Preparation and roles of sliver-loaded viscous hydrogel in healing of full-thickness skin defect wounds with bacterial colonization in mice
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摘要:
目的 制备负载银粒子的改性透明质酸黏性水凝胶，探讨其在小鼠细菌定植全层皮肤缺损创面愈合中的作用及可能的机制。 方法 采用实验研究方法。制备多巴胺修饰的透明质酸（HA-DA）和苯硼酸修饰的透明质酸（HA-PBA），傅里叶变换红外光谱检测其特征峰。在HA-DA和HA-PBA中加入不同质量的丙烯酰胺，制备质量分数为10%、15%、20%丙烯酰胺的黏性水凝胶。观察含质量分数20%丙烯酰胺的黏性水凝胶在37 ℃下倾斜状态和倒立状态的成胶情况，旋转流变仪检测前述3种黏性水凝胶的储存模量和损耗模量。在含质量分数20%丙烯酰胺的黏性水凝胶中加入纳米银离子，制备含银黏性水凝胶，采用电感耦合等离子体质谱仪测量含银黏性水凝胶释放的银离子浓度，并计算累计银离子释放率（样本数为5）。取小鼠成纤维细胞L929，分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、黏性水凝胶组及含银黏性水凝胶组并进行相应处理，采用细胞计数试剂盒8法检测培养1、2、3 d细胞存活情况（样本数为5）。取24只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠，在其背部建立48个接种大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌混合悬液的全层皮肤缺损创面模型，每只小鼠2个创面。将创面分成生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组并进行相应处理，每组16个创面，且每只小鼠的2个创面纳入不同组。伤后3、7、10、14 d，观察创面愈合情况并计算创面愈合率；伤后3 d，观察并计数创面中大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌菌落数；伤后14 d，行苏木精-伊红染色和Masson染色分别观察并分析创面上皮化的表皮厚度和胶原纤维的光密度；伤后3、7、10 d，采用免疫组织化学法检测创面中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）及血管内皮生长因子（VEGF）的表达。 各指标各时间点创面数均为4个。对数据进行析因设计方差分析、单因素方差分析及Bonferroni校正。 结果 HA-PBA在波数为1 369、1 425 cm-1处检测到特征峰，表明苯硼酸成功接枝到透明质酸上；HA-DA在波数为1 516、1 431 cm-1处检测到特征峰，表明多巴胺已成功接枝到透明质酸上。含质量分数20％丙烯酰胺的黏性水凝胶在37 ℃下，无论是倾斜还是倒立时都保持稳定不流动的凝胶状态。随着丙烯酰胺含量的增加，黏性水凝胶储存模量和损耗模量均有所增加，但3种不同丙烯酰胺含量黏性水凝胶的储存模量和损耗模量随振荡频率或时间的增加变化不明显且储存模量均大于损耗模量。含银黏性水凝胶中银离子释放长达7 d，累计银离子释放率最高达65%。培养1、2、3 d，含银黏性水凝胶组细胞存活率明显低于PBS组和黏性水凝胶组（P<0.05或P<0.01）；培养1 d，黏性水凝胶组细胞存活率明显低于PBS组（P<0.01）。随着伤后时间的延长，3组小鼠创面均不断缩小。伤后3、7、10、14 d，含银黏性水凝胶组创面愈合率分别为（53.0±3.6）%、（75.3±6.9）%、（93.3±1.2）%、（96.7±0.8）%，明显高于生理盐水组的（21.8±6.4）%、（53.9±8.2）%、（72.0±7.8）%、（92.5±0.4）%（P<0.01）。伤后3、14 d，含银黏性水凝胶组创面愈合率明显高于黏性水凝胶组的（43.5±2.4）%、（94.1±1.5）%（P<0.05）；伤后3、10 d，黏性水凝胶组创面愈合率明显高于生理盐水组（P<0.01）。伤后3 d，含银黏性水凝胶组创面中2种细菌菌落数明显少于生理盐水组及黏性水凝胶组（P<0.01），黏性水凝胶组创面中2种细菌菌落数明显少于生理盐水组（P<0.05）。伤后14 d，含银黏性水凝胶组创面基本上皮化且表皮厚度更厚，胶原蛋白含量较其他2组明显增多且胶原排列更加有序；含银黏性水凝胶组创面的表皮厚度较其余2组明显增加（P<0.05），胶原纤维光密度较生理盐水组明显增加（P<0.05）。伤后3 d，含银黏性水凝胶组创面TGF-β1和VEGF的表达明显高于生理盐水组（P<0.05或P<0.01），黏性水凝胶组创面VEGF的表达明显高于生理盐水组（P<0.01）。伤后7 d，含银黏性水凝胶组创面TGF-β1的表达明显高于其余2组（P<0.01），VEGF的表达明显高于生理盐水组（P<0.01）。伤后10 d，含银黏性水凝胶组创面TNF-α的表达明显低于生理盐水组（P<0.05），TGF-β1和VEGF的表达明显高于生理盐水组（P<0.05或P<0.01），且VEGF的表达明显高于黏性水凝胶组（P<0.05）。 结论 本研究制备的含银黏性水凝胶具有良好的稳定性和弹性，可以持续释放银离子，有助于加速小鼠细菌定植全层皮肤缺损创面的愈合，生物毒性较低，可以促进创面再上皮化、胶原沉积和血管再生，可能涉及炎症细胞的浸润与消退。 Abstract:Objective To prepare the modified hyaluronic acid viscous hydrogel loaded with sliver particles and to explore the roles and mechanism of the hydrogel in healing of full-thickness skin defect wounds with bacterial colonization in mice. Methods The experimental research method was adopted. Dopamine modified hyaluronic acid (HA-DA) and phenylboric acid modified hyaluronic acid (HA-PBA) were prepared, and their characteristic peaks were detected by Fourier-transform infrared spectroscopy. Different mass of acrylamides was added to HA-DA and HA-PBA to prepare the viscous hydrogel with mass fraction of acrylamide in 10%, 15%, and 20%. The gelation of the viscous hydrogel with mass fraction of acrylamide in 20% was observed in the state of tilt and inversion at 37 ℃, and the storage modulus and loss modulus of the above 3 kinds of viscous hydrogels were detected by rotational rheometer. The sliver-loaded viscous hydrogel was prepared by adding nano silver ions to the viscous hydrogel with mass fraction of acrylamide in 20%. The concentration of silver ions released by sliver-loaded viscous hydrogel was measured by inductively coupled plasma mass spectrometer, and the cumulative release rate of silver ion was calculated (n=5). The mouse fibroblasts