Effects and mechanism of water-soluble chitosan hydrogel on infected full-thickness skin defect wounds in diabetic mice
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摘要:
目的 探讨水溶性壳聚糖水凝胶对糖尿病小鼠感染全层皮肤缺损创面的作用及其机制。 方法 采用实验研究方法。采用循环冻融的方法制备由聚乙烯醇和明胶组成的对照水凝胶及由前述2种材料+水溶性壳聚糖组成的水溶性壳聚糖水凝胶。大体观察第1次冻融前后试管中2种敷料流动性，并比较12孔板中2种敷料最终形态的外观差异。取细胞株L929和HaCaT，均分别按照随机数字表法（分组方法下同）分为对照水凝胶组和水溶性壳聚糖水凝胶组，分别加入相应敷料培养24 h，采用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖活力。取兔血红细胞悬液，分为生理盐水组、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）组、对照水凝胶组和水溶性壳聚糖水凝胶组，分别作相应处理后孵育1 h，采用酶标仪检测红细胞的溶血程度。取24只11~14周龄雌性db/db小鼠，在其背部制作全层皮肤缺损创面并在创面处滴加耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）液，72 h后将小鼠分为空白对照组、磺胺嘧啶银水胶组、对照水凝胶组、水溶性壳聚糖水凝胶组，分别作相应处理。伤后0（即刻）、7、14、21 d，大体观察创面愈合情况并计算伤后14、21 d创面愈合率；伤后14 d，检测创面中MRSA浓度；伤后21 d，采用苏木精-伊红染色法对创面进行组织学分析，采用免疫荧光法检测创面中细胞CD31表达并计算其阳性百分率。取Raw264.7细胞，分为进行相应处理的白细胞介素4（IL-4）组、空白对照组、对照水凝胶组、水溶性壳聚糖水凝胶组，培养48 h，采用流式细胞仪检测细胞中CD206阳性细胞百分率。样本数均为3。对数据行独立样本t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、LSD检验及 Dunnett T3检验。 结果 试管中2种敷料在进行冻融前都具有一定的流动性，冻融1次后均形成半固态凝胶。12孔板中2种敷料最终形态均基本呈稳定的半透明片状，透明度差异不大。培养24 h，水溶性壳聚糖水凝胶组L929和HaCaT的细胞增殖活力均明显高于对照水凝胶组（t值分别为6.37、7.50，P<0.01）。孵育1 h，水溶性壳聚糖水凝胶组红细胞溶血程度明显低于Triton X-100组（P<0.01），而与生理盐水组及对照水凝胶组均相近（P>0.05）。伤后0 d，4组小鼠创面情况相似。伤后7 d，空白对照组与对照水凝胶组创面内部淡黄色渗出物较多，磺胺嘧啶银水胶组与水溶性壳聚糖水凝胶组创面观察到少量渗出。伤后14 d，空白对照组与对照水凝胶组创面干燥结痂，无明显上皮覆盖；磺胺嘧啶银水胶组创面痂皮脱落，可见脓性渗出物；水溶性壳聚糖水凝胶组创面基底呈淡红色，创面可观察到明显上皮覆盖。伤后14 d，水溶性壳聚糖水凝胶组创面愈合率显著高于其他3组（P值均<0.01）。伤后21 d，水溶性壳聚糖水凝胶组创面已完全闭合，其他3组创面均未完全愈合；水溶性壳聚糖水凝胶组创面愈合率显著高于其他3组（P值均<0.01）。伤后14 d，水溶性壳聚糖水凝胶组创面的MRSA浓度明显低于空白对照组（P<0.01），但与对照水凝胶组和磺胺嘧啶银水胶组均相近（P>0.05）。伤后21 d，空白对照组创面新生表皮缺损严重；对照水凝胶组创面的表皮亦有大面积缺损；磺胺嘧啶银水胶组创面尚未形成完整新生表皮；水溶性壳聚糖水凝胶组创面不仅被新生表皮完全覆盖，且新生表皮基底细胞排列规整。伤后21 d，水溶性壳聚糖水凝胶组创面中CD31阳性百分率为（2.19±0.35）%，明显高于空白对照组的（0.18±0.05）%、对照水凝胶组的（0.23±0.06）%以及磺胺嘧啶银水胶组的（0.62±0.25）%，P值均<0.01。培养48 h，水溶性壳聚糖水凝胶组Raw264.7中CD206阳性细胞百分率明显低于IL-4组（P<0.01），但明显高于空白对照组与对照水凝胶组（P<0.05或P<0.01）。 结论 水溶性壳聚糖水凝胶生物安全性好，较不含水溶性壳聚糖的对照水凝胶能诱导更高水平的巨噬细胞M2型极化，因此可以提升糖尿病小鼠MRSA感染的全层皮肤缺损创面的修复效果，并促进创面快速愈合。 Abstract:Objective To explore the effects and mechanism of water-soluble chitosan hydrogel on infected full-thickness skin defect wounds in diabetic mice. Methods The experimental research method was adopted. The control hydrogel composed of polyvinyl alcohol and gelatin, and the water-soluble chitosan hydrogel composed of the aforementioned two materials and water-soluble chitosan were prepared by the cyclic freeze-thaw method. The fluidity of the two dressings in test tube before and after the first freeze-thawing was generally observed, and the difference in appearance of the final state of two dressings in 12-well plates were compared. According to random number table (the same grouping method below), the cell strains of L929 and HaCaT were both divided into water-soluble chitosan hydrogel group and control hydrogel group, respectively. After adding corresponding dressings and culturing for 