Effects and mechanism of annexin A1-overexpressing human adipose-derived mesenchymal stem cells in the treatment of mice with acute respiratory distress syndrome
-
摘要:
目的 探索过表达膜联蛋白A1（ ANXA1）的人脂肪间充质干细胞（AMSC）治疗急性呼吸窘迫综合征（ARDS）小鼠的效果及其机制。 方法 采用实验研究方法。采用流式细胞术鉴定成人AMSC后，取第3代细胞进行后续实验。采用随机数字表法（分组方法下同），将细胞分为转染含 ANXA1基因RNA序列的质粒的过表达ANXA1组、转染对应空载质粒的空载对照组，另取细胞分为转染含 ANXA1基因小干扰RNA序列的质粒的敲减ANXA1组、转染对应空载质粒的空载对照组，转染后72 h，于荧光显微镜成像系统下观察荧光表达情况，分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法检测ANXA1的蛋白和mRNA表达（样本数均为3）。取50只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠，分为假伤组、单纯ARDS组、正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组，每组10只。将后4组小鼠均用内毒素/脂多糖制成ARDS肺损伤模型，假伤组小鼠模拟致假伤。伤后即刻，假伤组、单纯ARDS组小鼠均经尾静脉注射生理盐水，正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组小鼠对应注射正常AMSC、过表达 ANXA1的AMSC、敲减 ANXA1的AMSC。注射后24 h，取每组5只小鼠，行伊文思蓝染色观察右肺组织大体染色情况，采用酶标仪检测左肺支气管肺泡灌洗液（BALF）上清液的吸光度值，了解肺血管通透性。注射后3 d，取各组剩余5只小鼠，取右肺组织，行苏木精-伊红染色观察病理学变化，行免疫组织化学染色观察CD11b和F4/80阳性巨噬细胞情况；采用酶联免疫吸附测定法检测左肺BALF上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）和IL-1β水平。对数据行配对样本 t检验、单因素方差分析与LSD检验。 结果 转染后72 h，过表达ANXA1组与敲减ANXA1组AMSC均分别较对应空载对照组AMSC表达更高强度的荧光。转染后72 h，与对应空载对照组比较，过表达ANXA1组AMSC中ANXA1蛋白与mRNA表达均明显增多（ t值分别为249.80、6.56， P<0.05），敲减ANXA1组AMSC中ANXA1蛋白与mRNA表达均明显减少（ t值分别为176.50、18.18， P<0.05）。注射后24 h，与假伤组（BALF上清液的吸光度值为0.041±0.009）比较，单纯ARDS组小鼠肺组织明显蓝染且BALF上清液的吸光度值（0.126±0.022）明显升高（ P<0.05）；与单纯ARDS组比较，正常细胞组、过表达ANXA1组小鼠肺组织蓝染程度明显减轻且BALF上清液的吸光度值（0.095±0.020、0.069±0.015）明显降低（ P<0.05），敲减ANXA1组小鼠肺组织蓝染程度与BALF上清液的吸光度值（0.109±0.016， P>0.05）无明显变化；与正常细胞组比较，过表达ANXA1组小鼠BALF上清液的吸光度值明显降低（ P<0.05）。注射后3 d，单纯ARDS组小鼠肺组织结构较假伤组明显损伤；与单纯ARDS组比较，正常细胞组和过表达ANXA1组小鼠肺组织出血、炎症细胞浸润、肺泡萎陷及间质增宽程度等改变均明显减轻，敲减ANXA1组小鼠前述肺组织表现未明显改善。注射后3 d，单纯ARDS组小鼠肺组织中CD11b和F4/80阳性巨噬细胞数量均较假伤组明显增多；与单纯ARDS组比较，正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组小鼠肺组织中CD11b和F4/80阳性巨噬细胞数量均减少，以过表达ANXA1组减少最明显。注射后3 d，与假伤组比较，单纯ARDS组小鼠BALF上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高（ P<0.05）；与单纯ARDS组比较，正常细胞组、过表达ANXA1组小鼠BALF上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平以及敲减ANXA1组小鼠BALF上清液中IL-1β水平均明显降低（ P<0.05）；与正常细胞组比较，过表达ANXA1组小鼠BALF上清液中TNF-α水平明显降低（ P<0.05），敲减ANXA1组小鼠BALF上清液中TNF-α水平明显升高（ P<0.05）。 结论 过表达 ANXA1可以优化AMSC在ARDS治疗中的效果，增强该类细胞抑制炎症反应和改善肺血管通透性的作用，进而缓解ARDS小鼠的肺损伤。 Abstract:Objective To explore the effects and mechanism of annexin A1 ( ANXA1)-overexpressing human adipose-derived mesenchymal stem cells (AMSCs) in the treatment of mice with acute respiratory distress syndrome (ARDS). Methods The experimental study method was adopted. After the adult AMSCs were identified by flow cytometry, the 3 rd passage cells were selected for the follow-up experiments. According to the random number table (the same grouping method below), the cells were divided into ANXA1-overexpressing group transfected with plasmid containing RNA sequences of ANXA1 gene and no-load control group transfected with the corresponding