光散斑血流成像仪购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司，电泳仪、凝胶成像分析系统购于美国BioRad公司。
1.2 ESC的分离培养和鉴定
取1只裸鼠，颈椎脱臼处死后切取背部全层皮肤，置于加入100万U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素（浓度下同）的PBS中。去除皮肤肌肉及脂肪，将皮肤剪成1 cm×1 cm大小后置于细胞分选仪中，加入2 mL即用型高浓度Tryple消化15 min。将消化得到的基底细胞悬液加入用0.5 mg/mL纤维连接蛋白溶液以约5 μg/cm2包被的培养瓶中，于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱内静置20 min。加入含青霉素、链霉素的KC SFM无血清培养基培养（培养基下同），200倍倒置相差显微镜下观察培养3、7 d细胞状态。每2~3天换液1次，待细胞生长至70%融合时，进行消化传代。采用流式细胞仪检测第3代细胞（浓度5×106个/mL）CD44、CD45表面抗原标记（采用兔抗小鼠CD44多克隆抗体、兔抗小鼠CD45单克隆抗体，稀释比均为1∶200），当CD44百分比>90%，CD45百分比<5%时，提示培养的细胞为ESC。本鉴定实验重复3次。
另采用免疫荧光法鉴定种子细胞。将分离培养的第3代裸鼠细胞消化、PBS重新悬浮（细胞浓度为1×105个/mL），培养于玻底直径15 mm的玻底细胞培养皿。待细胞贴壁后，40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，用含体积分数10%山羊血清的PBS室温封闭1 h。分别同时滴加兔抗小鼠整合素6α单克隆一抗和大鼠抗小鼠p63多克隆一抗（稀释比均为1∶100）或者兔抗小鼠整合素6α单克隆一抗和大鼠抗小鼠CD71多克隆一抗（稀释比均为1∶100），4 ℃下孵育过夜。针对整合素6α加入Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗，针对p63和CD71加入Alexa Fluor 594标记的山羊抗鼠IgG二抗（稀释比均为1∶200），室温孵育1 h。DAPI共染，激光扫描共聚焦显微镜下观察p63、整合素6α和CD71的定位及表达情况。细胞同时阳性表达p63、整合素6α，且阴性表达CD71则提示为ESC。将对数生长期的第3代裸鼠ESC用于后续实验。
1.3 裸鼠分组与处理
取4只裸鼠，颈椎脱臼处死，取乙醇消毒后的背部全层皮肤，去除皮肤肌肉及脂肪，切成1 cm×1 cm大小皮片，无菌生理盐水冲洗3次，将纱条于生理盐水中浸湿后包裹皮片，暂于4 ℃保存。消化第3代裸鼠ESC，PBS重新悬浮至细胞浓度为1×105个/mL，暂于4 ℃保存。另取26只裸鼠，采用随机数字表法平均分为PBS组和ESC组。以异氟烷麻醉裸鼠，调节空气泵使输出的气体流量为300~500 mL/min，以体积分数为3.0%~4.0%的异氟烷诱导麻醉，维持体积分数为1.0%~1.5%，直到手术结束。裸鼠背部乙醇消毒，在每只裸鼠背部切开制备1个1 cm×1 cm大小全层皮肤缺损创面。伤后即刻，于ESC组裸鼠创面喷涂前述制备好的裸鼠ESC 1 mL，于PBS组裸鼠创面喷涂PBS 1 mL。将预制好的裸鼠皮片移植至创面（1个创面移植1块皮片），边缘缝合，内层垫凡士林纱布，创可贴包裹，外层自粘绷带包扎。
1.4 观测指标
1.4.1 大体情况和皮片存活与收缩情况
分别取2组10只裸鼠，于术后0（即刻）、3、7、14、21 d观察皮片大体情况，利用数码相机对皮片进行拍照，用Image Pro图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）进行分析，计算术后3、7、14、21 d皮片成活比和皮片收缩率。以血运良好，皮肤弹性及皮温可，无缺血坏死为植皮成活判定标准，皮片存活比=存活皮片数÷总皮片数。皮片收缩率（%）=（术后0 d皮片面积-术后各时间点皮片面积）÷术后0 d皮片面积×100%。
1.4.2 皮片血流灌注情况
术后3、7、14 d，取1.4.1行大体观察后裸鼠同前采用异氟烷进行麻醉，用激光散斑血流成像仪分别检测2组裸鼠皮片的血流灌注情况。裸鼠始终放置于40 ℃恒温电热毯上并且尽量保证每只裸鼠检测时的麻醉时长一致，以减少温度变化和麻醉时间对测量血流灌注造成的偏差。检测完成后，采用成像仪附带软件包PIMSoft获取、分析和报告血流灌注相对值。皮片的血流灌注情况直观观察：红色代表血流灌注多，黄色次之，蓝色代表血流灌注少。将2组10只裸鼠两两配对，计算术后3、7、14 d ESC组与PBS组裸鼠皮片血流灌注比，即ESC组裸鼠皮片血流灌注相对值÷PBS组裸鼠皮片血流灌注相对值，只针对2组配对均存活的皮片进行计算。
