Effects of three-dimensional bioprinting antibacterial hydrogel on full-thickness skin defect wounds in rats
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摘要:
目的 探讨三维生物打印负载纳米银的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面的作用。 方法 采用实验研究方法。采用扫描电子显微镜观察不同质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒的形态、粒径、分布和含不同终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶的孔隙结构，并计算孔径大小。处理1、3、7、14 d，采用质谱仪检测含终质量分数15% GelMA和终质量浓度10 mg/L纳米银的水凝胶的纳米银释放浓度。培养24 h，检测含终质量浓度0（无纳米银）、25、50、100 mg/L纳米银的GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌圈直径。取浙江大学医学院附属第二医院泌尿外科2020年7月收治的1名健康5岁男童包皮环切术后废弃包皮和该院整形外科2020年7月收治的1名健康23岁女性抽脂手术后废弃脂肪，采用酶解法分别提取成纤维细胞（Fb）和脂肪干细胞（ASC）。将Fb分为仅有培养基的空白对照组和另加入含相应终质量浓度纳米银溶液的2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组、10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组、50 mg/L纳米银组，培养48 h，采用细胞计数试剂盒8检测Fb增殖活性。将Fb分为进行相应处理的0 mg/L含银GelMA水凝胶组、10 mg/L含银GelMA水凝胶组、50 mg/L含银GelMA水凝胶组、100 mg/L含银GelMA水凝胶组，于培养1、3、7 d，同前检测Fb增殖活性。将ASC与GelMA水凝胶混合种植，分为三维生物打印组和非打印组，于培养1、3、7 d，同前检测ASC增殖活性并行活/死细胞荧光染色观察ASC生长情况。以上实验中样本数均为3。于18只雄性4~6周龄SD大鼠背部各制作4个全层皮肤缺损创面，分别设为单纯水凝胶组、水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组、水凝胶支架/纳米银/ASC组并移植相应支架。分别于伤后4、7、14、21 d，行大体观察并计算创面愈合率（样本数为6）；于伤后7、14 d，对创面行苏木精-伊红染色观察组织病理学改变（样本数为6）；于伤后21 d，对创面行Masson染色观察胶原排列情况（样本数为3）。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析、Bonferroni校正、独立样本t检验。 结果 不同质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒均呈圆形，散在分布，粒径均匀。含不同终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶都呈现大小不一且相互连通的孔隙结构。含终质量分数10% GelMA的含银GelMA水凝胶的孔径明显大于含终质量分数15%和20% GelMA的含银GelMA水凝胶（P值均<0.05）。处理1、3、7 d，含银GelMA水凝胶的体外纳米银释放浓度的变化趋势相对平缓；处理14 d，其体外纳米银释放浓度迅速增加。培养24 h，含0、25、50、100 mg/L纳米银的GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌圈直径分别为0、0、0.7、2.1 mm和0、1.4、3.2、3.3 mm。培养48 h，2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组Fb的增殖活性均明显高于空白对照组（P<0.05），10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组、50 mg/L纳米银组Fb的增殖活性均明显低于空白对照组（P<0.05）。与0 mg/L含银GelMA水凝胶组相比，培养1 d，50 mg/L含银GelMA水凝胶组、100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性均明显降低（P<0.05）；培养3 d，50 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显升高（P<0.05），100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显降低（P<0.05）；培养7 d，100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显降低（P<0.05）。培养1 d，三维生物打印组的ASC增殖活性与非打印组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；培养3、7 d，三维生物打印组的ASC增殖活性均明显高于非打印组（t值分别为21.50、12.95，P<0.05）。培养1 d，三维生物打印组死亡ASC数略多于非打印组。培养3、5 d，三维生物打印组和非打印组中的绝大多数ASC为活细胞。伤后4 d，单纯水凝胶组和水凝胶/纳米银组大鼠创面渗液较多，水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面干燥且未见明显感染迹象。伤后7 d，单纯水凝胶组和水凝胶/纳米银组大鼠创面仍有少量渗液，水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面干燥结痂。伤后14 d，4组大鼠创面上的水凝胶均脱落。伤后21 d，仅单纯水凝胶组仍有少量创面未愈合。伤后4、7 d，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率均明显高于其他3组（P<0.05）。伤后14 d，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率明显高于水凝胶/纳米银组和单纯水凝胶组（P值均<0.05）。伤后21 d，单纯水凝胶组大鼠创面愈合率明显低于水凝胶支架/纳米银/ASC组（P<0.05）。伤后7 d，4组大鼠创面上的水凝胶均保持在位；伤后14 d，单纯水凝胶组大鼠的水凝胶已与创面脱离，而其余3组仍有部分水凝胶存在于创面新生组织中。伤后21 d，单纯水凝胶组大鼠创面胶原排列无序，而水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组、水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面胶原排列相对有序。 结论 含银GelMA水凝胶具有良好的生物相容性及抗菌性能，其三维生物打印的双层结构能更好地与大鼠全层皮肤缺损创面新生组织相融合并促进创面愈合。 