24 h, the cell proliferation activity was measured using cell counting kit 8. Rabbit blood erythrocyte suspensions were divided into normal saline group, polyethylene glycol octyl phenyl ether (Triton X-100) group, water-soluble chitosan hydrogel group, and control hydrogel group, which were treated accordingly and incubated for 1 hour, and then the hemolysis degree of erythrocyte was detected by a microplate reader. Twenty-four female db/db mice aged 11-14 weeks were selected, and full-thickness skin defect wounds on their backs were inflicted and inoculated with the methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), 72 h later, the mice were divided into blank control group, sulfadiazine silver hydrogel group, control hydrogel group, and water-soluble chitosan hydrogel group, which were treated accordingly. On post injury day (PID) 0 (immediately), 7, 14, and 21, the healing of the wound was observed. On PID 14 and 21, the wound healing rate was calculated. On PID 14, MRSA concentration in wounds was determined. On PID 21, the wounds were histologically analyzed by hematoxylin and eosin staining; the expression of CD31 in the wounds was detected by immunofluorescence method, and its positive percentage was calculated. Raw264.7 cells were taken and divided into interleukin-4 (IL-4) group, blank control group, control hydrogel group, and water-soluble chitosan hydrogel group, which were treated accordingly. At 48 h of culture, the percentages of CD206 positive cells were detected by flow cytometry. The number of samples was all 3. Data were statistically analyzed with independent sample t test, one-way analysis of variance, analysis of variance for repeated measurement, least significant difference test, and Dunnett T3 test. Results Two dressings in test tube had certain fluidity before freeze-thawing and formed semi-solid gels after freeze-thawing for once. The final forms of two dressings in 12-well plates were basically stable and translucent sheets, with little difference in transparency. At 24 h of culture, the cell proliferation activities of L929 and HaCaT in water-soluble chitosan hydrogel group were significantly higher than those in control hydrogel group (with t values of 6.37 and 7.50, respectively, P<0.01). At 1 h of incubation, the hemolysis degree of erythrocyte in water-soluble chitosan hydrogel group was significantly lower than that in Triton X-100 group (P<0.01), but similar to that in normal saline group and control hydrogel group (P>0.05). On PID 0, the traumatic conditions of mice in the 4 groups were similar. On PID 7, more yellowish exudates were observed inside the wound in blank control group and control hydrogel group, while a small amount of exudates were observed in the wound in sulfadiazine silver hydrogel group and water-soluble chitosan hydrogel group. On PID 14, the wounds in blank control group and control hydrogel