L929 were divided into phosphate buffered saline (PBS) group, viscous hydrogel group, and sliver-loaded viscous hydrogel group, which were dealt correspondingly, and the cell survival was detected by cell counting kit 8 method after 1, 2, and 3 d of culture (n=5). Twenty-four male C57BL/6 mice aged 6-8 weeks were selected, and forty-eight full-thickness skin defect wounds were inflicted and inoculated with the mixture of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in the back of the mice, with two wounds in each mouse. The wounds were divided into normal saline group, viscous hydrogel group, and sliver-loaded viscous hydrogel group, which were dealt correspondingly, with 16 wounds in each group, and two wounds in each mouse were divided into different groups. On post injury day (PID) 3, 7, 10, and 14, the wound healing was observed and the wound healing rate was calculated. On PID 3, the colony forming units of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in wounds were observed and counted. On PID 14, the epithelized epidermal thickness and the optical density of collagen fiber in wounds were observed and analyzed after hematoxylin eosin staining and Masson staining, respectively. On PID 3, 7, and 10, the expressions of tumor necrosis factor α (TNF-α), transforming growth factor β1 (TGF-β1), and vascular endothelial growth factor (VEGF) were detected by immunohistochemistry. The number of wounds in each index detecting at each time point was four. Data were statistically analyzed with analysis of variance for factorial design, one-way analysis of variance, and Bonferroni correction. Results The characteristic peaks of HA-PBA were detected at the wave numbers of 1 369 and 1 425 cm-1, indicating that phenylboric acid had been successfully grafted on hyaluronic acid, and the characteristic peaks of HA-DA were detected at the wave numbers of 1 516 and 1 431 cm-1, indicating that dopamine had been successfully grafted on hyaluronic acid. The viscous hydrogel with mass fraction of acrylamide in 20% maintained the stable and no-flow condition of gelation in the state of tilt and inversion at 37 ℃. The storage modulus and loss modulus of the viscous hydrogel increased with the increase of acrylamide content, the storage modulus and loss modulus of the 3 kinds of viscous hydrogels had no obvious changes with the increase of the oscillation frequency or time, and the storage modulus of the 3 kinds of acrylamide hydrogels were greater than the loss modulus. The release of silver ion in the sliver-loaded viscous hydrogel lasted for 7 days, and the cumulative release rate of silver ion was up to 65%. After 1, 2, and 3 d of culture, the cell survival rates in sliver-loaded viscous hydrogel group were significantly lower than those in PBS group and viscous hydrogel group (P<0.05 or P<0.01), while after 1 d of culture, the cell survival rate in viscous hydrogel group was significantly lower than that in PBS group (P<0.01). With extension of time after injury, the wounds of mice in the 3 groups shrank gradually. On PID 3, 7, 10, and 14, the wound healing rates in sliver-loaded viscous hydrogel group were (53.0±3.6)%, (75.3±6.9)%, (93.3±1.2)%, and (96.7±0.8)%, which were significantly higher than (21.8±6.4)%, (53.9±8.2)%, (72.0±7.8)%, and (92.5±0.4)% in normal saline group (P<0.01). On PID 3 and 14, the wound healing rates in sliver-loaded viscous hydrogel group were significantly higher than (43.5±2.4)% and (94.1±1.5)% in viscous hydrogel group (P<0.05). On PID 3 and 10, the wound healing rates in viscous hydrogel group were significantly higher than those in normal saline group (P<0.01). On PID 