no-load plasmid. The other cells were divided into ANXA1-knockdown group transfected with plasmid containing small interfering RNA sequences of ANXA1gene and no-load control group transfected with the corresponding no-load plasmid. At post transfection hour (PTH) 72, the fluorescence expression was observed under a fluorescence microscope imaging system, and the protein and mRNA expressions of ANXA1 were detected by Western blotting and real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction respectively (with the sample numbers being 3). Fifty male C57BL/6J mice aged 6-8 weeks were divided into sham injury group, ARDS alone group, normal cell group, ANXA1-overexpressing group, and ANXA1-knockdown group, with 10 mice in each group. Mice in the last 4 groups were treated with endotoxin/lipopolysaccharide to make ARDS lung injury model, and mice in sham injury group were simulated to cause false injury. Immediately after injury, mice in sham injury group and ARDS alone group were injected with normal saline through the tail vein, while mice in normal cell group, ANXA1-overexpressing group, and ANXA1-knockdown group were injected with normal AMSCs, ANXA1-overexpressing AMSCs, and ANXA1-knockdown AMSCs, correspondingly. At post injection hour (PIH) 24, 5 mice in each group were selected, the Evans blue staining was performed to observe the gross staining of the right lung tissue, and the absorbance value of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) supernatant of left lung was detected by microplate reader to evaluate the pulmonary vascular permeability. Three days after injection, the remaining 5 mice in each group were taken, the right lung tissue was collected for hematoxylin-eosin staining to observe the pathological changes and immunohistochemical staining to observe the CD11b and F4/80 positive macrophages, and the levels of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), and IL-1β in BALF supernatant of left lung were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Data were statistically analyzed with paired sample t test, one-way analysis of variance, and least significant difference test. Results At PTH 72, AMSCs in both ANXA1-overexpressing group and ANXA1-knockdown group expressed higher fluorescence intensity than AMSCs in corresponding no-load control group, respectively. At PTH 72, compared with those in corresponding no-load control group, the protein and mRNA expressions of ANXA1 in ANXA1-overexpressing group were significantly increased (wth t values of 249.80 and 6.56, respectively, P<0.05), while the protein and mRNA expressions of ANXA1 in ANXA1-knockdown group were significantly decreased (wth t values of 176.50 and 18.18, respectively, P<0.05). At PIH 24, compared with those in sham injury group (with the absorbance value of BALF supernatant being 0.041±0.009), the