Prospective study on application of mind mapping combined with scenario simulation training on the ability training of junior nurses in hospital transfer of patients with critical burns and trauma
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摘要:
目的 探讨思维导图联合情景模拟训练在低年资护士的院内危重烧创伤患者转运能力培训中的应用效果。 方法 采用前瞻性随机对照研究方法。2019年12月—2020年12月，将陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院全军烧伤研究所符合入选标准的55名女性低年资护士纳入本研究，按照随机数字表法，将其分为常规组［27名，年龄（24.0±0.9）岁］和联合组［28名，年龄（24.2±0.8）岁］。采用理论与操作技能相结合的方式对常规组护士进行院内危重烧创伤患者转运培训，采用思维导图联合情景模拟训练的方式对联合组护士进行院内危重烧创伤患者转运培训。培训前、后，均采用自制理论考卷和技能考核项目对护士进行考试和考核，统计并比较其得分；均采用自制应急能力评分系统对护士的团队协作能力、应急反应能力、操作技术能力、专科业务能力、护患沟通能力5个维度的应急处置能力进行考核评估，统计并比较其得分。统计并比较培训前后护士在转运危重高仿真模拟人（以下简称模拟人）过程中，物品准备不全、患者沟通效果不佳、管道护理不到位、交接不清、终末处理不到位的转运护理措施执行不规范率；统计并比较培训后模拟人转运病情变化率及转运成功率。考核后，采用自制满意度调查问卷调查并比较护士对培训模式、培训内容、培训效果的满意度。对数据行独立样本 t检验、Pearson χ 2检验或Yates矫正 χ 2检验。 结果 纳入的55名护士均全程参与培训、考试、考核及调查问卷的填写。培训前，2组护士理论考试及技能考核得分比较，差异均无统计学意义（ P>0.05）；培训后，联合组护士理论考试及技能考核得分均明显高于常规组（ t值分别为-3.89、-4.24， P<0.05）。培训前，2组护士应急处置能力各维度考核得分比较，差异均无统计学意义（ P>0.05）；培训后，联合组护士的团队协作能力、应急反应能力、操作技术能力、专科业务能力、护患沟通能力得分均明显高于常规组（ t值分别为-6.49、-6.44、-2.21、-2.85、-2.34， P<0.05）。培训前，2组护士转运护理措施执行不规范率比较，差异均无统计学意义（ P>0.05）；培训后，联合组护士的物品准备不全、交接不清、终末处理不到位的不规范率均明显低于常规组（ t值分别为3.87、5.89、5.28， P<0.05）。培训后，联合组护士的模拟人转运病情变化率为7.14%（2/28），明显低于常规组的33.33%（9/27）， χ 2=5.89， P<0.05；转运成功率为96.43%（27/28），明显高于常规组的74.07%（20/27）， χ 2=3.87， P<0.05。考核后，联合组护士对培训满意度的总得分及对培训模式、培训效果满意度的得分均明显高于常规组（ t值分别为5.22、4.67、10.71， P<0.05）；2组护士对培训内容的满意度得分比较，差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论 基于循证基础的思维导图联合情景模拟训练显著提高了低年资护士的转运危重烧创伤患者护理技能及应急处置能力。 Abstract:Objective To explore the application effects of mind mapping combined with scenario simulation training on the ability training of junior nurses in hospital transfer of patients with critical burns and trauma. Methods A prospective randomized controlled study was conducted. From December 2019 to December 2020, 55 female junior nurses from the Institute of Burn Research of the First Affiliated Hospital of Army Medical University (the Third Military Medical University) who met the inclusion criteria were enrolled in this study and divided into routine group (27 nurses, aged (24.0±0.9) years) and combined group (28 nurses, aged (24.2±0.8) years), according to the random number table. The nurses in routine group were trained with hospital transfer of patients with critical burns and trauma by theory combined with operational skill, and the nurses in combined group were trained with hospital transfer of patients with critical burns and trauma by mind mapping combined with scenario simulation training. Before and after the training, the self-made theoretical examination papers and skill assessment items were used for the examination and assessment to nurses, and their scores were calculated and compared. The self-made emergency ability scoring system was used to evaluate the emergency disposal ability of nurses from five dimensions, including team cooperation ability, emergency response ability, operative technique ability, specialized business ability, and nurse-patient communication ability, and their scores were calculated and compared. The non-standard implementation rates of transfer nursing measures, such as incomplete preparation of goods, poor communication effect of patients, inadequate pipeline nursing, unclear handover, and inadequate final treatment, were calculated and compared in the process of transporting highly simulated human (hereinafter referred to as simulated human) by nurses before and after training; and the rate of disease change and successful rate of transport of simulated human were calculated and compared after training. After assessment, self-made satisfaction questionnaire was used to compare nurses' satisfaction with the training