1.4.3 炎症因子及胶原蛋白相关因子表达
1.4.3 .1 mRNA表达
采用实时荧光定量RT-PCR法检测。分别取2组剩余3只裸鼠，于术后7 d同前采用异氟烷进行麻醉，取每只大鼠0.5 cm×0.5 cm大小皮片组织。取部分组织，常规提取样本总RNA、合成互补DNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及产物大小见表1。采用宝生物染料法荧光定量试剂盒及Mx3000P实时PCR系统（美国CA公司）检测TNF-α、IL-8、IL-10、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-9、GAPDH的mRNA表达情况。以GAPDH为内参照，采用Δ循环阈值（Ct）法，即2-ΔΔCt处理结果。本实验重复3次，结果取均值。
表1 实时荧光定量反转录PCR法检测裸鼠皮片组织炎症因子及胶原蛋白相关因子mRNA表达的引物序列及产物大小基因名称 引物序列（5′→3′） 产物大小（bp） 肿瘤坏死因子α 上游：CATCCGTTCTCTACCCAGCC 221 下游：AATTCTGAGCCCGGAGTTGG 白细胞介素8 上游：TCCACTCCCAGCATCGTAGA 128 下游：CAGAGTAAAGGGCGGGTCAG 白细胞介素10 上游：CTTCGGCCCAGTGAAGAGTT 112 下游：TGGAGCTTGCTAAAGGCACT 基质金属蛋白酶9 上游：CGCCAACTATGACCAGGATA 224 下游：GTTGCCCCCCCAGTTACAGT Ⅰ型胶原 上游：GTACATCAGCCCAAACCCCA 221 下游：CAGGATCGGAACCTTCGCTT Ⅲ型胶原 上游：ATATGTGTCTGCGACTCGGG 208 下游：GGGCAGTCTAGTGGCTCATC 3-磷酸甘油醛脱氢酶 上游：AGACAGCCGCATCTTCTTGT 141 下游：TGATGGCAACAATGTCCACT 1.4.3 .2 蛋白表达
采用蛋白质印迹法检测。取1.4.3.1剩余皮片组织，常规提取样本总蛋白、检测浓度。取30 μg蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜，50 g/L脱脂奶粉溶液室温下封闭1 h。分别加入大鼠抗小鼠IL-10多克隆一抗、兔抗小鼠TNF-α多克隆一抗、兔抗小鼠IL-8单克隆一抗、兔抗小鼠MMP-9多克隆一抗、兔抗小鼠Ⅰ型胶原单克隆一抗、大鼠抗小鼠Ⅲ型胶原多克隆一抗、兔抗小鼠GAPDH单克隆一抗（稀释比均为1∶1 000），4 ℃下孵育过夜。分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗（稀释比1∶5 000），室温下孵育1 h。化学发光检测免疫反应条带，采用Image J图像分析软件（美国国立卫生研究院）行灰度分析，以GAPDH为内参照，观察TNF-α、IL-8、IL-10、MMP-9、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达。
1.5 统计学处理
采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析，采用GraphPad Prism 8制图软件绘图。计数资料数据以频数表示，采用Kaplan-Merier法描绘裸鼠皮片成活曲线并行组间Log-rank检验（软件自动略去该统计量值）。计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 ESC生长状态及鉴定
从裸鼠皮肤分离的原代细胞培养3 d，可见细胞已形成细胞克隆群，贴壁牢固；培养7 d，细胞明显增殖加速，细胞连接成片状，呈铺路石状。见图1。从裸鼠皮肤分离的第3代细胞，经流式细胞仪鉴定显示，CD44的百分比为（96.7±1.4）%，CD45的百分比为（0.77±0.05）%；经免疫荧光法鉴定可见培养2 d，细胞阳性表达p63与整合素6α，阴性表达CD71，见图2。综上，提取的裸鼠皮肤细胞为ESC。
2 免疫荧光法检测裸鼠第3代表皮干细胞培养2 d相应标志物表达 Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 594-4',6-二脒基-2-苯基吲哚，图中标尺为10 μm。2A、2B、2C、2D.分别为细胞核染色、p63染色、整合素6α染色、细胞核及p63与整合素6α染色重叠图片，p63与整合素6α均呈阳性表达；2E、2F、2G、2H.分别为细胞核染色、CD71染色、整合素6α染色、细胞核及CD71与整合素6α染色重叠图片，CD71呈阴性表达，整合素6α呈阳性表达注：细胞核阳性染色为蓝色，p63与CD71阳性染色为红色，整合素6α阳性染色为绿色2.2 大体情况及皮片存活与收缩情况