3, the colony forming units of two bacteria in wound of sliver-loaded viscous hydrogel group were significantly less than those in normal saline group and viscous hydrogel group (P<0.01), while the colony forming units of two bacteria in wound of viscous hydrogel group were significantly less than those in normal saline group (P<0.05). On PID 14, the wounds were basically epithelialized and the epidermis was thicker, with collagen protein content being increased significantly and more orderly arranged collagen in sliver-loaded viscous hydrogel group compared with those in the other 2 groups. On PID 14, the epidermal thickness in wounds of sliver-loaded viscous hydrogel group was significantly increased compared with that in the other two groups (P<0.05), and the optical density of collagen fiber was significantly increased compared with those in normal saline group (P<0.05). On PID 3, the expressions of TGF-β1 and VEGF in wounds of sliver-loaded viscous hydrogel group were significantly higher than those in normal saline group (P<0.05 or P<0.01), while the expression of VEGF in wounds of viscous hydrogel group was significantly higher than that in normal saline group (P<0.01). On PID 7, the expression of TGF-β1 in wounds of sliver-loaded viscous hydrogel group was significantly higher than that in the other 2 groups (P<0.01), and the expression of VEGF was significantly higher than that in normal saline group (P<0.01). On PID 10, the expression of TNF-α in wounds of sliver-loaded viscous hydrogel group was significantly lower than that in normal saline group (P<0.05), the expressions of TGF-β1 and VEGF in wounds of sliver-loaded viscous hydrogel group were significantly higher than those in normal saline group (P<0.05 or P<0.01), and the expression of VEGF in wounds of sliver-loaded viscous hydrogel group was significantly higher than that in viscous hydrogel group (P<0.05). Conclusions The sliver-loaded viscous hydrogel prepared in this study has good stability and elasticity, which can continuously release silver ions and help to accelerate the healing of full-thickness defect wounds with bacterial colonization in mice. Besides, the sliver-loaded viscous hydrogel has low biological toxicity and can promote re-epithelialization, collagen deposition as well as angiogenesis of wounds, which may be related to the infiltration and regression of inflammatory cells. -
Key words:
- Wound healing /
- Hydrogel /
- Hyaluronic acid /
- Nano silver /
- Re-epithelialization /
- Collagen deposition /
- Angiogenesis
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皮肤是人体最大的器官，也是暴露最广的部位，容易因手术、车祸或烧伤等原因受到伤害［1, 2］。创面愈合是一个十分复杂、有序的过程，该过程涉及凝血期、炎症期、修复期和重塑期几个既相互叠加又相互影响的生物学阶段［3］。皮肤创伤会导致其保护屏障功能的减弱或丧失，从而继发微生物的扩增与感染，延缓愈合进程。根据创面中细菌的数量及其对创面的影响，可将创面状态分为污染、定植和侵袭性感染。污染的定义是创面中存在不可复制的细菌，定植的定义是创面中存在可复制的细菌但没有对组织造成损伤，侵袭性感染的特征是细菌菌落数达到1×105 CFU/mL［4, 5］。目前，临床上很多难愈性创面往往都因感染加重造成，所以在细菌污染或定植创面后，积极进行创面处理，避免创面由急性演变成难愈性尤为关键。近年来，皮肤创面修复的新型材料越来越受到关注［6, 7］，但生物材料用于治疗创面仍然无法避免一些全身毒性作用以及局部应用而产生的耐药性［8］。因此，研究新型治疗材料来改善难愈性创面的愈合受到学者的广泛关注。
创伤后，虽然传统敷料有一定预防继发感染的作用［9］，但效果欠佳。而水凝胶作为近年来创面湿性愈合的理想敷料，可以提供一个类似于ECM的微环境，并具有生物相容性［10, 11, 12］，同时，其三维水膨胀聚合物网络为纳米颗粒悬浮液提供了理想的微环境。此外，基于多巴胺的水凝胶由于存在活性儿茶酚基团［13, 14］而具有黏合力，而黏性水凝胶可以防止创面处气体和液体的泄漏［15］。但湿性环境可能有助于微生物繁殖，可在水凝胶敷料中添加抗感染成分。纳米银粒子是生物医学领域常用的无机抗菌剂之一［16］，具有广谱抗菌性和降低生物活性的作用，主要是因其可抑制细菌的代谢，阻碍细菌DNA的复制［17］；纳米银粒子还可通过破坏细胞内的生物分子和细胞结构来杀死细菌［18, 19］。目前，关于纳米银和黏性水凝胶结合的报道较少，研究和制备出既具有保湿功能，又具有黏合力，且具有抗菌性的水凝胶将对难愈性创面的临床治疗带来良好的前景。
1. 材料与方法
1.1 动物和细胞及主要试剂和仪器来源