Abstract:Objective To explore the effects of three-dimensional (3D) bioprinting gelatin methacrylamide (GelMA) hydrogel loaded with nano silver on full-thickness skin defect wounds in rats. Methods The experimental research method was adopted. The morphology, particle diameter, and distribution of silver nanoparticles in nano silver solution with different mass concentrations and the pore structure of silver-containing GelMA hydrogel with different final mass fractions of GelMA were observed by scanning electron microscope and the pore size was calculated. On treatment day 1, 3, 7, and 14, the concentration of nano silver released from the hydrogel containing GelMA with final mass fraction of 15% and nano silver with final mass concentration of 10 mg/L was detected by mass spectrometer. At 24 h of culture, the diameters of inhibition zone of GelMA hydrogel containing final mass concentration of 0 (no nano silver), 25, 50, and 100 mg/L nano silver against Staphylococcus aureus and Escherichia coli were detected. Fibroblasts (Fbs) and adipose stem cells (ASCs) were isolated respectively by enzymatic digestion using the discarded prepuce after circumcision from a 5-year-old healthy boy who was treated in the Department of Urology of the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine in July 2020, and the discarded fat tissue after liposuction from a 23-year-old healthy woman who was treated in the Department of Plastic Surgery of the Hospital in July 2020. The Fbs were divided into blank control group (culture medium only), 2 mg/L nano sliver group, 5 mg/L nano sliver group, 10 mg/L nano sliver group, 25 mg/L nano sliver group, and 50 mg/L nano sliver group, which were added with the corresponding final mass concentrations of nano sliver solution, respectively. At 48 h of culture, the Fb proliferation viability was detected by cell counting kit 8 method. The Fbs were divided into 0 mg/L silver-containing GelMA hydrogel group, 10 mg/L silver-containing GelMA hydrogel group, 50 mg/L silver-containing GelMA hydrogel group, and 100 mg/L silver-containing GelMA hydrogel group and then were correspondingly treated. On culture day 1, 3, and 7, the Fb proliferation viability was detected as before. The ASCs were mixed into GelMA hydrogel and divided into 3D bioprinting group and non-printing group. On culture day 1, 3, and 7, the ASC proliferation viability was detected as before and cell growth was observed by live/dead cell fluorescence staining. The sample numbers in the above experiments were all 3. Four full-thickness skin defect wounds were produced on the back of 18 male Sprague-Dawley rats aged 4 to 6 weeks. The wounds were divided into hydrogel alone group, hydrogel/nano sliver group, hydrogel scaffold/nano sliver group, and hydrogel scaffold/nano sliver/ASC group, and transplanted with the corresponding scaffolds, respectively. On post injury day (PID) 4, 7, 14, and 21, the wound healing was observed and the wound healing rate was calculated (n=6). On PID 7 and 14, histopathological changes of wounds were observed by hematoxylin eosin staining (n=6). On PID 21, collagen deposition of wounds was observed by Masson staining (n=3). Data were statistically analyzed with one-way analysis of variance, analysis of variance for repeated measurement, Bonferroni correction, and independent sample t test. Results The sliver nano particles in nano silver solution with different mass concentrations were all round, in