除去皮片未成活的裸鼠，以术后0 d情况为参照，术后3 d，2组裸鼠皮片均贴合良好，未见明显血肿及水疱，皮片均无明显收缩；术后7 d，PBS组裸鼠皮片出现较明显收缩，而ESC组裸鼠皮片收缩不明显；术后14 d，2组裸鼠创面已基本愈合，见少量痂皮覆盖，皮片收缩均较之前更为明显，其中PBS组裸鼠皮片收缩更明显；术后21 d，2组裸鼠创面完全愈合，皮片颜色与正常皮肤相近，PBS组裸鼠创面收缩愈合情况仍较ESC组明显。见图3。
3 2组裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后各时间点创面大体观察。3A、3B、3C、3D、3E.分别为磷酸盐缓冲液组术后0、3、7、14、21 d创面情况，创面逐渐缩小，收缩愈合明显；3F、3G、3H、3I、3J.分别为表皮干细胞组术后0、3、7、14、21 d创面情况，收缩愈合较不明显，图3F、3G分别与图3A、3B相近，图3H、3I、3J收缩情况分别弱于图3C、3D、3E术后3 d，ESC组1只裸鼠皮片移植失败，PBS组3只裸鼠皮片移植失败。术后7~21 d ESC组裸鼠皮片存活良好；术后7 d PBS组又1只裸鼠皮片移植失败，术后14、21 d PBS组裸鼠皮片存活良好。2组裸鼠术后3、7、14、21 d皮片存活比总体比较，差异无统计学意义（P=0.134），见图4。术后3、7、14、21 d，PBS组裸鼠的皮片收缩率均明显高于ESC组（P<0.01），见表2。
4 2组各10只裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后各时间点皮片存活比注：红色为表皮干细胞（ESC）组，蓝色为磷酸盐缓冲液（PBS）组；术后3 d，ESC组1只裸鼠皮片坏死，PBS组3只裸鼠皮片坏死表2 2组裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后各时间点皮片收缩率（%，组别 3 d 7 d 14 d 21 d ESC组 9.2±0.4 19.7±1.2 53.6±3.5 62.2±5.1 PBS组 11.0±0.9 47.8±2.8 86.1±7.1 89.7±9.0 t值 5.719 26.650 11.940 7.617 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：表皮干细胞（ESC）组术后各时间点样本数均为9，磷酸盐缓冲液（PBS）组术后3 d样本数为7、术后7~21 d样本数均为6；处理因素主效应，F=388.99，P<0.001；时间因素主效应，F=741.51，P<0.001；两者交互作用，F=37.49，P<0.001 2.3 皮片血流灌注情况
术后3、7、14 d，2组裸鼠的皮片均显示出血流灌注信号，见图5。术后3、7、14 d，ESC组与PBS组裸鼠皮片血流灌注比分别为1.2±0.4、1.3±0.4、1.4±0.5，均值均大于1，3个时间点总体比较，差异无统计学意义（F=0.182，P=0.836）。
5 2组裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后各时间点皮片血流灌注情况。5A、5B、5C.分别为磷酸盐缓冲液组术后3、7、14 d皮片血流灌注情况，各时间点均有血流灌注；5D、5E、5F.分别为表皮干细胞组术后3、7、14 d皮片血流灌注情况，分别较图5A、5B、5C血流灌注明显注：红色代表血流灌注多，黄色次之，蓝色代表血流灌注少2.4 皮片组织炎症情况
术后7 d，ESC组裸鼠皮片组织中TNF-α和IL-8的mRNA表达量分别为0.42±0.18、0.41±0.18，明显低于PBS组的1.19±0.34、1.32±0.40（t=2.823、2.934，P=0.048、0.043）；IL-10的mRNA表达量为3.13±0.71，明显高于PBS组的1.03±0.29（t=3.877，P=0.018）。术后7 d，与PBS组比较，ESC组裸鼠皮片组织中TNF-α和IL-8的蛋白表达均明显降低，IL-10的蛋白表达明显升高，见图 6。
6 蛋白质印迹法检测2组裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后7 d皮片组织中炎症因子的蛋白表达注：TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL为白细胞介素，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；1为磷酸盐缓冲液组，2为表皮干细胞组2.5 皮片组织胶原蛋白相关因子表达情况