24只健康无特殊病原体级6~8周龄、体重20~25 g雄性C57BL/6小鼠均由广东药康科技有限公司提供，许可证号：SCXK（粤）2020-0054。小鼠Fb L929购于上海赛百慷生物技术股份有限公司。透明质酸（医药级）购于山东福瑞达医药集团公司，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基磺基琥珀酰亚胺（NHS）购于上海源叶生物科技有限公司，盐酸多巴胺、丙烯酰胺、偶氮二异丁脒盐酸盐（AIBA）、亚甲基双丙烯酰胺（MBAA）和3-氨基苯硼酸购于上海麦克林生化科技有限公司，硝酸银购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，细胞计数试剂盒8（CCK-8）购于同仁化学研究所，革兰阴性菌选择培养基和甘露醇盐琼脂培养基购于青岛高科园海博生物技术有限公司，兔抗小鼠TNF-α多克隆抗体、兔抗小鼠TGF-β1单克隆抗体、小鼠源性VEGF单克隆抗体购于艾博抗（上海）贸易有限公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体、二氨基联苯胺（DAB）、HE染液、Masson三色染液购于武汉赛维尔生物科技有限公司。ALC-110.4型电子分析天平购于德国艾科勒公司，DF-101S型集热式磁力搅拌器购于巩义市英峪高科仪器厂，Alpha 2-4 LDplus型冷冻干燥机购于德国Christ公司，VERTEX 70型傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪购于德国Bruker公司，Kinexus lab+型旋转流变仪购于英国Malvern公司，PerkinElmer Optima 7300V型电感耦合等离子体质谱仪购于美国PerkinElmer公司，佳能90D数码相机购于日本佳能公司，Tissuelyser-24型组织匀浆机购于上海净信科技公司，IDM2300型光学显微镜购于南京江南永新光学有限公司，SHP-080型生化培养箱购于上海精宏实验设备有限公司。
1.2 材料的合成及验证
1.2.1 多巴胺修饰的透明质酸（HA-DA）的制备
将1 g 透明质酸粉剂加入到5 mL的去离子水中，在室温下通氮气使其完全溶解后，加入575 mg的EDC粉剂和345 mg的NHS粉剂，用磁力搅拌器连续搅拌（下同）20 min，随后加入569 mg盐酸多巴胺粉剂搅拌10 min后溶解。在接下来的3 h内，通过加入0.01 mol/L的盐酸或氢氧化钠使溶液的pH值保持在5~6之间。溶液在室温下反应12 h后，装入透析袋（截留分子量=4×103~8×103）中，并在pH=5.5的酸性条件下常温透析3 d。最后在-80 ℃下冻干得到海绵状固体，即HA-DA［20］。
1.2.2 苯硼酸修饰的透明质酸（HA-PBA）的制备
将1 g透明质酸粉剂溶解于200 mL去离子水中，然后加入0.96 g的EDC粉剂和0.49 g的3-氨基苯硼酸粉剂，在室温下搅拌24 h后，同1.2.1透析、冻干，得到海绵状固体，即HA-PBA［21］。
1.2.3 FTIR光谱检测
分别取适量透明质酸、盐酸多巴胺、3-氨基苯硼酸、HA-DA、HA-PBA及溴化钾粉末，混合均匀后研磨为细粉，压制成圆形透明薄片（厚0.4 mm），用FTIR光谱仪检测样品的透光率，设置的波数扫描范围为500~4 000 cm-1，光谱分辨率为4 cm-1，每个样品扫描16次。分别观察HA-PBA中是否具有透明质酸不含的而在3-氨基苯硼酸中出现在波数为1 369 cm-1的B-O键和在波数为1 425 cm-1属于芳香化合物的C-C键的特征峰，以及HA-DA中是否具有透明质酸不含的而在多巴胺中出现在波数为1 516 cm-1和1 431 cm-1属于芳香化合物的C-C键的特征峰。
1.2.4 黏性水凝胶的制备与成胶情况观察及流变性能测试
将同样3份0.08 g HA-PBA和0.17 g HA-DA溶解于4 mL去离子水中，在室温下搅拌至完全溶解，分别加入0.40、0.60、0.80 g的丙烯酰胺，在60 ℃水浴中搅拌至完全溶解，加入 0.44 mol/L AIBA 30 µL和0.064 mol/L MBAA 65 µL，在室温下搅拌8 h后，分别获得含质量分数10%、15%、20%丙烯酰胺的黏性水凝胶。观察质量分数为20%丙烯酰胺的黏性水凝胶在37 ℃下倾斜状态和倒立状态的成胶情况。每种水凝胶取400 μL，加载到旋转流变仪载物台上使其均匀分布。采用时间扫描试验［22］，用旋转流变仪测量水凝胶的储存模量和损耗模量随时间的变化，时间设为0~300 s，恒定应变率为1%，温度为37 ℃。采用频率扫描试验［23］，用旋转流变仪测量水凝胶储存模量和损耗模量随频率的变化，振荡频率设为0~10 Hz（测试过程中逐步增加），恒定应变率为0.5%，温度为37 ℃。取含质量分数20%丙烯酰胺的黏性水凝胶用于后续实验。
1.2.5 含银黏性水凝胶的制备与银离子的释放检测
将5 mg硝酸银溶解于1 mL去离子水中，配成5 mg/mL的硝酸银溶液，滴加质量分数为26%的氨水溶液直至溶液澄清透明，得到银氨溶液。再加入3 mg葡萄糖（作为还原剂）和质量分数为5%的聚乙烯吡咯烷酮10 mg，常温下搅拌8 h，得到纳米银粒子。同1.2.4制备含质量分数20%丙烯酰胺的黏性水凝胶，在加入AIBA和MBAA前加入0.04 g纳米银粒子并使其完全溶解，得到含银黏性水凝胶，测得其中银离子浓度为0.64 µg/mL。
将1 mL含银黏性水凝胶加入到10 mL的PBS中，密封后置于37 ℃、100 r/min的恒温摇床中进行体外释放实验。每天13：00取出1 mL释放液，同时补加1 mL的新鲜PBS，连续8 d。将取出的1 mL释放液稀释到10 mL，采用电感耦合等离子体质谱仪测量银离子的浓度，计算累计银离子释放率。累计银离子释放率=累计银离子浓度÷0.64 µg/mL× 100％，并绘制银离子释放曲线。本实验重复5次。
1.2.6 细胞毒性测试
采用CCK-8法进行检测。于底面积25 cm2的细胞培养瓶中，用含体积分数10％胎牛血清的DMEM高糖培养基（以下简称高糖培养基）培养小鼠Fb L929，待细胞生长至培养瓶底面积的70％~80％时，取对数生长期的细胞。用2.5 g/L胰酶消化细胞后，加入3 mL含体积分数10％胎牛血清的高糖培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入培养基匀速吹打均匀，使细胞悬浮。调节细胞密度至每孔5 000个，接种于96孔板中，每孔100 μL。将细胞分为PBS组、黏性水凝胶组及含银黏性水凝胶组，分别加入100 µL含10 µg PBS、黏性水凝胶、含银黏性水凝胶的高糖培养基；另设仅含100 µL高糖培养基的空白对照及仅有细胞和100 µL高糖培养基的阴性对照，每组设置15个复孔。置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，吸出培养基，加入浸提液100 μL，同前于培养箱中培养3 d，每天17：00取出96孔板，每组每天5个孔加入含10 μL CCK-8溶液的100 μL高糖培养基并同前于培养箱中孵育2 h，用酶标仪测定波数450 nm处的吸光度值，以此反映细胞存活情况，并计算细胞存活率。
1.3 动物实验
本研究中动物实验符合国家和解放军南部战区总医院动物中心的有关规定。
1.3.1 创面分组与处理及创面愈合情况
取24只C57BL/6小鼠，腹腔注射10 mg/mL戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉（麻醉方式下同）后，剃除小鼠背部毛发，暴露的皮肤用体积分数75%乙醇消毒。手术器械灭菌消毒，用组织剪在背部中段两侧对称部位各剪1个直径为10 mm的圆形全层皮肤缺损创面。每个创面滴加10 μL混合菌悬液（1×108 CFU/mL大肠埃希菌5 μL和1×108 CFU/mL金黄色葡萄球菌5 μL）。24 h后，将所有创面按顺序进行编号，且每只小鼠的2个创面连续编号，连续编号的每3个创面依次纳入生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组（每组16个创面），分别滴加0.5 g生理盐水、黏性水凝胶、含银黏性水凝胶。创面先用紫外线灭菌后的医用纱布覆盖，再用医用3M透明敷料进行覆盖，小鼠单笼饲养，每3天更换1次敷料。观察伤后即刻所有创面及伤后3、7、10、14 d每组4个创面（各时间点样本不同，下同）的愈合情况，观察拍照后麻醉小鼠，取创面组织用于后续检测，取材后脱颈处死小鼠。用Image J 1.8.0图像分析软件（美国国立卫生研究院）对图像进行处理，并计算创面愈合率。创面愈合率=（原始创面面积-伤后各时间点创面面积）÷原始创面面积×100%。
1.3.2 创面细菌计数