lung tissue of mice in ARDS alone group was obviously blue-stained and the absorbance value of BALF supernatant (0.126±0.022) was significantly increased ( P<0.05). Compared with those in ARDS alone group, the degree of blue-staining in lung tissue of mice was significantly reduced in normal cell group or ANXA1-overexpressing group, and the absorbance values of BALF supernatant (0.095±0.020 and 0.069±0.015) were significantly decreased ( P<0.05), but the degree of blue-staining in lung tissue and the absorbance value of BALF supernatant (0.109±0.016, P>0.05) of mice in ANXA1-knockdown group had no significant change. Compared with that in normal cell group, the absorbance value of BALF supernatant of mice in ANXA1-overexpressing group was significantly decreased ( P<0.05). Three days after injection, the lung tissue structure of mice in ARDS alone group was significantly damaged compared with that in sham injury group. Compared with those in ARDS alone group, hemorrhage, infiltration of inflammatory cells, alveolar collapse, and interstitial widening in the lung tissue of mice were significantly alleviated in normal cell group and ANXA1-overexpressing group, while no significant improvement of above-mentioned lung tissue manifestation was observed in ANXA1-knockdown group. Three days after injection, the numbers of CD11b and F4/80 positive macrophages in the lung tissue of mice in ARDS alone group were significantly increased compared with those in sham injury group. Compared with those in ARDS alone group, the numbers of CD11b and F4/80 positive macrophages in lung tissue of mice in normal cell group, ANXA1-overexpressing group, and ANXA1-knockdown group reduced, with the most significant reduction in ANXA1-overexpressing group. Three days after injection, compared with those in sham injury group, the levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β in BALF supernatant of mice in ARDS alone group were significantly increased ( P<0.05). Compared with those in ARDS alone group, the levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β in BALF supernatant of mice in normal cell group and ANXA1-overexpressing group, as well as the level of IL-1β in BALF supernatant of mice in ANXA1-knockdown group were significantly decreased ( P<0.05). Compared with that in normal cell group, the level of TNF-α in BALF supernatant of mice was significantly decreased in ANXA1-overexpressing group ( P<0.05) but significantly increased in ANXA1-knockdown group ( P<0.05). Conclusions Overexpression of ANXA1 can optimize the efficacy of AMSCs in treating ARDS and enhance the effects of these cells in inhibiting inflammatory response and improving pulmonary vascular permeability, thereby alleviating lung injury of mice with ARDS. -
烧伤是常见的损伤之一，我国每年有数十万人因为烧伤而致残或致畸。烧伤后病理性瘢痕组织的形成是烧伤患者康复过程中的重要并发症之一，不仅严重影响患者的外观，而且可引起器官及组织的功能障碍，严重影响患者生活质量及身心健康［1］。对于瘢痕产生的机制，目前在微观方面的研究仅涉及细胞因子、ECM等，而其分子机制尚不十分明确［2］。