group were dry and crusted without obvious epithelial coverage; in sulfadiazine silver hydrogel group, the scabs fell off and purulent exudate was visible on the wound; in water-soluble chitosan hydrogel group, the base of wound was light red and obvious epithelial coverage could be observed on the wound. On PID 14, the wound healing rate in water-soluble chitosan hydrogel group was significantly higher than that in the other 3 groups (all P<0.01). On PID 21, the wound in water-soluble chitosan hydrogel group was completely closed, while the wounds in the other 3 groups were not completely healed; the wound healing rate in water-soluble chitosan hydrogel group was significantly higher than that in the other 3 groups (all P<0.01). On PID 14, the concentration of MRSA in the wound in water-soluble chitosan hydrogel group was significantly lower than that in blank control group (P<0.01), but similar to that in control hydrogel group and sulfadiazine silver hydrogel group (P>0.05). On PID 21, the new epidermis was severely damaged in blank control group; the epidermis on the wound in control hydrogel group also had a large area of defect; complete new epidermis had not yet being formed on the wound in sulfadiazine silver hydrogel group; the wound in water-soluble chitosan hydrogel group was not only completely covered by the new epidermis, the basal cells of the new epidermis were also regularly aligned. On PID 21, the percentage of CD31 positivity in the wound in water-soluble chitosan hydrogel group was (2.19±0.35)%, which was significantly higher than (0.18±0.05)% in blank control group, (0.23±0.06)% in control hydrogel group, and (0.62±0.25)% in sulfadiazine silver hydrogel group, all P<0.01. At 48 h of culture, the percentage of CD206 positive Raw264.7 cells in water-soluble chitosan hydrogel group was lower than that in IL-4 group (P>0.01) but significantly higher than that in blank control group and control hydrogel group (P<0.05 or P<0.01). Conclusions The water-soluble chitosan hydrogel has good biosafety and can induce higher level of macrophage M2 polarization than control hydrogel without water-soluble chitosan, so it can enhance the repair effect of MRSA-infected full-thickness skin defect wounds in diabetic mice and promote rapid wound healing. -
Key words:
- Hydrogel /
- Chitosan /
- Infection /
- Skin /
- Chronic wound /
- Wound repair
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(1)证实连续性肾脏替代治疗（CRRT）可显著改善严重烧伤合并急性肾损伤（AKI）患者肾功能、缓解肾脏损伤等。
(2)筛选出肾前性AKI是导致严重烧伤合并AKI患者CRRT无效的主要独立影响因素。
Highlights:
(1)It was confirmed that the continuous renal replacement therapy (CRRT) could significantly improve renal function and alleviate renal injury in severe burn patients complicated with acute kidney injury (AKI).
(2)Prerenal AKI was screened out as the main independent influencing factor leading to ineffective CRRT in severe burn patients complicated with AKI.