伤后3 d，每组取4个创面的部分组织，采用组织匀浆机匀浆后，将组织匀浆液稀释1 000倍。取100 μL组织匀浆液，均匀涂布于革兰阴性菌选择培养基和甘露醇盐琼脂培养基平板上，将培养基平板放置于37 ℃生化培养箱中倒置培养。培养24 h后，观察并计数革兰阴性菌选择培养基中的大肠埃希菌（白色菌落）及甘露醇盐琼脂培养基中的金黄色葡萄球菌（金黄色菌落）。
1.3.3 组织学分析
伤后14 d，每组取4个创面的部分组织，浸泡在40 g/L多聚甲醛中并于 4 ℃固定24 h以上，随后梯度乙醇脱水。然后石蜡包埋、切片，厚度为 4 μm。脱蜡后，按照试剂说明书进行HE染色和 Masson染色。脱水封片后用光学显微镜分别放大100、200倍观察创面新生皮肤组织并拍照，用Image J 1.8.0和Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对图像进行处理，分析上皮化的表皮厚度及胶原纤维的光密度。上皮化的表皮厚度=表皮面积÷表皮长度，胶原纤维的光密度=积分光密度÷阳性区域的总面积。
1.3.4 免疫组织化学分析
分别于伤后3、7、10 d，每组取4个创面的部分组织，浸泡在40 g/L多聚甲醛中并于4 ℃固定24 h以上，常规梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋，将组织蜡块经切片（厚4 μm）、烤片、脱蜡、水化处理后，加热10 min，浸于蒸馏水冷却后用PBS浸洗。滴加含体积分数3%过氧化氢的甲醇溶液，室温封闭10 min；滴加10 g/L牛血清白蛋白溶液50~100 μL，室温孵育20 min，PBS浸洗、甩干。加入一抗兔抗小鼠TNF-α多克隆抗体（稀释比为1∶200）、兔抗小鼠TGF-β1单克隆抗体（稀释比为1∶500）和小鼠源性VEGF单克隆抗体（稀释比为1∶200），4 ℃孵育过夜。加入二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体（稀释比为1∶500）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（稀释比为1∶500），室温孵育50 min。加入2滴DAB显色，于200倍光学显微镜下观察染色情况。将切片放入苏木精染液复染细胞核，10 min后，用梯度乙醇处理，二甲苯脱水，封片。于400倍光学显微镜下观察创面组织中TNF-α、TGF-β1、VEGF的表达（棕色），用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对图像进行处理。
1.4 统计学处理
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 FTIR光谱图
HA-PBA在波数为1 369 cm-1处出现归因于B-O键的吸收峰，在波数为1 425 cm-1处出现归因于芳香化合物C-C键的特征峰，表明苯硼酸已成功接枝在透明质酸上。HA-DA在波数为1 516、1 431 cm-1处出现归因于芳香化合物C-C键的特征峰，表明多巴胺已成功接枝在透明质酸上。见图1。
1 HA-DA和HA-PBA的红外光谱图显示苯硼酸、多巴胺已成功接到透明质酸上注：黑色线为透明质酸，红色线为多巴胺，黄色线为苯硼酸，蓝色线为多巴胺修饰的透明质酸（HA-DA），绿色线为苯硼酸修饰的透明质酸（HA-PBA）；HA-PBA光谱图上2个箭头分别表示在波数为1 369、1 425 cm-1附近出现归因于B-O键和芳香化合物C-C键的特征峰，HA-DA光谱图上2个箭头分别表示在波数为1 516、1 431 cm-1附近出现归因于芳香化合物C-C键的特征峰2.2 黏性水凝胶的成胶情况
含质量分数20％丙烯酰胺的黏性水凝胶在37 ℃下，无论是倾斜还是倒立时都保持稳定不流动的凝胶状态。见图2。
2.3 黏性水凝胶流变性能
随着丙烯酰胺含量的增加，黏性水凝胶储存模量和损耗模量均有所增加。3种不同丙烯酰胺含量黏性水凝胶的储存模量和损耗模量随振荡频率或时间的增加变化不明显且储存模量均大于损耗模量，见图3。
3 3种不同丙烯酰胺含量黏性水凝胶的储存模量和损耗模量。3A.储存模量和损耗模量随振荡频率变化不明显；3B.储存模量和损耗模量随时间变化不明显注：该图为经过lg处理的数据形成的描记图;坐标轴数据为未经lg处理的原始数据；黑色、绿色、浅蓝色分别为含质量分数10％、15％、20％丙烯酰胺黏性水凝胶的储存模量；红色、深蓝色、紫色分别为含质量分数10％、15％、20％丙烯酰胺黏性水凝胶的损耗模量2.4 银离子释放
含银黏性水凝胶中银离子释放长达7 d，累计银离子释放率最高达65％。见图4。
2.5 细胞存活率
培养1、2、3 d，含银黏性水凝胶组细胞存活率明显低于PBS组（P<0.01）和黏性水凝胶组（P<0.05或P<0.01）。培养1 d，黏性水凝胶组细胞存活率明显低于PBS组（P<0.01）。见表1。
表1 3组小鼠成纤维细胞L929培养各时间点存活率比较（％，组别 样本数 1 d 2 d 3 d PBS组 15 97.2±1.1 96.3±0.8 96.0±2.4 黏性水凝胶组 15 93.5±1.3a 93.7±2.3 93.7±2.1 含银黏性水凝胶组 15 84.5±1.4ab 87.3±2.7ab 89.0±2.4ac F值 125.553 24.807 12.084 P值 <0.01 <0.01 <0.01 注：各组各时间点样本数为5；PBS为磷酸盐缓冲液；处理因素主效应，F=95.869，P<0.01；时间因素主效应，F=1.310，P>0.05；两者交互作用，F=2.971，P>0.05；与PBS组比较，aP<0.01；与黏性水凝胶组比较，bP<0.01,cP<0.05 2.6 创面愈合情况
随着伤后时间的延长，3组小鼠创面均不断缩小。伤后3、7、10、14 d，含银黏性水凝胶组创面愈合率明显高于生理盐水组（P<0.01）；伤后3、14 d，含银黏性水凝胶组创面愈合率明显高于黏性水凝胶组（P<0.05）。伤后3、10 d，黏性水凝胶组创面愈合率明显高于生理盐水组（P<0.01）。见图5、表2。
5 3组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合情况。5A、5B、5C、5D.分别为生理盐水组伤后3、7、10、14 d创面情况，创面逐渐缩小；5E、5F、5G、5H.分别为黏性水凝胶组伤后3、7、10、14 d创面情况，图5E、5F、5G、5H中创面分别较图5A、5B、5C、5D有所缩小；5I、5J、5K、5L.分别为含银黏性水凝胶组伤后3、7、10、14 d创面情况，图5I、5J、5K、5L中创面分别较图5E、5F、5G、5H有所缩小，较图5A、5B、5C、5D明显缩小表2 3组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合率比较（%，组别 创面数（个） 3 d 7 d 10 d 14 d 生理盐水组 4 21.8±6.4 53.9±8.2 72.0±7.8 92.5±0.4 黏性水凝胶组 4 43.5±2.4a 66.9±3.6 88.3±2.2a 94.1±1.5 含银黏性水凝胶组 4 53.0±3.6ab 75.3±6.9a 93.3±1.2a 96.7±0.8ab F值 51.107 10.841 22.303 17.740 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 注：处理因素主效应，F=73.626，P<0.01；时间因素主效应，F=328.066，P<0.01；两者交互作用，F=6.461，P<0.01；与生理盐水组比较，aP<0.01；与黏性水凝胶组比较，bP<0.05 2.7 创面中2种细菌菌落分布
伤后3 d，含银黏性水凝胶组创面中2种细菌菌落数均明显少于生理盐水组及黏性水凝胶组（P<0.01），黏性水凝胶组创面中2种细菌菌落数明显少于生理盐水组（P<0.05）。见图6、表3。