scattered distribution and uniform in size. The silver-containing GelMA hydrogels with different final mass fractions of GelMA all showed pore structures of different sizes and interconnections. The pore size of silver-containing GelMA hydrogel with 10% final mass fraction was significantly larger than that of silver-containing GelMA hydrogels with 15% and 20% final mass fractions (with P values both below 0.05). On treatment day 1, 3, and 7, the concentration of nano silver released from silver-containing GelMA hydrogel in vitro showed a relatively flat trend. On treatment day 14, the concentration of released nano silver in vitro increased rapidly. At 24 h of culture, the diameters of inhibition zone of GelMA hydrogel containing 0, 25, 50, and 100 mg/L nano silver against Staphylococcus aureus and Escherichia coli were 0, 0, 0.7, and 2.1 mm and 0, 1.4, 3.2, and 3.3 mm, respectively. At 48 h of culture, the proliferation activity of Fbs in 2 mg/L nano silver group and 5 mg/L nano silver group was both significantly higher than that in blank control group (P<0.05), and the proliferation activity of Fbs in 10 mg/L nano silver group, 25 mg/L nano silver group, and 50 mg/L nano silver group was all significantly lower than that in blank control group (P<0.05). Compared with the that of Fbs in 0 mg/L silver-containing GelMA hydrogel group, the proliferation activity of Fbs in 50 mg/L silver-containing GelMA hydrogel group and 100 mg/L silver-containing GelMA hydrogel group was all significantly decreased on culture day 1 (P<0.05); the proliferation activity of Fbs in 50 mg/L silver-containing GelMA hydrogel group was significantly increased (P<0.05), while the proliferation activity of Fbs in 100 mg/L silver-containing GelMA hydrogel group was significantly decreased on culture day 3 (P<0.05); the proliferation activity of Fbs in 100 mg/L silver-containing GelMA hydrogel group was significantly decreased on culture day 7 (P<0.05). The proliferation activity of ASCs in 3D bioprinting group show no statistically significant differences to that in non-printing group on culture day 1 (P>0.05). The proliferation activity of ASCs in 3D bioprinting group was significantly higher than that in non-printing group on culture day 3 and 7 (with t values of 21.50 and 12.95, respectively, P<0.05). On culture day 1, the number of dead ASCs in 3D bioprinting group was slightly more than that in non-printing group. On culture day 3 and 5, the majority of ASCs in 3D bioprinting group and non-printing group were living cells. On PID 4, the wounds of rats in hydrogel alone group and hydrogel/nano sliver group had more exudation, and the wounds of rats in hydrogel scaffold/nano sliver group and hydrogel scaffold/nano sliver/ASC group were dry without obvious signs of infection. On PID 7, there was still a small amount of exudation on the wounds of rats in hydrogel alone group and hydrogel/nano sliver group, while the wounds of rats in hydrogel scaffold/nano sliver group and hydrogel scaffold/nano sliver/ASC group were dry and scabbed. On PID 14, the hydrogels on the wound surface of rats in the four groups all fell off. On PID 21, a small area of wounds remained unhealed in hydrogel alone group. On PID 4 and 7, the wound healing rates of rats in hydrogel scaffold/nano sliver/ASC group were significantly higher than those