休克、脓毒症、高肌红蛋白血症等引起的急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是烧伤患者最常见的并发症［1］。一篇包括20项研究的系统评价显示，合并AKI的烧伤患者病死率高达43%［2］。肾脏替代治疗（renal replacement therapy，RRT）可通过弥散、对流等原理平衡电解质、清除体内毒性物质和过多水分等，是针对AKI最有效、最常用的治疗手段。约8.34%的烧伤患者接受RRT，且约37.05%的烧伤合并AKI患者接受RRT［3］。根据持续时间不同，RRT可分为连续性RRT（continuous renal replacement therapy，CRRT）、间歇性RRT；根据治疗原理不同，CRRT可分为连续性静脉-静脉血液滤过、连续性静脉-静脉血液透析、连续性静脉-静脉血液透析滤过等模式［4, 5, 6］。随着RRT在重症领域的广泛应用，其适应证已从单纯的肾功能替代，拓展到炎症和应激因子清除、液体容量管理、内环境稳定等［7］。虽然RRT在治疗严重烧伤患者、合并脓毒症休克和AKI的烧伤患者、合并休克的烧伤患者中显示出临床获益，但接受RRT的烧伤合并AKI患者病死率仍较高［8, 9, 10］。这可能与RRT的启动时机、抗凝方式、模式选择等治疗细节方面尚无公认标准和共识有关。为此，本研究基于11年的临床经验和数据，回顾性分析CRRT在严重烧伤合并AKI患者中的应用效果，筛选出严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的影响因素，并对比分析不同AKI病因对CRRT临床疗效的影响，以期为CRRT在严重烧伤合并AKI患者中的应用提供参考。
1. 对象与方法
本回顾性病例系列研究获陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院伦理委员会批准，批号：KY2021122，并豁免知情同意。
1.1 入选标准
纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）因火焰、爆炸、热液、化学、电导致的烧伤；（3）住院期间接受CRRT；（4）根据2012版《改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease： Improving Global Outcomes，KDIGO）急性肾损伤临床实践指南》中制订的AKI诊断标准［11］诊断为AKI。排除标准：（1）有肾脏基础疾病史；（2）使用CRRT的原因为脓毒症、脓毒症休克等非AKI并发症；（3）临床资料不完整。
1.2 临床资料与分组统计
2010年1月—2020年12月，陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院收治79例符合入选标准的接受CRRT的严重烧伤合并AKI患者。主要观察指标为全部患者和不同AKI病因分组患者的CRRT整体效果。次要观察指标为全部患者和不同AKI病因分组患者的院内病死率和住院天数。
收集全部患者的一般资料，包括性别、年龄、体重指数、烧伤面积（烧伤总面积、Ⅲ度烧伤面积）、烧伤指数、致伤原因、是否合并吸入性损伤、入院时急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ）和脓毒症相关性器官功能衰竭评价（sepsis-related organ failure assessment，SOFA）评分、烧伤后入院时间和入院后发生AKI时间；CRRT整体效果，包括总体有效率、完全有效率、部分有效率、无效率、恶化率，治疗前后的肌酐、尿素、胱抑素C、液体超载率，院内病死率、基于Baux评分模型的预测病死率、最常见的死亡原因、住院天数。其中按照CRRT前后，以《KDIGO AKI临床实践指南》中的AKI诊断标准为依据的AKI分期变化，将患者肾功能改善情况分为完全有效、部分有效、无效和恶化4个等级，完全有效为治疗后AKI已完全恢复正常，部分有效为治疗后AKI已降期但未完全恢复正常，无效为治疗后AKI分期无变化，恶化为治疗后AKI分期升高［11, 12, 13］；液体超载以百分率表示，液体超载率=［每日入量（L）-每日出量（L）］÷入院时体重（kg）×100%［14］；Baux评分=年龄（岁）+烧伤总面积（%TBSA）+［17×是否合并吸入性损伤（是=1，否=0）］；基于Baux评分模型的预测病死率（%）=e-8.816 3+（0.077 5×Baux评分）÷（1+e-8.816 3+（0.077 5×Baux评分））［15］。