6 3组小鼠伤后3 d全层皮肤缺损创面中金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌菌落分布情况。6A、6B、6C.分别为生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组金黄色葡萄球菌菌落情况，图6B中细菌菌落数较图6A中明显减少，图6C中细菌菌落数较图6A、6B明显减少；6D、6E、6F.分别为生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组大肠埃希菌菌落情况，图6E中细菌菌落数较图6D明显减少，图6F中细菌菌落数较图6D、6E明显减少表3 3组小鼠伤后3 d全层皮肤缺损创面大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌落数比较（CFU/mL，组别 创面数（个） 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生理盐水组 4 （3.1±0.7）×108 （7.3±0.7）×105 黏性水凝胶组 4 （2.0±0.4）×108 a （6.1±0.5）×105 a 含银黏性水凝胶组 4 （3.0±0.4）×104 bc （9.0±1.3）×102 bc F值 39.881 255.464 P值 <0.01 <0.01 注：CFU为集落形成单位；与生理盐水组比较，aP<0.05，bP<0.01；与黏性水凝胶组比较，cP<0.01 2.8 组织学分析
伤后14 d，生理盐水组创面部分上皮化且上皮化后表皮较薄，黏性水凝胶组创面基本上皮化但上皮化后表皮仍较薄，含银黏性水凝胶组创面基本上皮化且上皮化后表皮较厚。伤后14 d，生理盐水组创面胶原蛋白含量较少且排列紊乱，黏性水凝胶组创面胶原蛋白含量增多但排列仍较紊乱，含银黏性水凝胶组创面胶原蛋白含量明显增多且排列有序。伤后14 d，含银黏性水凝胶组创面的表皮厚度和胶原纤维光密度较生理盐水组明显增加（P<0.05），含银黏性水凝胶组创面表皮厚度较黏性水凝胶组明显增加（P<0.05）。见表4、图7。
表4 3组小鼠伤后14 d全层皮肤缺损创面表皮厚度和胶原纤维光密度比较（组别 创面数（个） 表皮厚度（μm） 胶原纤维光密度 生理盐水组 4 38±5 0.261±0.011 黏性水凝胶组 4 41±13 0.281±0.012 含银黏性水凝胶组 4 73±18ab 0.289±0.008a F值 8.875 7.923 P值 <0.01 <0.05 注：与生理盐水组比较，aP<0.05；与黏性水凝胶组比较，bP<0.05 
7 3组小鼠伤后14 d全层皮肤缺损创面表皮厚度和胶原生成情况观察。7A、7B、7C.分别为生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组表皮厚度，图7A部分上皮化且上皮化后表皮较薄，图7B、7C基本上皮化，但图7C表皮较图7B厚 苏木精-伊红×100；7D、7E、7F.分别为生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组胶原生成情况，图7D胶原蛋白含量较少且胶原排列紊乱，图7E中胶原蛋白含量较图7D增多但排列仍较紊乱，图7F胶原蛋白含量较图7E增多且排列有序 Masson×2002.9 免疫组织化学分析
伤后3 d，含银黏性水凝胶组创面TGF-β1和VEGF的表达明显高于生理盐水组（P<0.05或P<0.01），黏性水凝胶组创面VEGF的表达明显高于生理盐水组（P<0.01）。伤后7 d，含银黏性水凝胶组创面TGF-β1和VEGF的表达明显高于生理盐水组（P<0.01），且TGF-β1的表达明显高于黏性水凝胶组（P<0.01）。伤后10 d，含银黏性水凝胶组创面TNF-α的表达明显低于生理盐水组（P<0.05），TGF-β1和VEGF的表达明显高于生理盐水组（P<0.05或P<0.01），且VEGF的表达明显高于黏性水凝胶组（P<0.05）。见图8, 9, 10、表5。
8 3组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面肿瘤坏死因子α（TNF-α）的阳性（棕色）表达 二氨基联苯胺-苏木精×400。8A、8B、8C.分别为生理盐水组伤后3、7、10 d TNF-α表达；8D、8E、8F.分别为黏性水凝胶组伤后3、7、10 d TNF-α表达，分别与图8A、8B、8C相近；8G、8H、8I.分别为含银黏性水凝胶组伤后3、7、10 d TNF-α表达，仅图8I中TNF-α表达明显低于图8C
9 3组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面转化生长因子β1（TGF-β1）的阳性（棕色）表达 二氨基联苯胺-苏木精×400。9A、9B、9C.分别为生理盐水组伤后3、7、10 d TGF-β1表达；9D、9E、9F.分别为黏性水凝胶组伤后3、7、10 d TGF-β1表达；9G、9H、9I.分别为含银黏性水凝胶组伤后3、7、10 d TGF-β1表达，明显高于图9A、9B、9C，图9H中TGF-β1表达明显高于图9E
10 3组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面血管内皮生长因子（VEGF）的阳性（棕色）表达 二氨基联苯胺-苏木精×400。10A、10B、10C.分别为生理盐水组伤后3、7、10 d VEGF表达；10D、10E、10F.分别为黏性水凝胶组伤后3、7、10 d VEGF表达，仅图10D中VEGF表达较图10A明显增加；10G、10H、10I.分别为含银黏性水凝胶组伤后3、7、10 d VEGF表达，分别较图10A、10B、10C明显增加，且图10I较图10F中VEGF表达明显增加表5 3组小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点3种细胞因子的表达（组别与时间点 创面数（个） TNF-α TGF-β1 VEGF 生理盐水组 12 伤后3 d 0.271±0.017 0.215±0.010 0.191±0.009 伤后7 d 0.254±0.006 0.235±0.011 0.221±0.007 伤后10 d 0.239±0.012 0.281±0.016 0.260±0.025 黏性水凝胶组 12 伤后3 d 0.275±0.017 0.229±0.007 0.225±0.005b 伤后7 d 0.245±0.014 0.253±0.005 0.243±0.016 伤后10 d 0.223±0.015 0.291±0.012 0.290±0.014 含银黏性水凝胶组 12 伤后3 d 0.302±0.021 0.234±0.010a 0.238±0.009b 伤后7 d 0.237±0.015 0.287±0.013bc 0.263±0.014b 伤后10 d 0.206±0.014a 0.316±0.013a 0.341±0.016bd F1值 3.581 4.680 37.686 P1值 >0.05 <0.05 <0.01 F2值 2.018 25.251 10.693 P2值 >0.05 <0.01 <0.01 F3值 5.884 6.551 18.302 P3值 <0.05 <0.05 <0.01 注：各组各时间点样本数均为4；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）及血管内皮生长因子（VEGF）处理因素主效应，F=0.843、29.080、48.415，P>0.05、P<0.01、P<0.01；时间因素主效应，F=48.664、114.758、98.790，P<0.01、P<0.01、P<0.01；两者交互作用，F=5.381、2.550、3.057，P>0.05、P<0.01、P<0.05；F1值、P1值，F2值、P2值，F3值、P3值分别为3组伤后3、7、10 d各指标总体比较所得；与生理盐水组相同时间点比较，aP<0.05，bP<0.01；与黏性水凝胶组相同时间点比较，cP<0.01，dP<0.05 3. 讨论
在发生创伤后，感染是造成创面难愈的主要原因之一，其中细菌感染不仅会破坏局部正常组织，还可能导致严重的并发症，所以当创面被细菌污染、定植而未发展至侵袭性感染之前，及时地抗菌，将创面床内的细菌负荷控制在临界定植水平以下十分重要。目前，最常见的抗菌材料是抗生素，但其具有耐药性，因此不得不寻求新的抗菌策略。本文设计了一种含银水凝胶，通过对透明质酸的改性，利用透明质酸、多巴胺、苯硼酸、丙烯酰胺及纳米银离子等材料制作水凝胶，用于创面治疗。