of the other three groups (P<0.05). On PID 14, the wound healing rate of rats in hydrogel scaffold/nano sliver/ASC group was significantly higher than the wound healing rates in hydrogel alone group and hydrogel/nano sliver group (all P<0.05). On PID 21, the wound healing rate of rats in hydrogel alone group was significantly lower than that in hydrogel scaffold/nano sliver/ASC group (P<0.05). On PID 7, the hydrogels on the wound surface of rats in the four groups remained in place; on PID 14, the hydrogel in hydrogel alone group was separated from the wounds of rats, while some hydrogels still existed in the new tissue of the wounds of rats in the other three groups. On PID 21, the collagen arrangement in the wounds of rats in hydrogel alone group was out of order, while the collagen arrangement in the wounds of rats in hydrogel/nano sliver group, and hydrogel scaffold/nano sliver/ASC group was relatively orderly. Conclusions Silver-containing GelMA hydrogel has good biocompatibility and antibacterial properties. Its three-dimensional bioprinted double-layer structure can better integrate with new formed tissue in the full-thickness skin defect wounds in rats and promote wound healing. -
Key words:
- Bioprinting /
- Tissue engineering /
- Hydrogels /
- Nano silver /
- Wound repair
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(1)制备了负载银离子和脂肪干细胞的抗菌型水凝胶，对其进行了物理性能和生物学性能表征。
(2)根据该水凝胶的性质，基于三维生物打印技术制备了双层结构的抗菌型水凝胶，验证了该水凝胶可促进大鼠全层皮肤缺损创面愈合。
各种急慢因素导致的皮肤缺损是亟待解决的重要临床问题之一，水凝胶敷料为创面修复提供了新的治疗材料［1］。然而，水凝胶敷料的湿性环境可能有助于细菌生长［2］。纳米银作为一种高效的抗菌材料，具有抗菌谱广、耐药性低、安全性高等优良特点［3, 4, 5］。本研究团队在前期工作中将纳米银加入胶原/壳聚糖支架中，使该支架具有抗菌性能，从而控制创面炎症并促进创面有序修复［6］。
近年来，三维生物打印技术的快速发展为创面敷料及组织支架的制备提供了快速精准的方法［7, 8］。挤出式打印因成本相对较低，可选择的生物墨水种类较多，成为目前应用最广的打印技术［9］。生物墨水是指具有三维打印成形能力并包裹活细胞或者可用于包裹活细胞的生物材料［10, 11］。常见的生物墨水包括胶原、明胶和甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）等，GelMA具有可调节的生物和机械性能及快速成胶机制。本研究团队拟基于三维生物打印技术利用不同浓度的GelMA构建双层水凝胶结构，同时负载纳米银，以期获得具有抗菌性能的水凝胶，并将其应用于大鼠全层皮肤缺损创面，探索该水凝胶对创面修复的影响。
1. 材料与方法
本研究中动物实验通过浙江大学医学院附属第二医院动物伦理委员会批准，批号：2019-063号；细胞实验通过浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会批准，批号：审研2020-036。
1.1 动物、细胞、菌株及主要试剂与仪器来源
18只健康清洁级体重220~250 g的4~6周龄雄性SD大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。
纳米银溶液购自上海沪正纳米科技有限公司，GelMA由浙江大学高分子科学与工程系王利群教授实验室惠赠，高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Ⅰ型胶原酶购自美国Gibco公司，光交联剂购自日本TCI公司，细胞计数试剂盒8（CCK-8）购自上海碧云天生物技术有限公司，细胞活力（活死细胞染色）检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922购自美国模式培养物集存库公司。扫描电子显微镜购自德国Zeiss公司，光学显微镜及摄像系统、酶标仪购自日本Olympus公司，倒置荧光显微镜购于德国莱卡公司，Regenovo型三维生物打印机购自杭州捷诺飞生物科技股份有限公司，电感耦合等离子体质谱仪购自美国PerkinElmer公司，Pannoramic 250 FLASH Ⅲ型数字全景扫描仪购于匈牙利3DHISTECH公司。
1.2 纳米银和含银GelMA水凝胶的物理化学表征
1.2.1 纳米银颗粒的形态和粒径及分布
取10、50、100 mg/L的纳米银溶液各1滴，分别滴在盖玻片上，经60 ℃恒温干燥箱烘干后，分别在100 000、500 000倍扫描电子显微镜下观察纳米银颗粒的形态、粒径及分布。
1.2.2 含银GelMA水凝胶的孔隙结构
分别将蓝光照射交联（下同）后GelMA终质量分数为10%、15%、20%的含银GelMA水凝胶浸没于PBS中，水凝胶溶胀平衡后，用冷冻干燥机干燥24 h。于真空下将材料纵切面喷金后，在200倍扫描电子显微镜下观察孔隙微观结构并拍照记录，采用ImageJ 1.8图像分析软件（美国国立卫生研究院）计算孔径大小。样本数为3。
1.3 含银GelMA水凝胶的纳米银释放浓度测定
将0.2 mL 20 mg/L纳米银溶液与0.2 mL质量分数30% GelMA混匀后获得含终质量分数15% GelMA和终质量浓度10 mg/L纳米银的水凝胶，交联制成直径为15 mm、高度为2.0 mm的含银GelMA水凝胶。猪全层皮肤缺损创面愈合过程的前3周胶原酶含量为2 U/mL［12］。将上述含银GelMA水凝胶置于3 mL 2 U/mLⅠ型胶原酶溶液中，分别于处理1、3、7、14 d，取上清液，采用质谱仪检测纳米银释放浓度。样本数为3。
1.4 含银GelMA水凝胶的抗菌性测试
先将金黄色葡萄球菌ATCC 25923和大肠埃希菌ATCC 25922复苏，然后采用平板划线法将2种细菌分别接种于普通血琼脂平板后倒置于恒温细胞培养箱中，37 ℃培养24 h。分别将含终质量浓度0（无纳米银）、25、50、100 mg/L纳米银和质量分数15% GelMA的GelMA水凝胶平铺于前述血琼脂平板表面，培养24 h，观察并测量其抑菌圈的直径。样本数为3。