根据CRRT效果，将患者分为有效组（42例）和无效组（37例），其中完全有效和部分有效均被认定为CRRT有效，无效和恶化被认定为CRRT无效。比较2组患者一般资料和发生AKI后启动CRRT时间、CRRT持续时间、AKI病因、CRRT启动前AKI分期、CRRT模式、抗凝剂种类、院内病死率。
根据《中国AKI临床实践指南》和《脓毒症相关AKI共识》中AKI病因［16, 17］，将患者分为肾前性组（22例）和肾性组（57例），比较2组患者一般资料和发生AKI后启动CRRT时间、CRRT持续时间和CRRT整体效果（最常见的死亡原因除外）。
1.3 统计学处理
采用SPSS 26.0统计软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料数据以
2. 结果
2.1 总体一般资料
79例患者中，男73例、女6例，年龄（46±14）岁，体重指数（24.0±2.9）kg/m2，烧伤总面积（69±26）%TBSA，Ⅲ度烧伤面积（44±25）%TBSA，烧伤指数57（36，76）。火焰烧伤者36例、电烧伤者19例、热液烫伤者16例、爆炸伤者6例、化学烧伤者2例，39例患者合并吸入性损伤，入院时APACHE Ⅱ评分16（12，18）分、SOFA评分11（5，13）分，烧伤后0（0，2）d入院，入院后0（0，6）d发生AKI，47例（59.49%）患者在入院48 h内发生AKI。
2.2 CRRT整体效果
79例患者中，CRRT总体有效率53.16%（42/79）、完全有效率30.38%（24/79）、部分有效率22.78%（18/79）、无效率31.65%（25/79）、恶化率15.19%（12/79）。患者治疗后的肌酐和尿素分别为139.50（92.70，195.00）μmol/L和13.00（8.37，23.78）mmol/L，均明显低于治疗前的230.50（124.60，341.30）μmol/L和19.70（12.22，26.55）mmol/L（Z值分别为-3.26、-2.54，P值分别为0.001、0.011）；治疗后的胱抑素C和液体超载率分别为1.70（1.25，2.70）mg/L和4.58%（2.41%，6.63%），与治疗前的2.05（1.60，3.50）mg/L和5.24%（3.33%，8.71%）比较，差异均无统计学意义（Z值分别为-1.61、-1.37，P值分别为0.107、0.169）。患者院内病死率17.72%（14/79），基于Baux评分模型的预测病死率75.10%（18.94%，91.84%），最常见的死亡原因为MOF，住院天数39.43（11.52，110.58）d。
2.3 严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的影响因素分析
2.3.1 单因素分析
有效组和无效组患者Ⅲ度烧伤面积、CRRT持续时间、AKI病因比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。
表1 有效组和无效组严重烧伤合并AKI患者的一般资料和CRRT相关资料比较表1. Comparison of general data and CRRT-related data in the severe burn patients complicated with AKI between effective group and ineffective group组别 例数 性别（例） 年龄（岁， 体重指数（kg/m2， 烧伤总面积（%TBSA， Ⅲ度烧伤面积［%TBSA，M（Q1，Q3）］ 烧伤指数［M（Q1，Q3）］ 男 女 有效组 42 39 3 47±12 24.3±3.1 69±29 42（26，75） 58（36，82） 无效组 37 34 3 46±16 24.3±4.3 64±25 37（20，52） 51（34，73） 统计量值 — t=0.30 t=-0.01 t=1.22 Z=-1.99 Z=-1.59 P值 >0.999 0.761 0.993 0.225 0.046 0.111 注：有效组患者CRRT效果等级为完全有效或部分有效，无效组患者CRRT效果等级为无效或恶化；AKI为急性肾损伤，CRRT为连续性肾脏替代治疗，TBSA为体表总面积，APACHE Ⅱ为急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ，SOFA为脓毒症相关性器官功能衰竭评价，CVVH为连续性静脉-静脉血液滤过，CVVHDF为连续性静脉-静脉血液透析滤过；“—”表示无此项；CRRT模式中其他为混合使用CVVH和CVVHDF或单独使用连续性静脉-静脉血液透析，抗凝剂种类中其他为混合使用肝素或枸橼酸抗凝剂或使用除这2种抗凝剂之外的抗凝剂 2.3.2 多因素logistic回归分析