mode, content, and effects. Data were statistically analyzed with independent sample t test, Pearson chi-square test, or Yates corrected chi-square test. Results Fifty-five enrolled nurses were fully involved in the training, examination, assessment, and questionnaire filling. Before training, there were no statistically significant differences in theoretical examination and skill assessment scores between the 2 groups ( P>0.05); After training, the theoretical examination and skill assessment scores of nurses in combined group were significantly higher than those in routine group (with t values of -3.89 and -4.24, respectively, P<0.05). Before training, there were no statistically significant differences in the scores of each item of emergency disposal ability between the 2 groups ( P>0.05); after training, the scores in terms of team cooperation ability, emergency response ability, operative technique ability, specialized business ability, and nurse-patient communication ability of nurses in combined group were significantly higher than those in routine group (with t values of -6.49, -6.44, -2.21, -2.85, and -2.34, respectively, P<0.05). Before training, there were no statistically significant differences in the non-standard implementation rates of transfer nursing measures of nurses between the 2 groups ( P>0.05); after training, the non-standard rates of incomplete preparation of goods, unclear handover, and inadequate final treatment of nurses in combined group were significantly lower than those in routine group (with t values of 3.87, 5.89, and 5.28, respectively, P<0.05). After training, the rate of disease change of simulated human of nurses in combined group was 7.14% (2/28), which was significantly lower than 33.33% (9/27) in routine group ( χ 2=5.89, P<0.05); the successful rate of transport was 96.43% (27/28), which was significantly higher than 74.07% (20/27) in routine group ( χ 2=3.87, P<0.05). After assessment, the total score of training satisfaction and scores of satisfaction with training mode and training effect of nurses in combined group were significantly higher than those in routine group (with t values of 5.22, 4.67, and 10.71, respectively, P<0.05). There was no statistically significant difference in the satisfaction score on training content between the two groups ( P>0.05). Conclusions Evidence-based mind mapping combined with scenario simulation training significantly improves the nursing skills and emergency handling capabilities of junior nurses in transferring patients with critical burns and trauma. -
Key words:
- Burns /
- Nurses /
- Evidence-based nursing /
- Critical care nursing /
- Low seniority nurses /
- Mind mapping /
- Scenario simulation
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(1)利用单细胞转录组测序技术检测到糖尿病足创缘皮肤组织成纤维细胞（Fb）中的趋化因子配体和角质形成细胞（KC）中的趋化因子受体相互作用明显减弱,这可能是糖尿病足创面愈合障碍的重要机制。
(2)证实高糖抑制人皮肤Fb分泌CXC趋化因子配体12（CXCL12）,高糖人皮肤Fb培养上清液刺激导致人皮肤KC迁移能力减弱及KC中CXC趋化因子受体4（CXCR4）表达水平降低。
(3)外源性重组人CXCL12可通过上调CXCR4表达,增强人皮肤KC的迁移能力。
Highlights:
(1)Single-cell transcriptome sequencing detected that the interaction between chemokine ligands of fibroblasts (Fb) and chemokine receptors of keratinocytes (KC) was significantly decreased in the wound edge skin tissue of diabetic foot, which may be an important mechanism in the impairment of wound healing of diabetic foot.
(2)It was proved that high glucose inhibited human skin Fb to secret the C-X-C motif chemokine ligand 12 (CXCL12). Stimulated by human skin Fb culture supernatant of high glucose, the migration ability of human skin KC weakened, and the expression level of C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4) decreased.
(3)Exogenous recombinant human CXCL12 could enhance the migration ability of human skin KC by up-regulating CXCR4 expression.