1.5 纳米银溶液的细胞毒性实验和含银GelMA水凝胶的生物相容性检测
1.5.1 原代Fb和脂肪干细胞（ASC）的提取与培养
取浙江大学医学院附属第二医院泌尿外科2020年7月收治的1名健康5岁男童包皮环切术后废弃包皮（经患儿父母同意）和该院整形外科2020年7月收治的1名健康23岁女性抽脂手术后废弃脂肪（经患者同意），采用酶解法分离提取Fb和ASC，均培养至第3~6代用于后续实验。
1.5.2 Fb加入纳米银溶液后的细胞增殖活性
将Fb以每孔5×104个的密度接种于48孔板中，分为空白对照组、2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组、10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组、50 mg/L纳米银组。空白对照组Fb仅采用高糖DMEM培养基培养，其余5组Fb分别采用含相应终质量浓度的纳米银的DMEM培养基培养。培养48 h，用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，以此表示Fb的增殖活性。样本数为3。
1.5.3 在含银GelMA水凝胶表面种植Fb后的细胞增殖活性
将Fb分为0 mg/L含银GelMA水凝胶组、10 mg/L含银GelMA水凝胶组、50 mg/L含银GelMA水凝胶组、100 mg/L含银GelMA水凝胶组，分别将160 μL的含0、10、50、100 mg/L纳米银的GelMA水凝胶加入至48孔板中，交联后，将Fb以每孔5×104个的密度接种于含银GelMA水凝胶上。分别于培养1、3、7 d，同1.5.2检测Fb的吸光度值，以此表示Fb的增殖活性。样本数为3。
1.5.4 ASC与GelMA水凝胶混合种植后的细胞增殖活性
将1×106个/mL ASC均匀混合于1 mL含质量分数10% GelMA的GelMA水凝胶中。将部分上述水凝胶以每孔160 μL加入至48孔板中，交联后，设为非打印组；部分上述水凝胶利用三维生物打印形成圆形网格状结构（直径15 mm、高度1.5 mm、孔径1.5 mm），打印完成并交联后移至48孔板中，设为三维生物打印组。分别于培养1、3、7 d，同1.5.2检测ASC的吸光度值，以此表示Fb的增殖活性。样本数为3。
1.5.5 ASC与GelMA水凝胶混合种植后的生物相容性
取GelMA水凝胶和ASC同1.5.4分组及处理，加入DMEM培养基培养5 d。分别于培养1、3、5 d，按细胞活力检测试剂盒说明书加入适量试剂，置于100倍倒置荧光显微镜下观察。活细胞显示为绿色荧光，死细胞显示为红色荧光。样本数为3。
1.6 4种三维生物打印GelMA支架的制备
取1.5×106个/mL ASC 1 mL与质量分数为15% GelMA水凝胶2 mL混匀，得到含5×105个/mL ASC及质量分数为10% GelMA的ASC/GelMA水凝胶。取200 mg/L纳米银溶液1 mL与质量分数为20%的GelMA 3 mL混匀，得到含50 mg/L纳米银及终质量分数15% GelMA的含银GelMA水凝胶。先将ASC/GelMA水凝胶注入三维生物打印机料筒中，打印圆形网格状结构。然后将含银GelMA水凝胶注入三维生物打印机料筒中，在圆形网格状结构上打印圆形实心结构（直径15 mm、高度0.5 mm），交联后，获得水凝胶支架/纳米银/ASC支架。参照上述方法，分别制备出下层为高度1.5 mm的含质量分数10% GelMA水凝胶实心结构、上层为高度0.5 mm的含质量分数15% GelMA水凝胶实心结构的单纯水凝胶支架，下层为高度1.5 mm的含质量分数10% GelMA水凝胶实心结构、上层为高度0.5 mm的纳米银为50 mg/L的含银GelMA水凝胶实心结构的水凝胶/纳米银支架，下层为高度1.5 mm的10% GelMA水凝胶网格状结构、上层为高度0.5 mm的纳米银为50 mg/L的含银GelMA水凝胶实心结构的水凝胶支架/纳米银支架。
1.7 三维生物打印抗菌型水凝胶支架对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响
1.7.1 模型制备及分组处理
将18只大鼠常规麻醉备皮，在脊柱两边对称位置制作4个直径为1.5 cm的圆形全层皮肤缺损创面，一边2个且相邻创面之间的最小间隔≥2 cm。以大鼠的头部朝向为上，将每只大鼠的左上方创面纳入单纯水凝胶组，右上方创面纳入水凝胶/纳米银组，左下方创面纳入水凝胶支架/纳米银组，右下方创面纳入水凝胶支架/纳米银/ASC组，每组18个创面，分别植入相应支架。创面消毒后包扎，单笼饲养，隔1~2 d换药。
1.7.2 创面大体情况和愈合率
选择6只大鼠分别于伤后4、7、14、21 d换药时，观察创面愈合情况并拍照。采用ImageJ图像分析软件测量创面面积，并计算创面愈合率。
1.7.3 创面组织病理学变化
分别于伤后7、14、21 d，将6只大鼠同前麻醉后，收集背部创面及距创缘0.5 cm内的组织。用40 g/L多聚甲醛固定创面组织48 h后，常规石蜡包埋、切片（厚度为6 μm）。取伤后7、14 d每组6张切片，常规行HE染色后，用数字全景扫描仪进行扫描，采用NDP图像分析软件（日本滨松光子学株式会社）观察并截取1.25、2.50倍镜下图片，观察组织病理学改变；另取伤后21 d每组3张切片，行Masson染色后，于200倍光学显微镜下观察胶原排列情况。
1.8 统计学处理
采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 纳米银颗粒的形态和粒径分布
不同质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒均呈圆形，散在分布，粒径均匀。纳米银颗粒的分布随着纳米银溶液浓度的升高而变得紧密。见图1。
1 3种质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒的形态。1A.100 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒散在分布 扫描电子显微镜×100 000；1B.50 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒分布较图1A稀疏 扫描电子显微镜×100 000；1C.10 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒分布较图1B更加稀疏 扫描电子显微镜×100 000；1D.10 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒呈圆形，粒径较均匀 扫描电子显微镜×500 0002.2 含银GelMA水凝胶的孔隙结构
含不同终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶都呈现大小不一且相互连通的孔隙结构，且孔隙壁随着质量分数的增加而增厚，见图2。含终质量分数10%、15%、20% GelMA的含银GelMA水凝胶孔径分别为（292±88）、（206±55）、（184±64）μm，总体比较，差异有统计学意义（F=9.93，P<0.001）。含质量分数10% GelMA的含银GelMA水凝胶的孔径明显大于含质量分数15%和20% GelMA的含银GelMA水凝胶（P值分别为0.002、<0.001）。含质量分数15%和20% GelMA的含银GelMA水凝胶孔径比较，差异无统计学意义（P=0.401）。