选取2.3.1单因素分析中P<0.1的4个因素，即AKI病因、Ⅲ度烧伤面积、发生AKI后启动CRRT时间、CRRT持续时间。将AKI病因进行变量赋值（肾前性=0、肾性=1），其余3个指标以原始值代入，进行多因素logistic回归分析。结果显示，AKI病因和Ⅲ度烧伤面积均是严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的独立影响因素（P<0.05）。见表2。
表2 影响79例严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的多因素logistic回归分析结果表2. Results of multivariate logistic regression analysis affecting the efficacy of CRRT in 79 severe burn patients complicated with AKI项目与分类 比值比 95%置信区间 P值 常量 0.07 — 0.002 AKI病因 肾性AKI（以肾前性AKI为参照） 4.21 1.20~14.80 0.025 Ⅲ度烧伤面积（%TBSA） 1.03 1.00~1.05 0.024 发生AKI后启动CRRT时间（h） 1.33 0.87~2.03 0.182 CRRT持续时间（h） 1.00 0.99~1.00 0.186 注：AKI为急性肾损伤，CRRT为连续性肾脏替代治疗，TBSA为体表总面积；“—”表示无此项 2.4 不同AKI病因患者的临床特征比较
肾前性组和肾性组患者的烧伤总面积、烧伤指数、致伤原因、烧伤后入院时间、入院后发生AKI时间、发生AKI后启动CRRT时间、CRRT总体有效率和基于Baux评分模型的预测病死率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；肾性组患者治疗前的尿素和胱抑素C均明显高于肾前性组（P<0.05），液体超载率明显低于肾前性组（P<0.05）；肾性组患者治疗后的胱抑素C明显高于肾前性组（P<0.05）；其余指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3、4。
表3 肾前性组和肾性组严重烧伤合并AKI患者一般资料和CRRT相关时间参数比较表3. Comparison of general data and CRRT-related time indexes in the severe burn patients complicated with AKI between prerenal group and renal group组别 例数 性别（例） 年龄（岁， 体重指数（kg/m2， 烧伤总面积［%TBSA，M（Q1，Q3）］ Ⅲ度烧伤面积［%TBSA，M（Q1，Q3）］ 烧伤指数［M（Q1，Q3）］ 致伤原因（例） 男 女 火焰烧伤 电烧伤 爆炸伤 化学烧伤 热液烫伤 肾前性组 22 20 2 46±12 24.4±2.8 90（70，95） 54（34，70） 73（54，80） 13 0 2 1 6 肾性组 57 53 4 46±14 24.2±4.0 62（40，86） 34（20，59） 47（32，67） 23 19 4 1 10 统计量值 — t=-0.09 t=0.15 Z=2.46 Z=1.82 Z=2.43 χ2=12.59 P值 >0.999 0.924 0.877 0.016 0.072 0.017 0.007 注：肾前性和肾性为AKI病因；AKI为急性肾损伤，CRRT为连续性肾脏替代治疗，TBSA为体表总面积，APACHE Ⅱ为急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ，SOFA为脓毒症相关性器官功能衰竭评价；“—”表示无此项 表4 肾前性组和肾性组严重烧伤合并AKI患者CRRT效果比较表4. Comparison of efficacy of CRRT in the severe burn patients complicated with AKI between prerenal group and renal group组别 例数 总体有效情况［例（%）］ CRRT效果等级［例（%）］ 完全有效 部分有效 无效 恶化 肾前性组 22 7（31.82） 4（18.18） 3（13.64） 11（50.00） 4（18.18） 肾性组 57 35（61.40） 20（35.09） 15（26.32） 14（24.56） 8（14.04） 统计量值 χ2=5.58 χ2=-1.92 P值 0.024 0.054 注：肾前性和肾性为AKI病因；AKI为急性肾损伤，CRRT为连续性肾脏替代治疗 3. 讨论