有研究显示，青光眼滤过术后使用表观遗传修饰可减少瘢痕组织的产生［3］，表明瘢痕产生的过程中可能存在表观遗传改变。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰机制，可在不改变DNA序列的情况下改变基因表达量［4, 5］。甲基化水平的高低会显著影响蛋白的最终翻译。生物信息学分析是一项新兴的研究方法，可结合测序数据进行全基因组分析，有针对性地寻找与疾病相关的基因或基因集［6, 7］。甲基化研究在瘢痕中较为常见，但检索显示以生物信息学为基础，探究甲基化与瘢痕形成关系的研究罕见，因此以生物信息学为基础探讨甲基化与瘢痕形成的关系显得十分必要。
加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）可对大量芯片来源的基因数据进行有效分析，是生物信息学研究的重要工具［8］。本观察性研究使用WGCNA对正常组织和瘢痕组织的mRNA表达谱进行分析并结合甲基化数据集对选定模块内的基因进行甲基化状态判断，对烧伤后瘢痕组织形成的分子机制进行探讨，并使用支持向量机（support vector machine，SVM）模型进行进一步验证，为临床治疗烧伤后瘢痕组织提供新思路。
1. 资料及方法
1.1 数据收集
从美国国家生物技术信息中心基因表达综合数据库（
https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ）内检索并下载相关数据集，即检索基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）中烧伤后瘢痕组织相关数据集，结果显示mRNA数据集GSE136906及甲基化数据集GSE137134是同一批次的12个样本（均由澳大利亚大学生物医学院烧伤研究组上传，每个数据集均为6个样本），分别进行了mRNA测序和甲基化测序，因此纳入本研究；数据集GSE108110在剩余数据集中样本量相对较大，因此纳入SVM及建模分析（表1）。表1 烧伤后瘢痕组织相关数据集的详细信息数据集 测序平台 Affymetrix eneChip文件 样本数（个） 瘢痕数（个） GSE137134 GPL13534-11288 1 6 6 GSE136906 GPL16686 2 6 6 GSE108110 GPL570 3 9 9 注：1、2、3分别为Illumina HumanMethylation450 BeadChip (HumanMethylation450_15017482)、[HuGene-2_0-st] Affymetrix Human Gene 2.0 ST Array [transcript (gene) version]、[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 1.2 GEO数据集的分析
下载GSE137134与GSE136906数据集并将数据集中的探针代码转换成基因符号。使用R语言中的“Limma”软件包寻找GSE137134中瘢痕组织与正常组织的差异甲基化基因（differentially methylated genes，DMG）和GSE136906中的差异表达基因（differently expressed genes，DEG），即寻找P<0.05相关基因并记录，将这些基因纳入WGCNA分析。
1.3 WGCNA构建及临床相关性分析
使用R语言软件中的“FlashClust”软件包对样本进行聚类分析。使用“pickSoftThreshold”函数来调节参数β的权重以尽量符合无尺度网络。使用WGCNA软件包将有相关性和相邻关系的DMG计算成为拓扑重叠矩阵（opological overlap matrix， TOM）并计算其相应的相异度1-TOM。使用1-TOM作为距离度量，进行分层聚类以识别模块。设定模块内最少的基因个数为30个，将高度相似的模块通过聚类标记并合并。使用“plotDendroAndColors”函数对基因模块进行可视化，并选取模块内基因绘制热图。将临床特征和模块内的基因联合分析，寻找与瘢痕组织密切相关的模块并探究模块内基因的生物学意义，对生成模块与临床特征之间的相关性热图进行聚类。
1.4 模块内基因功能富集分析
使用Metascape数据库和基因探针富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）软件对模块内的基因进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析和注释。
1.5 模块内基因甲基化状态的探究
基于瘢痕组织mRNA数据集GSE136906及其甲基化数据集GSE137134属于同一批次的样本，本研究利用数据集GSE136906探究模块内基因的甲基化状态。使用Funrich软件将模块内高甲基化状态的基因与低表达的基因取交集，将模块内低甲基化状态的基因与高表达的基因取交集，在交集内的基因是具有异常甲基化状态的基因。
1.6 统计学处理
依据受试者操作特征（ROC）曲线下面积，评估基因的诊断价值。使用数据集GSE136906及GSE108110进行机器学习，将这2个数据集内异常甲基化基因的表达量依次纳入SVM模型并进行标准化，构建SVM分类器，使用交叉验证的方法选取惩罚参数c和核函数参数g，随机选取2/3的样本作为训练集，其余1/3则作为验证集，当SVM分类器的效能达到90%时则不再纳入新基因。
使用SPSS 22.0、GraphPad Prism 8统计软件进行数据处理及统计学分析，使用Matlab软件进行支持向量机模型构建，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 WGCNA网络构建及临床相关性分析
从数据集GSE136906中筛选出1 061个DEG，见图1。从数据集GSE137134中筛选出16 141个DMG。聚类结果显示没有明显离群的样本，因此2个数据集中12个样本均被纳入共表达网络。“pickSoftThreshold”函数的结果显示，当权重参数β=9时，log（k）与log ［p（k）］之间相关系数的平方>0.9，k表示节点的连接度，p（k）表示WGCNA网络具有无标度网络的特征。选取软阈值β=9来构建WGCNA网络（图2）。模块的相关性热图与聚类分析展示在图3中。筛选后得到10个相应的模块，临床相关性结果显示棕色模块与瘢痕组织形成相关性较高（图4），该模块内共有2 646个基因。在所有相关系数>0.7的模块中，棕色模块内基因数目最多，因此选择该模块进行进一步研究。