术后7 d，ESC组裸鼠皮片组织中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA表达量分别为0.73±0.09、0.75±0.11，明显低于PBS组的1.15±0.19、1.09±0.17（t=2.845、2.860，P=0.047、0.046）；而MMP-9的mRNA表达量为1.44±0.35，明显高于PBS组的0.88±0.20（t=2.916，P=0.043）。术后7 d，与PBS组比较，ESC组裸鼠皮片组织中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达明显下降，而MMP-9的蛋白表达明显升高，见图7。
7 蛋白质印迹法检测2组裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后7 d皮片组织中胶原蛋白相关因子的蛋白表达注：MMP-9为基质金属蛋白酶9，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；1为磷酸盐缓冲液组，2为表皮干细胞组3. 讨论
目前，越来越多的研究将干细胞用于创面治疗并取得了一定的成效［21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28］。ESC作为皮肤组织特异性干细胞，与皮肤的修复有着密切关系。表皮基底细胞含有1%~10%的ESC。有研究表明，自体基底细胞悬液可通过促进取皮区再上皮化从而促进创面愈合，在治疗慢性创面时，STSG联合喷涂自体基底细胞悬液可提高皮片成活率和增加皮片愈合质量［29, 30, 31, 32, 33］。因此，进一步开展ESC对皮片愈合质量影响的研究具有应用前景。
本研究中，通过即用型高浓度Tryple快速消化及纤维连接蛋白吸附的方法分离提取并鉴定了裸鼠的ESC。随后制作裸鼠背部全层皮肤缺损创面，予以全厚皮植皮治疗，ESC组的裸鼠创面喷涂了约1×105个异体ESC。对比皮片存活情况，ESC组仅1只裸鼠的皮片移植失败，而PBS组出现了4只裸鼠的皮片移植失败，但2组裸鼠各时间点皮片存活比总体比较，差异无统计学意义（P>0.05），这可能与本研究样本量较小有关。根据大体图片对比2组裸鼠皮片收缩情况可见，从术后7 d起，ESC组裸鼠的皮片收缩明显弱于PBS组，说明ESC能够提高皮片成活的质量，而其中的原因可能与创面床和移植皮片间血运的建立有关。因此本研究进行进一步的皮片血流灌注检测，结果提示，术后3 d起皮片移植成功的裸鼠植皮区均已出现新生血管，并且ESC组裸鼠皮片在术后3、7、14 d的血运情况好于PBS组。由此，本研究得出，ESC提高移植皮片成活质量与促进创面床和移植皮片间新生血管的形成有关。进一步分析皮片组织炎症情况显示，相比PBS组，ESC组裸鼠术后7 d时促炎性细胞因子TNF-α和IL-8的mRNA与蛋白表达均明显降低，而抗炎性细胞因子IL-10的mRNA与蛋白表达明显升高，说明ESC在植皮成活过程中可降低炎症反应。在植皮区胶原蛋白的表达上，本研究显示ESC在术后7 d可降低胶原蛋白的形成，从而提高皮片移植后的愈合质量。此外，MMP-9的上升可促进创面细胞的迁移，并且可水解变性胶原，调控ECM的动态平衡，有利于创面的愈合。本研究显示，相比PBS组，ESC组裸鼠术后7 d时MMP-9的mRNA与蛋白表达水平均明显升高，说明ESC可通过提高MMP-9的表达提升皮片移植后的成活质量。
综上所述，本研究表明异体裸鼠的ESC可以通过促进创面床与移植皮片间血供的建立，降低炎症反应和胶原蛋白表达，促进MMP-9的表达，从而促进裸鼠全层皮肤缺损创面移植的异体全厚皮片成活后的质量。该结论为ESC促进移植皮片成活提供了一定的理论基础，为临床上治疗全层皮肤缺损创面提供了新的思路。
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参考文献
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2 免疫荧光法检测裸鼠第3代表皮干细胞培养2 d相应标志物表达 Alexa Fluor 488-Alexa Fluor 594-4',6-二脒基-2-苯基吲哚，图中标尺为10 μm。2A、2B、2C、2D.分别为细胞核染色、p63染色、整合素6α染色、细胞核及p63与整合素6α染色重叠图片，p63与整合素6α均呈阳性表达；2E、2F、2G、2H.分别为细胞核染色、CD71染色、整合素6α染色、细胞核及CD71与整合素6α染色重叠图片，CD71呈阴性表达，整合素6α呈阳性表达