为了验证HA-DA和HA-PBA是否改性成功，对材料进行FTIR光谱测试，结果显示，HA-PBA光谱图在波数为1 369、1 425 cm-1处出现特征峰，表明苯硼酸基团已成功接枝在透明质酸上。同理，HA-DA光谱图在波数为1 516、1 431 cm-1附近出现特征峰，表明多巴胺已成功接到透明质酸上。本研究中制作的黏性水凝胶在37 ℃下无论是倾斜还是倒立时都保持稳定不流动的凝胶状态。流变性能检测结果显示，随着丙烯酰胺含量的增加，黏性水凝胶储存模量和损耗模量均有所增加，表明随着交联密度的增加，凝胶存在更好的黏弹性质，并且同一种水凝胶的储存模量始终大于损耗模量，表现为凝胶状态。另外，3种不同丙烯酰胺含量水凝胶的储存模量和损耗模量随振荡频率或时间的增加而不发生明显变化，再一次证明了凝胶的稳定性。本研究还制备了含银黏性水凝胶，并检测了其银离子释放性能，超过1周的检测结果显示，制备的含银黏性水凝胶中银离子的释放能长达7 d。纳米银本身即具有缓释性能，水凝胶更是控制其释放快慢的关键，由此证明制备的负载纳米银的水凝胶具有稳定且长时间的银离子持续释放能力。本研究还采用CCK-8法检测含银黏性水凝胶的细胞毒性，结果表明，培养3 d内，含银黏性水凝胶组细胞存活率明显低于其余2组，但3组细胞存活率都接近或超过80％，证明含银黏性水凝胶的细胞毒性较低。
为了进一步评估水凝胶对创面愈合的影响，本研究进一步进行了动物实验。在小鼠创面上种植金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，以达到细菌定植的目的，结果显示，随着伤后时间的延长，3组创面均不断缩小。伤后3~10 d，黏性水凝胶组和含银黏性水凝胶组创面边缘收缩程度较生理盐水组明显增加，且前2组创面愈合率明显高于生理盐水组；至伤后14 d，含银黏性水凝胶组创面完全闭合，而生理盐水组和黏性水凝胶组创面仍存在部分未愈合，且含银黏性水凝胶组创面愈合率明显高于生理盐水组。上述结果说明黏性水凝胶可在一定程度上促进创面愈合，这是因为黏性水凝胶能够吸收创面的渗液，同时保持创面的湿润性和密封性，从而为创面提供良好的愈合环境；而含银黏性水凝胶中的银离子在创面愈合过程中也发挥了重要作用，可进一步促进创面愈合。
众所周知，在创面修复的早期阶段，积极控制创面细菌负荷对于创面修复是非常重要的，细菌负荷得到控制，将会促进创面的有效愈合。伤后3 d创面细菌负载量最能说明制备的材料在体内的抗菌作用［24］，因此取各组伤后3 d的创面组织进行菌落分布检测。结果显示，含银黏性水凝胶组创面中金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌菌落数明显少于生理盐水组和黏性水凝胶组，说明含银水凝胶可以通过阻止外部细菌进入并杀灭敷料中的细菌，来促进创面愈合。同时，减少细菌负荷可以防止促炎性细胞因子和LPS的积累，从而促进TGF-β等生长因子的产生，这对创面进入增生期非常重要。由此可见，含纳米银的水凝胶敷料对创面细菌有抑制或杀灭作用，可以加速创面的修复。
取伤后14 d创面组织进行HE染色，可见含银黏性水凝胶组此时已经进入创面修复的成熟期，创面中含有大量成熟的毛细血管，完整的表皮层与真皮层紧密相连形成基底层，生理盐水组和黏性水凝胶组也均形成明显的表皮层，但含银黏性水凝胶组创面可见毛囊和皮脂腺等皮肤附属器官，与正常皮肤组织最为接近［25, 26］。相比于另2组，含银黏性水凝胶组创面新生上皮明显更厚。Masson染色可见，含银黏性水凝胶组创面伤后14 d已进入成熟期，胶原蛋白重组，胶原纤维束明显增粗，排列更加规则有序；而不含银的黏性水凝胶组创面胶原蛋白含量增多但排列仍较紊乱，说明水凝胶本身对创面修复的再上皮化及胶原形成作用不大，而负载银离子的水凝胶可以更好地帮助组织增生、纤维重塑，从而进一步促进创面愈合。
TNF-α被称为前炎症细胞因子，是启动抗菌炎症反应的关键细胞因子。本研究结果显示，3组创面TNF-α表达在创面愈合的早期即炎症期均升高，而在中后期逐渐下降。伤后3 d为创面愈合早期即炎症期，白细胞由以中性粒细胞为主转为以M1型巨噬细胞为主，以吞噬细菌及异物；巨噬细胞不仅攻击微生物，还能分泌大量炎症细胞因子，如IL-6、IL-1β、TNF-α等。大量炎症细胞渗出聚集可释放一系列炎症因子及生长因子，促进细胞迁移、增殖，启动组织的修复。本研究结果显示，3组创面伤后3 d的TNF-α的表达均较高，尤其是含银黏性水凝胶组，可能是因为该组最早进入炎症反应阶段。伤后7 d为创面修复的中期即增生期，若此时创面仍处于持续的炎症状态，以及炎症细胞处于过度积累和激活状态，将会导致免疫调节机制失控，从而加重组织损伤程度，使炎症期延长，导致创面愈合不佳。但结果显示，伤后7 d的3组创面中TNF-α的表达均较伤后3 d下降，尤其是含银黏性水凝胶组下降最多，可能是因为该组更快进入炎症消退阶段。伤后10 d，3组创面中TNF-α表达进一步下降，且含银黏性水凝胶组创面中TNF-α表达明显低于生理盐水组，可能是因为该组最早结束炎症期。
TGF-β1可以使Fb和炎症细胞向创面聚集，诱导肉芽组织生长、上皮化和胶原沉积，是一类对创面修复有重要调控作用的多功能生长因子。在创面愈合的增生期即伤后5~7 d，M1型巨噬细胞比例减少，M2型巨噬细胞比例增加，TNF-α等促炎细胞因子分泌减少，M2型巨噬细胞分泌大量抗炎细胞因子，如TGF-β1。TGF-β1一方面能够促进Fb的增殖和胶原的沉积，另一方面能够抑制ECM的降解，进而促进组织的修复。本研究结果显示，伤后3、7、10 d含银黏性水凝胶组创面中TGF-β1的表达明显高于生理盐水组，且伤后7 d明显高于黏性水凝胶组，可能是因为该组最早产生抗炎效应且作用最强。
VEGF具有促进血管通透性增加，血管内皮细胞迁移、增殖和促进成熟血管形成等作用。本研究结果显示，3组创面VEGF表达在增生期都随时间进程逐渐升高；伤后3、7、10 d含银黏性水凝胶组创面中VEGF的表达皆明显高于生理盐水组，且伤后10 d明显高于黏性水凝胶组，同时伤后3 d黏性水凝胶组创面中VEGF的表达明显高于生理盐水组，说明水凝胶本身可能有一定的促进血管生成的作用，而含银黏性水凝胶可以在很大程度上促进血管生成。
综上所述，本研究完成了一种抗菌水凝胶的合成，该水凝胶具有良好的弹性和稳定性。除此之外，它能够促进创面的愈合，并且具有促进创面再上皮化、胶原沉积和血管生成等积极作用，同时能在促炎和抗炎的过程中起到平衡调节作用，为抗菌材料的选择提供了新的思路。
所有作者均声明不存在利益冲突 -
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1 HA-DA和HA-PBA的红外光谱图显示苯硼酸、多巴胺已成功接到透明质酸上
注：黑色线为透明质酸，红色线为多巴胺，黄色线为苯硼酸，蓝色线为多巴胺修饰的透明质酸（HA-DA），绿色线为苯硼酸修饰的透明质酸（HA-PBA）；HA-PBA光谱图上2个箭头分别表示在波数为1 369、1 425 cm-1附近出现归因于B-O键和芳香化合物C-C键的特征峰，HA-DA光谱图上2个箭头分别表示在波数为1 516、1 431 cm-1附近出现归因于芳香化合物C-C键的特征峰
3 3种不同丙烯酰胺含量黏性水凝胶的储存模量和损耗模量。3A.储存模量和损耗模量随振荡频率变化不明显；3B.储存模量和损耗模量随时间变化不明显
注：该图为经过lg处理的数据形成的描记图;坐标轴数据为未经lg处理的原始数据；黑色、绿色、浅蓝色分别为含质量分数10％、15％、20％丙烯酰胺黏性水凝胶的储存模量；红色、深蓝色、紫色分别为含质量分数10％、15％、20％丙烯酰胺黏性水凝胶的损耗模量
5 3组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合情况。5A、5B、5C、5D.分别为生理盐水组伤后3、7、10、14 d创面情况，创面逐渐缩小；5E、5F、5G、5H.分别为黏性水凝胶组伤后3、7、10、14 d创面情况，图5E、5F、5G、5H中创面分别较图5A、5B、5C、5D有所缩小；5I、5J、5K、5L.分别为含银黏性水凝胶组伤后3、7、10、14 d创面情况，图5I、5J、5K、5L中创面分别较图5E、5F、5G、5H有所缩小，较图5A、5B、5C、5D明显缩小
6 3组小鼠伤后3 d全层皮肤缺损创面中金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌菌落分布情况。6A、6B、6C.分别为生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组金黄色葡萄球菌菌落情况，图6B中细菌菌落数较图6A中明显减少，图6C中细菌菌落数较图6A、6B明显减少；6D、6E、6F.分别为生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组大肠埃希菌菌落情况，图6E中细菌菌落数较图6D明显减少，图6F中细菌菌落数较图6D、6E明显减少