1 GSE136906数据集中烧伤后瘢痕和正常组织的差异表达基因火山图注： P-value为差异表达分析后未经校正的P值，Fold change为瘢痕组织与正常组织差异表达倍数；图中绿色为低表达且差异有统计学意义的基因，红色为高表达且差异有统计学意义的基因,黑色为差异无统计学意义的基因
3 加权基因共表达网络分析网络模块之间的相互作用注：MEgreen、MEbrown、MEturquoise、MEmagenta、MEpink、MEblack、MEyellow、MEblue、MEred分别表示绿、棕、蓝绿、洋红、粉、黑、黄、蓝、红色模块；图中横向刻度值为各模块聚类分析相对聚类距离；图中纵向刻度值为数据模块色值
4 烧伤后瘢痕组织临床特征与模块之间的关联注：图左侧标注为加权基因共表达网络分析结果所示颜色模块名称；模块中数据表示对应加权基因共表达网络分析模块与临床性状的相关性系数以及其对应P值，括号内为P值2.2 棕色模块中基因功能富集分析
GO分析结果显示，模块内的基因主要富集在“α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑-丙酸酯选择性谷氨酸受体活性的调控”“雄激素受体信号通路的调控”等，见图5A。KEGG通路富集分析结果显示，模块内的基因主要与“细胞因子-细胞因子受体相互作用”“过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路”等相关，见图5B。Metascape分析结果显示，模块内基因主要富集在“急性粒细胞白血病”“半胱氨酸型内肽酶抑制剂的活性”“胰岛素分泌的正调节”等方面，见图6。富集分析结果表明，这些基因可通过细胞因子受体、胰岛素受体等调节瘢痕组织。
5 对烧伤后瘢痕组织相关性高的模块通过基因探针富集分析进行基因功能和通路分析。5A.基因本体论功能富集；5B.京都基因与基因组百科全书功能富集注：图5A中的绿、棕、蓝、黑、浅棕、紫色曲线分别表示对核因子κB导入细胞核的负向调节、对白细胞介素1产生的正向调节、对α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑-丙酸酯选择性谷氨酸受体的活性调控、雄激素受体信号通路调控、脂肪酸氧化的调控、泛酸样蛋白结合酶的调节通路，图5B中的绿、棕、蓝、黑、浅棕色曲线分别表示细胞因子-细胞因子受体的相互作用、Janus激酶/信号转导与转录激活子信号通路、泛酸和辅酶A生物合成、过氧化物酶体增殖物激活受体信号途径、转化生长因子β信号途径
6 对烧伤后瘢痕组织相关性高的模块通过Metascape数据库进行基因功能和通路分析。6A.基因本体论功能富集；6B. 京都基因与基因组百科全书功能富集注：P-value为差异表达分析后未经校正的P值；图6A的红、蓝、绿、紫、橙、黄、棕、浅紫、灰、浅绿、浅黄、浅紫、浅橙色圆点分别与图6B从上至下的条带一一对应，依次表示急性粒细胞白血病、半胱氨酸型内肽酶抑制剂的活性、胰岛素分泌的正调节、突触膜、脂肪细胞分化、高尔基体膜、参与免疫反应的水解酶激活、溶酶体膜、参与免疫反应的白细胞激活、核包膜、神经发生正向调节、中毒反应、心脏发育通路2.3 棕色模块内基因甲基化状态
共有35个具有异常甲基化状态的基因，其中的高表达-低甲基化基因21个（图7A、7B），低表达-高甲基化基因14个（图7C、7D）。
7 烧伤后瘢痕组织差异表达甲基化基因的热图。7A.21个高表达-低甲基化基因的热图；7B.14个低表达-高甲基化基因的热图注：“type”表示组织类型，“N”表示正常组织，“S”表示瘢痕组织2.4 统计分析结果
ROC曲线分析结果显示，CCR2、LMO7、STEAP4、NNAT、TCF7L2、ZC3H12B等基因具有较好的瘢痕诊断效能，其曲线下面积（AUC）值居于前列。见表2。
表2 烧伤后瘢痕组织与正常组织异常甲基化基因受试者操作特征曲线下面积及P值基因 曲线下面积 P值 CCR2 0.972 <0.001 LMO7 0.972 0.011 STEAP4 0.972 <0.001 NNAT 0.944 <0.001 TCF7L2 0.944 0.003 ZC3H12B 0.944 0.010 AMPD3 0.917 <0.001 BTBD17 0.917 0.039 PRICKLE1 0.917 <0.001 将这些基因按照AUC值从大到小依次纳入SVM模型中，当纳入CCR2、LMO7、STEAP4、NNAT和TCF7L2这5个基因时，惩罚参数c和核函数参数g都<0.01，此时构建的分类器模型分类准确率为93.3%，表明上述基因有较好的分类功能（图8）。
8 烧伤后瘢痕组织差异表达甲基化基因的数据展示及5个差异甲基化基因可视图。8A、8B、8C、8D、8E、8F.分别为数据的整体展示及TCF7L2、NNAT、LMO7、CCR2和STEAP4基因的分维可视化图3. 讨论
烧伤是临床上常见的疾病，其中相当一部分患者为深Ⅱ度及以上烧伤。瘢痕是烧伤后康复期患者最常见的并发症之一，该疾病会严重影响患者的外貌和生活质量。因此，探究烧伤后瘢痕组织的形成机制并寻找潜在的治疗靶点对改善烧伤患者的预后具有重要意义。本研究利用WGCNA分析寻找与烧伤后瘢痕形成相关的基因模块，并探究了模块内的基因生物功能和甲基化状态，该研究为治疗烧伤后瘢痕提供了有意义的临床参考价值。
根据富集分析的结果，棕色模块内的基因具有“雄激素受体信号通路的调控”功能，因此本研究认为雄激素受体在瘢痕组织生成过程中具有一定作用；且由于DNA甲基化状态的改变，该通路状态发生改变。而Schierle等［9］研究结果显示，雄激素受体DNA的含量在瘢痕组织与正常组织之间具有显著差异；同时指出抗雄激素物质可通过竞争结合雄激素受体导致瘢痕组织中Ⅰ型前胶原mRNA低表达，因此本研究认为抗雄激素物质具有治疗瘢痕的潜力。“细胞因子-细胞因子受体相互作用”在KEGG分析中被富集到，研究表明多种细胞因子如血管源性生长因子、IL家族等对瘢痕生成有重要影响［10, 11, 12, 13］。因此本研究认为模块内的基因可调节细胞因子受体，与微环境内的细胞因子相互作用并诱导瘢痕组织的形成。Metascape数据库的分析显示，“胰岛素分泌的正调节”被显著富集，表明这些异常甲基化的基因可能导致胰岛素相关通路的改变。因此本研究认为胰岛素在瘢痕生成方面具有重要作用，Hallam等［14］进行的一项随机对照实验显示，皮下注射胰岛素可减少瘢痕产生。因此，本研究认为胰岛素注射也可作为瘢痕治疗的潜在疗法。