糖尿病足是非创伤性下肢截肢的主要原因[1]。据报道,全世界每年因糖尿病足溃疡导致不同程度截肢的人群超过100万[2]。在中国,因糖尿病足进行大截肢或小截肢的患者在手术后5年的病死率接近 40%,因此糖尿病足是一个严重的公共卫生问题[3, 4]。阐明糖尿病足创面愈合障碍的潜在机制具有重要意义[5]。
创面愈合是一个复杂的生物学过程[6, 7]。皮肤损伤后,创面愈合过程启动,通过募集免疫细胞、Fb、KC及间充质细胞,共同调控创面愈合过程[8, 9]。创面微环境由不同类型的细胞组成,各种类型细胞要在创面愈合过程中表现出适当的作用,必须进行细胞间通讯[10, 11, 12]。本课题组前期单细胞转录组测序结果显示,糖尿病足创缘皮肤组织中的Fb与KC间通讯明显减弱,但其具体机制尚未被阐明。因此,本研究进一步对上述2种细胞间的相互作用进行分析,观察高糖微环境下人包皮Fb（human foreskin fibroblast,HFF）培养上清液作为条件培养基（conditioned medium,CM）对HaCaT细胞迁移的影响,并初步探究可能的作用机制,以期为糖尿病足创面的临床治疗提供新的思路及理论依据。
1. 材料与方法
本实验研究经华中科技大学同济医学院附属梨园医院医学伦理委员会批准,批号：[2020]IEC（SQ09）。
1.1 细胞及主要试剂与仪器来源
人KC细胞株HaCaT、HFF细胞株由中国科学院上海细胞库提供。DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司,兔抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、PCR引物、实时荧光定量RT-PCR试剂盒、化学发光检测试剂盒、蛋白定量测定试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司,重组人CXC趋化因子配体12（C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12）蛋白、兔抗人CXC趋化因子受体4（ C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4）单克隆抗体购自英国Abcam公司。Multiskan FC型多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher公司,ChemiDoc XRS型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司,IX71型倒置相差显微镜购自日本Olympus公司。
1.2 单细胞转录组测序
取华中科技大学同济医学院附属梨园医院创面修复科2021年8月收治的1例2型糖尿病患者（男,33岁）糖尿病足创缘皮肤组织和该院手外科2021年9月收治的1例足背部外伤患者（男,50岁）创缘皮肤组织,由南京新格元生物科技有限公司进行组织解离、单细胞悬液制备、文库构建、单细胞转录组测序。使用 CellphoneDB v2.1.0软件分析Fb亚群中趋化因子配体与KC亚群中趋化因子受体的相互作用。
1.3 HaCaT细胞和HFF的培养
将1×106个HaCaT细胞接种至含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素混合液的DMEM培养基（以下称DMEM完全培养基）的培养瓶（底面积为25 cm2,下同）中,将1×106个HFF接种至含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素混合液的DMEM/F12培养基（以下称DMEM/F12完全培养基）的培养瓶中,于37 ℃、含体积分数15%二氧化碳的细胞培养箱中培养（培养条件下同）。
1.4 高糖CM和正常CM的制备
将1×106个HFF接种至装有含30 mmol/L D-葡萄糖的DMEM/F12完全培养基的培养瓶中培养7 d[13, 14],以1 000×g离心5 min收集细胞培养上清液,作为高糖CM。将1×106个HFF接种至仅含DMEM/F12完全培养基的培养瓶中培养7 d后,以1 000×g离心5 min收集细胞培养上清液,作为正常CM。用孔径0.2 μm的过滤器过滤2种CM后,将其置于-80 ℃冰箱中备用。
1.5 高糖CM对HaCaT细胞迁移的影响
取HaCaT细胞,用DMEM完全培养基调整细胞浓度为1×105个/mL后,接种于6孔板中,每孔2 mL。待细胞生长达90%以上融合时,用规格为200 μL的移液器枪头和直尺在HaCaT单细胞层上划1条直线。将细胞分为正常CM组和高糖CM组,每组3孔,吸弃原有培养基,加入PBS冲洗2遍,正常CM组每孔细胞加入2 mL正常CM,高糖CM组每孔细胞加入2 mL高糖CM。划痕后0（即刻）、24、48 h在倒置相差显微镜200倍放大倍数下观察细胞划痕愈合情况并计算划痕后24、48 h细胞迁移率。细胞迁移率=（划痕后0 h划痕面积-划痕后其他时间点划痕面积）÷划痕后0 h划痕面积×100%。本实验样本数为3。
1.6 正常CM和高糖CM中细胞因子含量检测
取正常CM和高糖CM,用人48因子液相悬浮芯片（美国Bio-Rad公司）和Bio-Plex 200系统（美国Luminex公司）检测细胞因子含量。读取仪器上表示2种CM中细胞因子含量的数值,对数据进行Zscore校正（均值为0、方差为1）,使用热图展示2种CM中的细胞因子表达差异。此部分实验委托上海华盈生物医药科技有限公司完成。本实验样本数为5。