AKI是严重烧伤患者常见的并发症之一，发病率和病死率分别高达30%和80%［18］，而CRRT是治疗AKI的最终有效手段。近年研究显示，CRRT不仅具有肾脏替代作用，而且可清除代谢物、降低炎症应激反应、精确控制容量等，进而改善患者预后。因此，CRRT适应证已扩展到横纹肌溶解、脓毒症休克、水电解质紊乱、自身免疫系统疾病甚至急性脑损伤［19, 20, 21］。治疗细节包括CRRT的不同模式、启动时机、剂量、抗凝剂选择等方面［22, 23, 24, 25, 26］，但目前均缺乏统一标准。本研究回顾性分析了CRRT在烧伤合并AKI患者中的应用效果，筛选出了可能影响CRRT效果的因素。
本研究显示，CRRT可明显降低严重烧伤合并AKI患者肌酐、尿素和液体超载率，这与前期多项研究结果［27, 28, 29, 30］较类似，进一步证实了CRRT可明显改善严重烧伤合并AKI患者肾功能、避免液体超载、缓解肾脏损伤。但是，本研究人群的病死率仍较高，其可能原因如下：（1）烧伤损伤机制和治疗的复杂性高，严重烧伤患者的成功救治几乎涉及机体每个系统，而造成死亡的原因常常是心脏、肺脏、肝脏、循环等多个功能障碍，而不单单是AKI，事实上本研究中1/2死亡人群的死亡原因为MOF。（2）入组患者年龄大、烧伤总面积大、烧伤病情危重，本身病死率就比较高；实际上基于Baux评分模型预测出本研究患者的病死率中位数为75.10%，明显高于实际病死率。（3）47例（59.49%）患者在入院48 h内发生AKI，提示大多数患者可能为外院并发AKI后转院过来，存在一定的病情延误。
本研究将肾脏改善情况和部分远期指标（院内病死率、住院天数等）作为结局指标，以便从多个维度反映CRRT的效果。其中考虑到远期治疗效果的混杂因素较多，本研究将肾功能改善作为主要观察指标。现有研究显示，肌酐、尿素、尿量等可能受到容量、代谢等影响，单一指标并不能准确评价肾损伤程度，而KDIGO标准（主要包括肌酐和尿量）为近年来反映肾损伤程度的公认指标，比单一指标更为准确。为了减少CRRT启动时肾脏损伤程度不同的影响，本研究将KDIGO分期的变化情况作为疗效评价指标，同时结合肌酐、尿素等绝对值的变化，从不同角度反映CRRT对AKI的效果。
本研究通过单因素分析和多因素logistic回归分析得出，AKI病因和Ⅲ度烧伤面积是严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的独立影响因素，其中肾前性AKI的比值比为4.21，而Ⅲ度烧伤面积的比值比仅为1.03，接近1，说明Ⅲ度烧伤面积对CRRT效果影响小，因此肾前性AKI是严重烧伤合并AKI患者CRRT无效的主要独立影响因素。亚组分析也支持，肾前性组患者的CRRT总体有效率明显低于肾性组的结论。可能原因为CRRT可代替肾性AKI患者受损的肾功能，而肾前性AKI患者除了需要CRRT进行肾功能替代外，更需要着重去除导致AKI的病因。严重烧伤患者由于创面体液的大量丢失，容易出现机体有效循环容量降低，肾脏血流灌注不足，这是引起肾前性AKI的常见病因。因此，需要在CRRT基础上，大量补液以尽快补充有效血容量是促进肾前性AKI恢复的关键手段。此外，液体超载也会加重肾脏负担，导致AKI。Ⅲ度烧伤面积越大，烧伤病情越重，可能使患者AKI的损伤程度更重，导致给予CRRT后患者KDIGO分期改善的幅度更为明显。
本研究也存在一定的局限性，样本量较少，但已纳入本单位近11年的数据，这可能与近年来严重烧伤发病率降低有关，后续仍然需要大规模、多中心、前瞻性临床研究来解决这一问题。
综上，本研究表明，CRRT可明显改善严重烧伤合并AKI患者肾功能、避免液体超载、缓解肾脏损伤等。肾前性AKI是严重烧伤合并AKI患者CRRT无效的独立影响因素。