2 含3种终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶冻干后的孔隙结构 扫描电子显微镜×200。2A、2B、2C.分别为含终质量分数10%、15%、20% GelMA的含银GelMA水凝胶，图2B较图2A致密，图2C较图2B致密注：GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶2.3 含银GelMA水凝胶的纳米银释放浓度
处理1、3、7 d，含银GelMA水凝胶的体外纳米银释放浓度的变化趋势相对平缓；处理14 d，其体外纳米银释放浓度迅速增加。见图3。
2.4 含银GelMA水凝胶的抗菌性
培养24 h，含0、25、50、100 mg/L纳米银的GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌产生的抑菌圈直径分别为0、0、0.7、2.1 mm和0、1.4、3.2、3.3 mm。
2.5 纳米银溶液的细胞毒性及含银GelMA水凝胶的生物相容性
2.5.1 Fb加入纳米银溶液后的细胞增殖活性
培养48 h，空白对照组、2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组、10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组及50 mg/L纳米银组Fb的增殖活性分别为0.4210±0.0327、0.5757±0.0381、0.6170±0.0193、0.3137±0.0295、0.1810±0.0083、0.1783±0.0021，组间总体比较，差异有统计学意义（F=113.10，P<0.001）。2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组Fb的增殖活性均明显高于空白对照组（P<0.001），10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组、50 mg/L纳米银组Fb的增殖活性均明显低于空白对照组（P值分别为0.001、<0.001、<0.001）。
2.5.2 在含银GelMA水凝胶表面种植Fb后的细胞增殖活性
与0 mg/L含银GelMA水凝胶组相比，培养1 d，50 mg/L含银GelMA水凝胶组、100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性均明显降低（P值分别为0.045、<0.001），10 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性无明显变化（P=0.591）；培养3 d，50 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显升高（P=0.010），100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显降低（P=0.001），10 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性无明显变化（P=0.140）；培养7 d，100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显降低（P=0.022），50 mg/L含银GelMA水凝胶组和10 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性均无明显变化（P值分别为0.671、0.052）。见表1。
表1 4组含银GelMA水凝胶表面种植人成纤维细胞培养各时间点的细胞增殖活性比较（组别 样本数 1 d 3 d 7 d 0 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.115±0.015 0.163±0.021 0.351±0.084 10 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.118±0.023 0.199±0.050 0.362±0.037 50 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.078± 0.015a 0.237±0.021a 0.453±0.099 100 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.022±0.021a 0.044±0.026a 0.220±0.075a F值 17.97 28.49 8.90 P值 0.001 <0.001 0.006 注：GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；时间因素主效应，F=162.47，P<0.001；处理因素主效应，F=32.61，P<0.001；两者交互作用，F=3.46，P=0.130；与0 mg/L含银GelMA水凝胶组相比，aP<0.05 2.5.3 ASC与GelMA水凝胶混合种植后的细胞增殖活性
培养1 d，三维生物打印组的ASC增殖活性与非打印组相近（P>0.05）；培养3、7 d，三维生物打印组的ASC增殖活性均明显高于非打印组（P<0.05）。见表2。
表2 2组人ASC与GelMA水凝胶混合种植后培养各时间点的细胞增殖活性比较（组别 样本数 1 d 3 d 7 d 非打印组 3 0.218±0.028 0.367±0.031 0.598±0.058 三维生物打印组 3 0.244±0.027 0.739±0.042 1.516±0.219 t值 2.04 21.50 12.95 P值 0.058 <0.001 <0.001 注：ASC为脂肪干细胞，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；时间因素主效应，F=95.60，P<0.001；处理因素主效应，F=79.67，P<0.001；两者交互作用，F=27.94，P<0.001 2.5.4 ASC与GelMA水凝胶混合种植的生物相容性
培养1 d，三维生物打印组和非打印组ASC仍呈圆形、均未伸展，且三维生物打印组死细胞数略多于非打印组。培养3、5 d，三维生物打印组和非打印组绝大多数ASC为活细胞，且2组细胞逐渐呈伸展状态。见图4。
4 2组人ASC与GelMA水凝胶混合种植后培养各时间点活/死细胞情况 钙黄绿素-溴乙啡锭×100。4A、4B、4C.分别为非打印组培养1、3、5 d情况，图4B、4C细胞较图4A伸展；4D、4E、4F.分别为三维生物打印组培养1、3、5 d情况，其中图4D的死细胞略多于图4A，图4E、4F的活细胞数分别多于图4B、4C注：ASC为脂肪干细胞，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；活细胞显示为绿色荧光，死细胞显示为红色荧光2.6 三维生物打印抗菌型水凝胶支架对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响
2.6.1 创面大体情况和愈合率
伤后4 d，单纯水凝胶组和水凝胶/纳米银组大鼠创面中的渗液较多，水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面干燥且未见明显感染迹象。伤后7 d，单纯水凝胶组和水凝胶/纳米银组大鼠创面中仍有少量渗液，水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面干燥结痂。伤后14 d，4组大鼠创面上的水凝胶均脱落，单纯水凝胶组、水凝胶/纳米银组和水凝胶支架/纳米银组大鼠创面基底呈淡红色，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面基本愈合。伤后21 d，单纯水凝胶组大鼠仍有少量创面未愈，其余3组大鼠创面已明显闭合。见图5。