1.7 HFF中CXCL的mRNA表达检测
将HFF接种到6孔板中,每孔1×105个细胞,分为高糖组和正常组,每组3孔,同1.4用含高浓度葡萄糖和不含葡萄糖的DMEM/F12完全培养基培养7 d。按照TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA,将RNA反转录为互补DNA。采用实时荧光定量RT-PCR法检测CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL12的mRNA表达,引物序列及产物大小见表1。以β肌动蛋白为内参照,基于Δ循环阈值计算mRNA的相对表达量。本实验样本数为6。
表1 采用实时荧光定量反转录PCR法检测HFF中趋化因子配体mRNA表达的引物序列及产物大小
Table 1 The primer sequences and product sizes of chemokine ligand mRNA expression in HFF
detected by real-time fluorescence
quantitative reverse transcription
polymerase chain reaction
引物名称 引物序列（5'→3'） 产物大小（bp） CXCL1 上游：GGGAATTCACCCCAAGAACATC 121 下游：GGATGCAGGATTGAGGCAAGC CXCL2 上游：CAAACCGAAGTCATAGCCACA 157 下游：TCCTTCAGGAACAGCCACCA CXCL8 上游：CATACTCCAAACCTTTCCACCC 164 下游：CATACTCCAAACCTTTCCACCC CXCL12 上游：TGAGCTACAGATGCCCATGC 103 下游：ACAATCTGAAGGGCACAGTTTG β肌动蛋白 上游：CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT 317 下游：CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC 注：HFF为人包皮成纤维细胞,CXCL为CXC趋化因子配体 1.8 HaCaT细胞中CXCR4的蛋白表达检测
同1.5取HaCaT细胞分组及培养48 h,提取细胞总蛋白,采用蛋白质印迹法检测CXCR4的蛋白表达。一抗为兔抗人CXCR4单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000）,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶2 000）。使用Image J 1.48V图像分析软件（美国国立卫生研究院）分析条带灰度值。以GAPDH为内参照,计算CXCR4的蛋白表达量。本实验样本数为3。
1.9 CXCL12对高糖CM作用下HaCaT细胞迁移和CXCR4蛋白表达的影响
将HaCaT细胞接种到6孔板中,每孔1×105个细胞,分为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组、高糖CM+CXCL12组,每组3孔。正常CM组、高糖CM组细胞同1.5相同组别进行处理,正常CM+CXCL12组每孔细胞加入2 mL含100 ng/mL 重组人CXCL12的正常CM,高糖CM+CXCL12组每孔细胞加入2 mL含100 ng/mL 重组人CXCL12的高糖CM。同1.5检测细胞迁移情况,同1.8检测细胞中CXCR4的蛋白表达情况,2个实验样本数均为3。
1.10 统计学处理
采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布,以
2. 结果
2.1 Fb亚群中趋化因子配体和KC亚群中趋化因子受体的相互作用
与急性足外伤创缘皮肤组织比较,糖尿病足创缘皮肤组织Fb亚群中的趋化因子配体（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8）和KC亚群中的趋化因子受体CXCR2间、Fb亚群中的趋化因子配体CXCL12和KC亚群中的趋化因子受体CXCR4间的相互作用明显减弱。见图1。
图 1 基于单细胞转录组测序分析急性足外伤患者创缘皮肤组织和糖尿病足患者创缘皮肤组织Fb亚群中趋化因子配体与KC亚群中趋化因子受体的相互作用注：图中最左侧字母A表示急性足外伤创缘皮肤组织,D表示糖尿病足创缘皮肤组织；CXCL为CXC趋化因子配体,CXCR为CXC趋化因子受体,ACKR3为非典型趋化因子受体3,Fb为成纤维细胞,KC为角质形成细胞；从左至右各列依次为Fb亚群1与Fb亚群5、Fb亚群1与KC亚群2、Fb亚群1与KC亚群4、Fb亚群1与KC亚群6、Fb亚群2与Fb亚群5、Fb亚群2与KC亚群2、Fb亚群2与KC亚群4、Fb亚群2与KC亚群6、Fb亚群3与Fb亚群1、Fb亚群3与Fb亚群3、Fb亚群3与Fb亚群5、Fb亚群3与Fb亚群6、Fb亚群3与KC亚群2、Fb亚群3与KC亚群4、Fb亚群3与KC亚群6、Fb亚群4与Fb亚群5、Fb亚群4与KC亚群2、Fb亚群4与KC亚群4、Fb亚群4与KC亚群6、Fb亚群5与Fb亚群5、Fb亚群5与KC亚群2、Fb亚群5与KC亚群4、Fb亚群5与KC亚群6、Fb亚群6与Fb亚群5、Fb亚群6与KC亚群2、Fb亚群6与KC亚群4、Fb亚群6与KC亚群62.2 高糖CM对HaCaT细胞迁移的影响