在棕色模块内共显示了35个异常甲基化基因，其中CCR2、LMO7、STEAP4、NNAT和TCF7L2具有良好的瘢痕诊断效能并被纳入到SVM模型中。CCR2编码单核细胞趋化蛋白-1，Frik等［15］研究显示CCR2敲除小鼠脑损伤后单核细胞浸润减少且瘢痕形成减少。本研究中观察到瘢痕组织中CCR2是高表达的，推测CCR2可诱导瘢痕产生，是瘢痕治疗的潜在靶点。本研究结果显示LMO7在瘢痕组织中高表达，推测LMO7可促进瘢痕组织产生。Xie等［16］研究表明LMO7由TGF-β诱导并通过TGF-β途径负反馈调节在伤口愈合和瘢痕生成中发挥重要作用，这与本研究结果一致。STEAP4、NNAT和TCF7L2则未见相应报道，其在瘢痕产生中的作用可能需要进一步实验研究进行验证。
总之，本研究通过WGCNA初步分析了烧伤后瘢痕产生的分子机制和异常甲基化基因，结果显示基因CCR2、LMO7、STEAP4、NNAT和TCF7L2在瘢痕形成中具有重要作用，可作为治疗的潜在靶点。
朱邦晖：实施研究、采集数据、分析数据、撰写文章；赖宏豪、魏晨如：实施研究、采集数据、分析数据；沈纵：实施研究、采集数据、统计学分析；孙瑜、朱峰：统计学分析、文章修改指导；伍国胜：分析/解释数据、获取研究经费、技术指导所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
(29) [1] ManninoF,BittoA,IrreraN.Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 induces cytokine storm and inflammation during coronavirus disease 19: perspectives and possible therapeutic approaches[J].Front Pharmacol,2020,11:592169.DOI: 10.3389/fphar.2020.592169. [2] HengX,CaiP,YuanZ,et al.Efficacy and safety of extracorporeal membrane oxygenation for burn patients: a comprehensive systematic review and meta-analysis[J/OL].Burns Trauma,2023,11:tkac056[2022-04-08].https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36873286/.DOI: 10.1093/burnst/tkac056. [3] BelenkiySM,BuelAR,CannonJW,et al.Acute respiratory distress syndrome in wartime military burns: application of the Berlin criteria[J].J Trauma Acute Care Surg,2014,76(3):821-827.DOI: 10.1097/TA.0b013e3182aa2d21. [4] BellaniG,LaffeyJG,PhamT,et al.Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries[J].JAMA,2016,315(8):788-800.DOI: 10.1001/jama.2016.0291. [5] ScozziD,LiaoF,KrupnickAS,et al.The role of neutrophil extracellular traps in acute lung injury[J].Front Immunol,2022,13:953195.DOI: 10.3389/fimmu.2022.953195. [6] WareLB,MatthayMA.The acute respiratory distress syndrome[J].N Engl J Med,2000,342(18):1334-1349.DOI: 10.1056/NEJM200005043421806. [7] FahrM,JonesG,O'NealH,et al.Acute respiratory distress syndrome incidence, but not mortality, has decreased nationwide: a national trauma data bank study[J].Am Surg,2017,83(4):323-331. [8] GoolaertsA,Pellan-RandrianarisonN,LargheroJ,et al.Conditioned media from mesenchymal stromal cells restore sodium transport and preserve epithelial permeability in an in vitro model of acute alveolar injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2014,306(11):L975-985.DOI: 10.1152/ajplung.00242.2013. [9] RiazifarM,PoneEJ,LötvallJ,et al.Stem cell extracellular vesicles: extended messages of regeneration[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2017,57:125-154.DOI: 10.1146/annurev-pharmtox-061616-030146. [10] Moreno-ManzanoV,Mellado-LópezM,Morera-EsteveMJ,et al.Human adipose-derived mesenchymal stem cells accelerate decellularized neobladder regeneration[J].Regen Biomater,2020,7(2):161-169.DOI: 10.1093/rb/rbz049. [11] LaiTC,LeeTL,ChangYC,et al.MicroRNA-221/222 mediates ADSC-exosome-induced cardioprotection against ischemia/reperfusion by