5 4组大鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合情况。5A、5B、5C.分别为单纯水凝胶组伤后7、14、21 d创面情况，伤后7 d创面渗液较多，伤后21 d仍有部分创面未愈；5D、5E、5F.分别为水凝胶/纳米银组伤后7、14、21 d创面情况，图5D与图5A创面面积相近，图5E大部分创面愈合；5G、5H、5I.分别为水凝胶支架/纳米银组伤后7、14、21 d创面情况，图5G创面相对干燥，图5H创面基底红润，图5I创面已愈合；5J、5K、5L.分别为水凝胶支架/纳米银/脂肪干细胞组伤后7、14、21 d创面情况，图5L创面完全上皮化且无结痂注：每个创面周围缝合内径1.6 cm、外径2.5 cm的圆形硅胶圈伤后4、7 d，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率明显高于其他3组（P值均<0.05）。伤后14 d，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率明显高于水凝胶/纳米银组和单纯水凝胶组（P值分别为0.038、<0.001），水凝胶支架/纳米银/ASC组与水凝胶支架/纳米银组的创面愈合率相近（P=0.279）。伤后21 d，单纯水凝胶组大鼠创面愈合率明显低于水凝胶支架/纳米银/ASC组（P<0.001），水凝胶支架/纳米银/ASC组与水凝胶支架/纳米银组和水凝胶/纳米银组的大鼠创面愈合率相近（P值分别为0.429、0.575）。见表3。
表3 4组全层皮肤缺损大鼠创面伤后各时间点创面愈合率比较（%，组别 创面数（个） 4 d 7 d 14 d 21 d 单纯水凝胶组 6 16.7± 8.4a 25.2±8.5a 89.7±3.9a 95.7±2.1a 水凝胶/纳米银组 6 22.5± 11.2a 39.4±4.9a 93.2±3.7a 99.3±0.9 水凝胶支架/ 纳米银组 6 28.3± 9.4a 47.1±4.6a 95.0±2.7 99.5±0.8 水凝胶支架/纳米银/ 脂肪干细胞组 6 41.4± 8.1 56.0±2.6 96.9±2.2 100±0 F值 10.13 42.63 6.30 11.08 P值 <0.001 <0.001 0.002 <0.001 注：时间因素主效应，F=730.50，P<0.001；处理因素主效应，F=26.17，P<0.001；两者交互作用，F=5.90，P<0.001；与水凝胶支架/纳米银/脂肪干细胞组相比，aP<0.05 2.6.2 创面组织病理学变化
伤后7 d，4组大鼠创面上的水凝胶均保持在位，但与单纯水凝胶组相比，其余3组的水凝胶与创面黏附更加紧密，且部分与创面新生组织相融合。伤后14 d，单纯水凝胶组的水凝胶已与创面脱离，而其余3组仍有部分水凝胶存在于创面新生组织中，且水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面中可见水凝胶支架下层网格状结构的横截面。伤后14 d的4组大鼠创面间距均较伤后7 d缩小。
伤后21 d，单纯水凝胶组大鼠创面胶原沉积呈团状、排列无序、成熟度较低，而水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组、水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面胶原交错分布，排列相对有序；水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组大鼠创面胶原排列较稀疏，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面胶原排列更致密。
3. 讨论
理想的创面敷料应具有抗菌和溶胀特性，以抑制细菌生长并及时吸收创面渗液［13, 14］。纳米银作为一种常见的纳米颗粒，对多种细菌具有高效的抗菌作用［3，15］。纳米银粒径小、表面积大的独特结构，可以与细菌DNA和某些特定的蛋白基团迅速结合，从而杀灭细菌［16］。纳米银除了具有高效的抗菌作用外，同时具有浓度依赖性的细胞毒性［17］。因此，应用时需要寻找到一个合适的纳米银浓度平衡抗菌作用以及细胞毒性。
在本研究中，GelMA水凝胶具有相互连通的孔隙结构，孔径随GelMA质量分数的增加而减小，能及时吸收创面渗液并维持创面的湿性愈合微环境。与直接应用纳米银溶液不同，当将纳米银包裹在GelMA水凝胶中后，还需要检测纳米银是否能从交联后的GelMA中被顺利释放。含银GelMA水凝胶的纳米银释放结果显示其能缓慢释放纳米银，处理14 d后，纳米银释放浓度迅速增加。有研究显示，水凝胶中的纳米银质量浓度>200 mg/L就能杀灭金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌［18, 19］。在本研究中，当纳米银质量浓度≥50 mg/L时，含银GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌同时具有抗菌作用。有研究显示，纳米银对小鼠创面愈合过程中的Fb及KC均具有毒性，且对小鼠Fb的毒性质量浓度低至4 mg/L［20］。而在含银GelMA水凝胶中，纳米银的细胞毒性明显下降。本研究中，培养7 d，0 mg/L含银GelMA水凝胶组、10 mg/L含银GelMA水凝胶组、50 mg/L含银GelMA水凝胶组的人Fb均保持良好的增殖活性，与其他研究类似。本研究团队还通过活/死细胞荧光染色和细胞增殖实验检测打印过程和打印结构对细胞生物活性的影响，结果显示打印过程对人ASC活性无明显不利影响。并且三维打印的网格状结构比实心结构更有利于细胞与营养物质的交换，促进细胞生长增殖［21, 22］。Zhao等［12］研究显示，含高浓度GelMA的GelMA水凝胶利于HaCaT细胞的生长并能形成复层的表皮层，适于作为表皮组织工程的材料；Chen等［23］研究显示，GelMA水凝胶在体外有利于人内皮集落形成细胞形成血管网，在体内能促进水凝胶内的血管网与动物的新生血管相吻合，且低甲基丙烯酸酐化的GelMA水凝胶成血管效果更好。本研究则利用含不同浓度GelMA的GelMA水凝胶的性质，上层使用含高浓度GelMA的GelMA水凝胶，能保护创面免受外界环境污染并维持湿性愈合微环境；下层使用生物相容性好的含低浓度GelMA的GelMA水凝胶，能及时吸收创面渗液，其网状结构也可促进新生组织的长入。
本研究团队前期研究显示，纳米银可以通过刺激大鼠Fb迁移、调节大鼠巨噬细胞活化及减弱创面炎症反应来促进大鼠全层皮肤缺损创面愈合［6，24］。伤后4、7 d，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率明显高于水凝胶支架/纳米银组。这说明ASC在创面修复前期发挥了促愈合的作用。ASC作为一种较优异的三维生物打印种子细胞，能通过促进Fb迁移、增强内皮细胞和KC的活性、上调VEGF相关的信号通路等促进创面修复［25, 26, 27］。本研究团队前期研究已证实包裹在水凝胶中的人Fb植入裸鼠全层皮肤缺损创面后1周内仍能保持较好的活性［28, 29］。与传统的直接喷洒或局部创周注射相比，水凝胶能提供一个适宜的微环境，确保ASC的活性和功能并参与到创面愈合中。已有研究报道，网格状孔隙结构可以促进水凝胶内的种子细胞迁移并提高猪全层皮肤缺损创面愈合率［21, 22］。