划痕后24、48 h,与正常CM组比较,高糖CM组HaCaT细胞迁移率均明显降低（P<0.05）。见图2和表2。
图 2 2组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移情况 倒置相差显微镜×200。2A、2B、2C.分别为正常CM组细胞划痕后0（即刻）、24、48 h的划痕面积,划痕面积逐渐变小；2D、2E、2F.分别为高糖CM组细胞划痕后0、24、48 h的划痕面积,图2E和2F剩余划痕面积分别较图2B和2C明显增大注：CM为条件培养基；用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞Table 2. 2组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移率比较（%,组别 样本数 24 h 48 h 正常CM组 3 54.06±1.95 82.66±2.75 高糖CM组 3 17.53±1.85 47.72±2.71 t值 23.50 15.65 P值 <0.001 <0.001 注：CM为条件培养基；用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞；时间因素主效应,F=4 592.04,P<0.001；处理因素主效应,F=363.46,P<0.001；两者交互作用,F=3.36,P=0.140 2.3 正常CM和高糖CM中细胞因子的含量
正常CM和高糖CM中共检出28个细胞因子。与正常CM比较,高糖CM中的CXCL1含量明显增多（P=0.015）,CXCL2含量增多（P=0.510）,CXCL8含量减少（P=0.597）,CXCL12含量明显减少（P<0.001）。正常CM和高糖CM中均未检出CXCL3。见图3。
图 3 采用液相悬浮芯片检测常规培养人包皮成纤维细胞7 d的上清液（即正常CM）和用高浓度葡萄糖培养人包皮成纤维细胞 7 d的上清液（即高糖CM）中细胞因子含量注：第1~5列为正常CM,第6~10列为高糖CM；CM为条件培养基,IL为白细胞介素,CXCL为CXC趋化因子配体,CCL为CC趋化因子配体,TNF为肿瘤坏死因子,GM-CSF为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子2.4 HFF中CXCL的mRNA表达
培养7 d,高糖组HFF中CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA表达分别为1.54±0.16、1.51±0.16、1.70±0.08,分别明显高于正常组的0.94±0.19、1.04±0.05、1.00±0.09（t值分别为4.25、4.98、10.04,P值分别为0.009、0.013、0.001）。培养7 d,高糖组HFF中CXCL12的mRNA表达为0.80±0.06,明显低于正常组的1.07±0.10（t=4.10,P=0.015）。
2.5 HaCaT细胞中CXCR4的蛋白表达
培养48 h,正常CM组HaCaT细胞中CXCR4的蛋白表达为0.481±0.059,明显高于高糖CM组的0.267±0.006（t=5.13,P=0.007）。见图4。
图 4 蛋白质印迹法检测的2组HaCaT细胞培养48 h的CXCR4的蛋白表达注：用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞；CM为条件培养基,CXCR4为CXC趋化因子受体4,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带图上方1和2分别表示正常CM组和高糖CM组2.6 CXCL12对高糖CM作用下HaCaT细胞迁移的影响
划痕后24、48 h,高糖CM组HaCaT细胞迁移率较正常CM组和高糖CM+CXCL12组明显降低（P值均<0.05）。划痕后24 h,正常CM+CXCL12组HaCaT细胞迁移率较正常CM组明显降低（P<0.05）；划痕后48 h,正常CM+CXCL12组HaCaT细胞迁移率较高糖CM+CXCL12组明显升高（P<0.05）。见图5和表3。
图 5 4组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移情况 倒置相差显微镜×200。5A、5B、5C、5D.分别为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组划痕后0（即刻）h划痕面积；5E、5F、5G、5H.分别为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组划痕后24 h划痕面积,图5E剩余划痕面积最小,图5E、5F、5H剩余划痕面积小于图5G；5I、5J、5K、5L.分别为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组划痕后48 h划痕面积,图5I、5J中基本未见划痕,图5K剩余划痕面积明显大于图5L注：用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞,分别在正常CM组和高糖CM组处理的基础上用重组人CXCL12处理正常CM+CXCL12组和高糖CM+CXCL12组细胞；CM为条件培养基,CXCL12为CXC趋化因子配体12Table 3. 