朱萌：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、数据整理、统计分析、撰写论文；陈禹州：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据、撰写论文；区锦钊：数据整理、统计分析；李曌、鞠晓燕：文献调研、分析/解释数据；黄沙、胡骁骅、田野、牛忠伟：研究指导、论文修改、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 2种水凝胶在试管中冻融1次前后流动性以及在12孔板中循环冻融后最终形态。1A、1B.分别为对照水凝胶和水溶性壳聚糖水凝胶，冻融1次后，2种溶液均由可流动状态变成不流动的半固态；1C、1D.分别为在12孔板中最终形成的对照水凝胶和水溶性壳聚糖水凝胶（培养皿中展示），二者均为稳定规则的圆形半透明片状
注：对照水凝胶由聚乙烯醇和明胶制得，水溶性壳聚糖水凝胶由聚乙烯醇、明胶和水溶性壳聚糖制得
2 4 组db/db小鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合情况。2A、2B、2C、2D.分别为空白对照组伤后0、7、14、21 d创面，图2E显示空白对照组14 d后创面缩小不明显；2F、2G、2H、2I.分别为对照水凝胶组伤后0、7、14、21 d 创面，图2J显示对照水凝胶组各时间点创面面积均分别较图2E有所缩小；2K、2L、2M、2N.分别为磺胺嘧啶银水胶组伤后0、7、14、21 d创面，图2O显示磺胺嘧啶银水胶组各时间点创面面积分别较图2J有所缩小；2P、2Q、2R、2S.分别为水溶性壳聚糖水凝胶组伤后0、7、14、21 d创面，图2T显示水溶性壳聚糖水凝胶组各时间点创面面积均分别较图2E、2J、2O明显缩小
注：对照水凝胶由聚乙烯醇和明胶制得，水溶性壳聚糖水凝胶由聚乙烯醇、明胶和水溶性壳聚糖制得；图中圆形参照物直径为2 cm；图2E、2J、2O、2T为ImageJ图像软件处理后量化图，图中红色、橙色、黄色、绿色边界内范围均分别表示伤后0（即刻）、7、14、21 d创面面积大小
3 4组db/db小鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的全层皮肤缺损创面伤后21 d组织学变化 苏木精-伊红。3A、3B、3C、3D.分别为空白对照组、对照水凝胶组、磺胺嘧啶银水胶组、水溶性壳聚糖水凝胶组创面，图3D中的新生表皮长度明显长于图3A、3B、3C，图片放大倍数为1.25；3E、3F、3G、3H.分别为图3A、3B、3C、3D局部创面放大图，从左至右显示未封闭的创缘宽度依次缩减，其中图3H所示创面已完全愈合，图片放大倍数为2.50
注：对照水凝胶由聚乙烯醇和明胶制得，水溶性壳聚糖水凝胶由聚乙烯醇、明胶和水溶性壳聚糖制得；图3A、3B、3C、3D中的红色双向箭头指示新生上皮长度，图3E、3F、3G、3H中的红色单向箭头之间区域指示尚未封闭的创缘宽度
4 4组db/db小鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的全层皮肤缺损创面伤后21 d CD31阳性表达情况 Alexa Fluor 594-4', 6-二脒基-2-苯基吲哚×40。4A、4B、4C、4D.分别为空白对照组、对照水凝胶组、磺胺嘧啶银水胶组、水溶性壳聚糖水凝胶组，图4D中的CD31阳性表达明显高于图4A、4B、4C
注：对照水凝胶由聚乙烯醇和明胶制得，水溶性壳聚糖水凝胶由聚乙烯醇、明胶和水溶性壳聚糖制得；细胞核阳性染色为蓝色，CD31阳性细胞染色为红色（指示新生血管）
表1 4组db/db小鼠耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合率比较（%，
组别 样本数 14 d 21 d 空白对照组 3 36.94±3.00 58.93±4.69 对照水凝胶组 3 18.92±4.42 84.33±4.04 磺胺嘧啶银水胶组 3 39.71±5.03 88.10±2.01 水溶性壳聚糖胶组 3 83.74±3.30 99.76±0.24 F值 140.70 83.74 P值 <0.001 <0.001 P1值 <0.001 <0.001 P2值 <0.001 <0.001 P3值 <0.001 0.002 注：对照水凝胶由聚乙烯醇和明胶制得，水溶性壳聚糖水凝胶由聚乙烯醇、明胶和水溶性壳聚糖制得；处理因素主效应，F=422.86，P<0.001；时间因素主效应，F=1 788.78，P<0.001；两者交互作用，F=68.88，P<0.001；F值、P值为4组间各时间点总体比较所得；P1值为空白对照组与水溶性壳聚糖水凝胶组比较所得；P2值为对照水凝胶组与水溶性壳聚糖水凝胶组比较所得；P3值为磺胺嘧啶银水胶组与水溶性壳聚糖水凝胶组比较所得 
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