targeting PUMA and ETS-1[J].Front Cell Dev Biol,2020,8:569150.DOI: 10.3389/fcell.2020.569150. [12] BacakovaL,ZarubovaJ,TravnickovaM,et al.Stem cells: their source, potency and use in regenerative therapies with focus on adipose-derived stem cells-a review[J].Biotechnol Adv,2018,36(4):1111-1126.DOI: 10.1016/j.biotechadv.2018.03.011. [13] SunJ,DingX,LiuS,et al.Adipose-derived mesenchymal stem cells attenuate acute lung injury and improve the gut microbiota in septic rats[J].Stem Cell Res Ther,2020,11(1):384.DOI: 10.1186/s13287-020-01902-5. [14] 刘名倬,甘春霞,徐斌,等.外泌体在急性肺损伤中的作用研究进展[J].中华烧伤杂志,2018,34(7):481-485.DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2018.07.011. [15] 唐黎珺,张筱薇,金俊俊,等.脂肪源性间充质干细胞外泌体在慢性创面治疗中作用机制的研究进展[J].中华烧伤杂志,2021,37(2):191-195.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200220-00076. [16] 蔡维霞,沈括,曹涛,等.人脂肪间充质干细胞来源外泌体对脓毒症小鼠肺血管内皮细胞损伤的影响及其机制[J].中华烧伤与创面修复杂志,2022,38(3):266-275.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20211020-00362. [17] CuiJ,SachaphibulkijK,TeoWS,et al.Annexin-A1 deficiency attenuates stress-induced tumor growth via fatty acid metabolism in mice: an integrated multiple omics analysis on the stress-microbiome-metabolite-epigenetic-oncology (SMMEO) axis[J].Theranostics,2022,12(8):3794-3817.DOI: 10.7150/thno.68611. [18] PerrettiM,D'AcquistoF.Annexin A1 and glucocorticoids as effectors of the resolution of inflammation[J].Nat Rev Immunol,2009,9(1):62-70.DOI: 10.1038/nri2470. [19] BoudhraaZ,BouchonB,ViallardC,et al.Annexin A1 localization and its relevance to cancer[J].Clin Sci (Lond),2016,130(4):205-220.DOI: 10.1042/CS20150415. [20] LeoniG,NeumannPA,KamalyN,et al.Annexin A1‐containing extracellular vesicles and polymeric nanoparticles promote epithelial wound repair[J].J Clin Invest,2015,125(3):1215-1227.DOI: 10.1172/JCI76693. [21] CristanteE,McArthurS,MauroC,et al.Identification of an essential endogenous regulator of blood-brain barrier integrity, and its pathological and therapeutic implications[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(3):832-841.DOI: 10.1073/pnas.1209362110. [22] YangW,WangK,MaJ,et al.Inhibition of androgen receptor signaling promotes prostate cancer cell migration via upregulation of annexin A1 expression[J].Arch Med Res,2021,52(2):174-181.DOI: 10.1016/j.arcmed.2020.10.005. [23] WuG,ChangF,FangH,et al.Non-muscle myosin II knockdown improves survival and therapeutic effects of implanted bone marrow-derived mesenchymal stem cells in lipopolysaccharide-induced acute lung injury[J].Ann Transl Med,2021,9(3):262.DOI: 10.21037/atm-20-4851. [24] WuG,SunY,WangK,et al.Relationship between elevated soluble CD74 and severity of experimental and clinical ALI/ARDS[J].Sci Rep,2016,6:30067.DOI: 10.1038/srep30067. [25] SweeneyRM,McAuleyDF.Acute respiratory distress syndrome[J].Lancet,2016,388(10058):2416-2430.DOI: 10.1016/S0140-6736(16)00578-X. [26] McVerryBJ,PengX,HassounPM,et al.Sphingosine 1‐phosphate reduces vascular leak in murine and canine models of acute lung injury[J].Am J Respir Crit Care Med,2004,170(9):987-993.DOI: 10.1164/rccm.200405-684OC. [27] 陈钦桂,曾勉.