注：细胞核阳性染色为蓝色，p63与CD71阳性染色为红色，整合素6α阳性染色为绿色
3 2组裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后各时间点创面大体观察。3A、3B、3C、3D、3E.分别为磷酸盐缓冲液组术后0、3、7、14、21 d创面情况，创面逐渐缩小，收缩愈合明显；3F、3G、3H、3I、3J.分别为表皮干细胞组术后0、3、7、14、21 d创面情况，收缩愈合较不明显，图3F、3G分别与图3A、3B相近，图3H、3I、3J收缩情况分别弱于图3C、3D、3E
4 2组各10只裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后各时间点皮片存活比
注：红色为表皮干细胞（ESC）组，蓝色为磷酸盐缓冲液（PBS）组；术后3 d，ESC组1只裸鼠皮片坏死，PBS组3只裸鼠皮片坏死
5 2组裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后各时间点皮片血流灌注情况。5A、5B、5C.分别为磷酸盐缓冲液组术后3、7、14 d皮片血流灌注情况，各时间点均有血流灌注；5D、5E、5F.分别为表皮干细胞组术后3、7、14 d皮片血流灌注情况，分别较图5A、5B、5C血流灌注明显
注：红色代表血流灌注多，黄色次之，蓝色代表血流灌注少
6 蛋白质印迹法检测2组裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后7 d皮片组织中炎症因子的蛋白表达
注：TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL为白细胞介素，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；1为磷酸盐缓冲液组，2为表皮干细胞组
7 蛋白质印迹法检测2组裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后7 d皮片组织中胶原蛋白相关因子的蛋白表达
注：MMP-9为基质金属蛋白酶9，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；1为磷酸盐缓冲液组，2为表皮干细胞组
表1 实时荧光定量反转录PCR法检测裸鼠皮片组织炎症因子及胶原蛋白相关因子mRNA表达的引物序列及产物大小
基因名称 引物序列（5′→3′） 产物大小（bp） 肿瘤坏死因子α 上游：CATCCGTTCTCTACCCAGCC 221 下游：AATTCTGAGCCCGGAGTTGG 白细胞介素8 上游：TCCACTCCCAGCATCGTAGA 128 下游：CAGAGTAAAGGGCGGGTCAG 白细胞介素10 上游：CTTCGGCCCAGTGAAGAGTT 112 下游：TGGAGCTTGCTAAAGGCACT 基质金属蛋白酶9 上游：CGCCAACTATGACCAGGATA 224 下游：GTTGCCCCCCCAGTTACAGT Ⅰ型胶原 上游：GTACATCAGCCCAAACCCCA 221 下游：CAGGATCGGAACCTTCGCTT Ⅲ型胶原 上游：ATATGTGTCTGCGACTCGGG 208 下游：GGGCAGTCTAGTGGCTCATC 3-磷酸甘油醛脱氢酶 上游：AGACAGCCGCATCTTCTTGT 141 下游：TGATGGCAACAATGTCCACT 
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表2 2组裸鼠全层皮肤缺损创面移植异体全厚皮术后各时间点皮片收缩率（%，
组别 3 d 7 d 14 d 21 d ESC组 9.2±0.4 19.7±1.2 53.6±3.5 62.2±5.1 PBS组 11.0±0.9 47.8±2.8 86.1±7.1 89.7±9.0 t值 5.719 26.650 11.940 7.617 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：表皮干细胞（ESC）组术后各时间点样本数均为9，磷酸盐缓冲液（PBS）组术后3 d样本数为7、术后7~21 d样本数均为6；处理因素主效应，F=388.99，P<0.001；时间因素主效应，F=741.51，P<0.001；两者交互作用，F=37.49，P<0.001
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