本研究显示，水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组的水凝胶与创面贴合紧密，且部分水凝胶已降解并与新生组织相融合，而单纯水凝胶组的水凝胶部分已脱离创面。水凝胶材料虽然可以维持创面愈合所需的湿性环境，但在无抗菌性材料的情况下也会大大提高创面感染的风险。纳米银的抗菌性能可以降低水凝胶材料的感染风险，其调节炎症反应性能［6，30］也可以促进创面与植入材料相融合。本研究观察到水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组网格状结构的横截面，而水凝胶/纳米银组显示的是一团尚未降解的水凝胶且周围胶原纤维排列较为混乱；且水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面的胶原排列更为有序，这说明网格状结构有效地促进了水凝胶支架与创面的融合并促进了新生组织的更有序长入。
综上所述，含银GelMA水凝胶具有良好的生物相容性及抗菌性能，其三维生物打印的双层结构能更好地与大鼠全层皮肤缺损创面新生组织相融合并促进创面愈合。
金荣华、张珍珍、徐鹏钦、夏斯展、翁婷婷、朱志康：实验操作、论文撰写、数据处理、统计学分析；王新刚、有传刚、韩春茂：研究指导、论文修改、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
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1 3种质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒的形态。1A.100 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒散在分布 扫描电子显微镜×100 000；1B.50 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒分布较图1A稀疏 扫描电子显微镜×100 000；1C.10 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒分布较图1B更加稀疏 扫描电子显微镜×100 000；1D.10 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒呈圆形，粒径较均匀 扫描电子显微镜×500 000
2 含3种终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶冻干后的孔隙结构 扫描电子显微镜×200。2A、2B、2C.分别为含终质量分数10%、15%、20% GelMA的含银GelMA水凝胶，图2B较图2A致密，图2C较图2B致密
注：GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶
4 2组人ASC与GelMA水凝胶混合种植后培养各时间点活/死细胞情况 钙黄绿素-溴乙啡锭×100。4A、4B、4C.分别为非打印组培养1、3、5 d情况，图4B、4C细胞较图4A伸展；4D、4E、4F.分别为三维生物打印组培养1、3、5 d情况，其中图4D的死细胞略多于图4A，图4E、4F的活细胞数分别多于图4B、4C
注：ASC为脂肪干细胞，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；活细胞显示为绿色荧光，死细胞显示为红色荧光
5 4组大鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合情况。5A、5B、5C.分别为单纯水凝胶组伤后7、14、21 d创面情况，伤后7 d创面渗液较多，伤后21 d仍有部分创面未愈；5D、5E、5F.分别为水凝胶/纳米银组伤后7、14、21 d创面情况，图5D与图5A创面面积相近，图5E大部分创面愈合；5G、5H、5I.分别为水凝胶支架/纳米银组伤后7、14、21 d创面情况，图5G创面相对干燥，图5H创面基底红润，图5I创面已愈合；5J、5K、5L.分别为水凝胶支架/纳米银/脂肪干细胞组伤后7、14、21 d创面情况，图5L创面完全上皮化且无结痂
注：每个创面周围缝合内径1.6 cm、外径2.5 cm的圆形硅胶圈
表1 4组含银GelMA水凝胶表面种植人成纤维细胞培养各时间点的细胞增殖活性比较（
组别 样本数 1 d 3 d 7 d 0 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.115±0.015 0.163±0.021 0.351±0.084 10 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.118±0.023 0.199±0.050 0.362±0.037 50 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.078± 0.015a 0.237±0.021a 0.453±0.099 100 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.022±0.021a 0.044±0.026a 0.220±0.075a F值 17.97 28.49 8.90 P值 0.001 <0.001 0.006 注：GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；时间因素主效应，F=162.47，P<0.001；处理因素主效应，F=32.61，P<0.001；两者交互作用，F=3.46，P=0.130；与0 mg/L含银GelMA水凝胶组相比，aP<0.05 
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表2 2组人ASC与GelMA水凝胶混合种植后培养各时间点的细胞增殖活性比较（
组别 样本数 1 d 3 d 7 d 非打印组 3 0.218±0.028 0.367±0.031 0.598±0.058 三维生物打印组 3 0.244±0.027 0.739±0.042 1.516±0.219 t值 2.04 21.50 12.95 P值 0.058 <0.001 <0.001 注：ASC为脂肪干细胞，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；时间因素主效应，F=95.60，P<0.001；处理因素主效应，F=79.67，P<0.001；两者交互作用，F=27.94，P<0.001
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表3 4组全层皮肤缺损大鼠创面伤后各时间点创面愈合率比较（%，
组别 创面数（个） 4 d 7 d 14 d 21 d 单纯水凝胶组 6 16.7± 8.4a 25.2±8.5a 89.7±3.9a 95.7±2.1a 水凝胶/纳米银组 6 22.5± 11.2a 39.4±4.9a 93.2±3.7a 99.3±0.9 水凝胶支架/ 纳米银组 6 28.3± 9.4a 47.1±4.6a 95.0±2.7 99.5±0.8 水凝胶支架/纳米银/ 脂肪干细胞组 6 41.4± 8.1 56.0±2.6 96.9±2.2 100±0 F值 10.13 42.63 6.30 11.08 P值 <0.001 <0.001 0.002 <0.001 注：时间因素主效应，F=730.50，P<0.001；处理因素主效应，F=26.17，P<0.001；两者交互作用，F=5.90，P<0.001；与水凝胶支架/纳米银/脂肪干细胞组相比，aP<0.05
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