7 3组小鼠伤后14 d全层皮肤缺损创面表皮厚度和胶原生成情况观察。7A、7B、7C.分别为生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组表皮厚度，图7A部分上皮化且上皮化后表皮较薄，图7B、7C基本上皮化，但图7C表皮较图7B厚 苏木精-伊红×100；7D、7E、7F.分别为生理盐水组、黏性水凝胶组、含银黏性水凝胶组胶原生成情况，图7D胶原蛋白含量较少且胶原排列紊乱，图7E中胶原蛋白含量较图7D增多但排列仍较紊乱，图7F胶原蛋白含量较图7E增多且排列有序 Masson×200
8 3组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面肿瘤坏死因子α（TNF-α）的阳性（棕色）表达 二氨基联苯胺-苏木精×400。8A、8B、8C.分别为生理盐水组伤后3、7、10 d TNF-α表达；8D、8E、8F.分别为黏性水凝胶组伤后3、7、10 d TNF-α表达，分别与图8A、8B、8C相近；8G、8H、8I.分别为含银黏性水凝胶组伤后3、7、10 d TNF-α表达，仅图8I中TNF-α表达明显低于图8C
9 3组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面转化生长因子β1（TGF-β1）的阳性（棕色）表达 二氨基联苯胺-苏木精×400。9A、9B、9C.分别为生理盐水组伤后3、7、10 d TGF-β1表达；9D、9E、9F.分别为黏性水凝胶组伤后3、7、10 d TGF-β1表达；9G、9H、9I.分别为含银黏性水凝胶组伤后3、7、10 d TGF-β1表达，明显高于图9A、9B、9C，图9H中TGF-β1表达明显高于图9E
10 3组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面血管内皮生长因子（VEGF）的阳性（棕色）表达 二氨基联苯胺-苏木精×400。10A、10B、10C.分别为生理盐水组伤后3、7、10 d VEGF表达；10D、10E、10F.分别为黏性水凝胶组伤后3、7、10 d VEGF表达，仅图10D中VEGF表达较图10A明显增加；10G、10H、10I.分别为含银黏性水凝胶组伤后3、7、10 d VEGF表达，分别较图10A、10B、10C明显增加，且图10I较图10F中VEGF表达明显增加
表1 3组小鼠成纤维细胞L929培养各时间点存活率比较（％，
组别 样本数 1 d 2 d 3 d PBS组 15 97.2±1.1 96.3±0.8 96.0±2.4 黏性水凝胶组 15 93.5±1.3a 93.7±2.3 93.7±2.1 含银黏性水凝胶组 15 84.5±1.4ab 87.3±2.7ab 89.0±2.4ac F值 125.553 24.807 12.084 P值 <0.01 <0.01 <0.01 注：各组各时间点样本数为5；PBS为磷酸盐缓冲液；处理因素主效应，F=95.869，P<0.01；时间因素主效应，F=1.310，P>0.05；两者交互作用，F=2.971，P>0.05；与PBS组比较，aP<0.01；与黏性水凝胶组比较，bP<0.01,cP<0.05 
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表2 3组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合率比较（%，
组别 创面数（个） 3 d 7 d 10 d 14 d 生理盐水组 4 21.8±6.4 53.9±8.2 72.0±7.8 92.5±0.4 黏性水凝胶组 4 43.5±2.4a 66.9±3.6 88.3±2.2a 94.1±1.5 含银黏性水凝胶组 4 53.0±3.6ab 75.3±6.9a 93.3±1.2a 96.7±0.8ab F值 51.107 10.841 22.303 17.740 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 注：处理因素主效应，F=73.626，P<0.01；时间因素主效应，F=328.066，P<0.01；两者交互作用，F=6.461，P<0.01；与生理盐水组比较，aP<0.01；与黏性水凝胶组比较，bP<0.05
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表3 3组小鼠伤后3 d全层皮肤缺损创面大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌落数比较（CFU/mL，
组别 创面数（个） 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生理盐水组 4 （3.1±0.7）×108 （7.3±0.7）×105 黏性水凝胶组 4 （2.0±0.4）×108 a （6.1±0.5）×105 a 含银黏性水凝胶组 4 （3.0±0.4）×104 bc （9.0±1.3）×102 bc F值 39.881 255.464 P值 <0.01 <0.01 注：CFU为集落形成单位；与生理盐水组比较，aP<0.05，bP<0.01；与黏性水凝胶组比较，cP<0.01
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表4 3组小鼠伤后14 d全层皮肤缺损创面表皮厚度和胶原纤维光密度比较（
组别 创面数（个） 表皮厚度（μm） 胶原纤维光密度 生理盐水组 4 38±5 0.261±0.011 黏性水凝胶组 4 41±13 0.281±0.012 含银黏性水凝胶组 4 73±18ab 0.289±0.008a F值 8.875 7.923 P值 <0.01 <0.05 注：与生理盐水组比较，aP<0.05；与黏性水凝胶组比较，bP<0.05
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表5 3组小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点3种细胞因子的表达（
组别与时间点 创面数（个） TNF-α TGF-β1 VEGF 生理盐水组 12 伤后3 d 0.271±0.017 0.215±0.010 0.191±0.009 伤后7 d 0.254±0.006 0.235±0.011 0.221±0.007 伤后10 d 0.239±0.012 0.281±0.016 0.260±0.025 黏性水凝胶组 12 伤后3 d 0.275±0.017 0.229±0.007 0.225±0.005b 伤后7 d 0.245±0.014 0.253±0.005 0.243±0.016 伤后10 d 0.223±0.015 0.291±0.012 0.290±0.014 含银黏性水凝胶组 12 伤后3 d 0.302±0.021 0.234±0.010a 0.238±0.009b 伤后7 d 0.237±0.015 0.287±0.013bc 0.263±0.014b 伤后10 d 0.206±0.014a 0.316±0.013a 0.341±0.016bd F1值 3.581 4.680 37.686 P1值 >0.05 <0.05 <0.01 F2值 2.018 25.251 10.693 P2值 >0.05 <0.01 <0.01 F3值 5.884 6.551 18.302 P3值 <0.05 <0.05 <0.01 注：各组各时间点样本数均为4；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β1（TGF-β1）及血管内皮生长因子（VEGF）处理因素主效应，F=0.843、29.080、48.415，P>0.05、P<0.01、P<0.01；时间因素主效应，F=48.664、114.758、98.790，P<0.01、P<0.01、P<0.01；两者交互作用，F=5.381、2.550、3.057，P>0.05、P<0.01、P<0.05；F1值、P1值，F2值、P2值，F3值、P3值分别为3组伤后3、7、10 d各指标总体比较所得；与生理盐水组相同时间点比较，aP<0.05，bP<0.01；与黏性水凝胶组相同时间点比较，cP<0.01，dP<0.05
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