间充质干细胞治疗ARDS临床研究进展[J].国际呼吸杂志,2017,37(11):873-876.DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-436X.2017.11.015. [28] OtsuK,DasS,HouserSD,et al.Concentration-dependent inhibition of angiogenesis by mesenchymal stem cells[J].Blood,2009,113(18):4197-4205.DOI: 10.1182/blood-2008-09-176198. [29] LiaoWI,WuSY,WuGC,et al.Ac2-26, an Annexin A1 peptide, attenuates ischemia-reperfusion-induced acute lung injury[J].Int J Mol Sci,2017,18(8):1771.DOI: 10.3390/ijms18081771. -
1 4组成人脂肪间充质干细胞转染后72 h荧光（绿色）表达情况 绿色荧光蛋白×40。1A.转染pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro质粒的空载对照组细胞荧光强度较弱；1B.转染pCDH-CMV-ANXA1-EF1-GFP-Puro质粒的过表达膜联蛋白A1（ANXA1）组细胞荧光强度明显强于图1A；1C.转染pLKO.1-EGFP-puro-human scramble质粒的空载对照组细胞荧光强度较弱；1D.转染pLKO.1-EGFP-puro-shANXA1质粒的敲减ANXA1组细胞荧光强度明显强于图1C
2 蛋白质印迹法检测的4组成人脂肪间充质干细胞转染后72 h ANXA1蛋白表达
注：ANXA1为膜联蛋白A1，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带上1、2、3、4分别指转染pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro质粒的空载对照组、转染pCDH-CMV-ANXA1-EF1-GFP-Puro质粒的过表达ANXA1组、转染pLKO.1-EGFP-puro-human scramble质粒的空载对照组、转染pLKO.1-EGFP-puro-shANXA1质粒的敲减ANXA1组
3 假伤组与4组ARDS小鼠注射后24 h进行肺组织伊文思蓝染色（阳性染色为蓝色）观察到的情况。3A.假伤组正常肺组织蓝染不明显；3B.单纯ARDS组肺组织较图3A明显蓝染；3C、3D.分别为正常细胞组、过表达ANXA1组，肺组织蓝染程度均较图3B明显减轻且图3D减轻程度更明显；3E.敲减ANXA1组肺组织蓝染程度与图3B相近
注：假伤组、单纯急性呼吸窘迫综合征（ARDS）组小鼠均注射生理盐水，正常细胞组、过表达膜联蛋白A1（ANXA1）组、敲减ANXA1组小鼠对应注射正常成人脂肪间充质干细胞（AMSC）、过表达ANXA1的成人AMSC、敲减ANXA1的成人AMSC
4 假伤组与4组ARDS小鼠注射后3 d肺组织CD11b和F4/80阳性巨噬细胞（均为棕色）情况 辣根过氧化物酶-二氨基联苯胺×40。4A、4B、4C、4D、4E.分别为假伤组、单纯ARDS组、正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组CD11b阳性巨噬细胞情况，图4A、4C、4D、4E阳性染色细胞数量均明显少于图4B，且图4D阳性染色细胞数量减少最明显；4F、4G、4H、4I、4J.分别为假伤组、单纯ARDS组、正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组F4/80阳性巨噬细胞情况，图4F、4H、4I、4J阳性染色细胞数量均明显少于图4G，且图4I阳性染色细胞数量减少最明显
注：假伤组、单纯急性呼吸窘迫综合征（ARDS）组小鼠均注射生理盐水，正常细胞组、过表达膜联蛋白A1（ANXA1）组、敲减ANXA1组小鼠对应注射正常成人脂肪间充质干细胞（AMSC）、过表达ANXA1的成人AMSC、敲减ANXA1的成人AMSC
表1 假伤组与4组ARDS小鼠注射后3 d支气管肺泡灌洗液上清液中炎症因子水平比较（pg/mL，
组别 样本数 TNF-α IL-6 IL-1β 假伤组 5 59±6 81±17 125±13 单纯ARDS组 5 205±54 166±9 293±31 正常细胞组 5 136±11 133±16 184±17 过表达ANXA1组 5 113±15 129±10 187±30 敲减ANXA1组 5 171±24 153±12 185±34 F值 15.87 23.78 21.34 P值 <0.001 <0.001 <0.001 P 1值 0.007 <0.001 <0.001 P 2值 0.036 0.007 <0.001 P 3值 0.011 <0.001 0.001 P 4值 0.285 0.121 0.002 P 5值 0.042 0.695 0.871 P 6值 0.028 0.080 0.970 注：假伤组、单纯急性呼吸窘迫综合征（ARDS）组小鼠均注射生理盐水，正常细胞组、过表达膜联蛋白A1（ANXA1）组、敲减ANXA1组小鼠对应注射正常成人脂肪间充质干细胞（AMSC）、过表达 ANXA1的成人AMSC、敲减 ANXA1的成人AMSC；TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL为白细胞介素； P 1值为假伤组与单纯ARDS组比较所得， P 2值、 P 3值、 P 4值分别为正常细胞组、过表达ANXA1组、敲减ANXA1组与单纯ARDS组比较所得， P 5值、 P 6值分别为过表达ANXA1组、敲减ANXA1组与正常细胞组比较所得 
下载: 导出CSV
-
下载:
计量
- 文章访问数: 322
- HTML全文浏览量: 124
- PDF下载量: 20
- 被引次数: 0