4组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移率比较（%,组别 样本数 24 h 48 h 高糖CM组 3 16.27±1.10 26.33±3.02 正常CM组 3 55.95±5.73 100 高糖CM+CXCL12组 3 42.05±0.55 86.65±0.24 正常CM+CXCL12组 3 41.49±3.23 100 F值 73.22 1 622.80 P值 <0.001 <0.001 P1值 <0.001 <0.001 P2值 <0.001 <0.001 P3值 0.004 >0.999 P4值 >0.999 <0.001 注：用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞,分别在正常CM组和高糖CM组处理的基础上用重组人CXCL12处理正常CM+CXCL12组、高糖CM+CXCL12组细胞；CM为条件培养基,CXCL12为CXC趋化因子配体12；时间因素主效应,F=1 242.82,P<0.001；处理因素主效应,F=646.70,P<0.001；两者交互作用,F=85.46,P<0.001；F值、P值为组间各时间点总体比较所得；P1值、P2值分别为高糖CM组与正常CM组、高糖CM+CXCL12组比较所得,P3值、P4值分别为正常CM+CXCL12组与正常CM组、高糖CM+CXCL12组比较所得 2.7 CXCL12对高糖CM作用下HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达的影响
培养48 h,正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达分别为0.509±0.055、0.522±0.082、0.247±0.010和0.446±0.050,组间总体比较,差异有统计学意义（F=15.82,P=0.001）。与正常CM组比较,高糖CM组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达明显减少（P<0.001）,正常CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达无明显变化（P=0.784）；与高糖CM组比较,高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达明显增加（P=0.002）；正常CM+CXCL12组与高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达相近（P=0.133）。见图6。
图 6 蛋白质印迹法检测的4组HaCaT细胞培养48 h的CXCR4的蛋白表达注：用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞,分别在正常CM组和高糖CM组处理的基础上用重组人CXCL12处理正常CM+CXCL12组、高糖CM+CXCL12组细胞；CM为条件培养基,CXCL12为CXC趋化因子配体12,CXCR4为CXC趋化因子受体4,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带图上方1、2、3、4分别表示正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组3. 讨论
Fb能够通过自分泌或旁分泌方式释放信号分子（细胞因子和生长因子等）感知和应答组织损伤[15, 16],与创面愈合中的KC、血管内皮细胞、巨噬细胞之间形成连接网[17, 18, 19],在创面愈合的4个阶段（炎症反应期、肉芽组织形成期、再上皮化期和重塑期）中发挥重要调控作用[20, 21]。深入阐明细胞间通讯机制对创面修复策略研究具有重要的理论指导意义。再上皮化是创面愈合过程中的重要环节[22, 23],受KC迁移和增殖的调控。相关研究主要探讨了糖尿病高糖微环境下KC功能障碍的作用机制[24],而对KC与其他细胞间的相互调控机制探索较少。
随着测序技术不断发展,单细胞转录组测序不仅能鉴定出组织细胞异质性、推测细胞分化轨迹,还能进一步分析细胞与细胞间的相互作用[25, 26, 27, 28]。本研究对细胞中的趋化因子受体和趋化因子配体间的相互作用进行了进一步分析,结果显示与急性足外伤患者创缘皮肤组织比较,糖尿病足患者创缘皮肤组织Fb亚群中的趋化因子配体（CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8和CXCL12）和KC亚群中的趋化因子受体（CXCR2和CXCR4）的相互作用明显减弱。研究表明,CXCR2拮抗剂可以通过减轻炎症反应,促进再上皮化,有效促进糖尿病小鼠创面愈合[29]。CXCR4激动剂UCUF-728可以加速糖尿病小鼠创面愈合,使创面愈合时间较未采用CXCR4激动剂治疗的糖尿病小鼠缩短了36%[30]。这提示,CXCR2与CXCR4在创面愈合中发挥重要调节作用[31, 32],靶向抑制CXCR2或激活CXCR4可有效加速糖尿病创面愈合。因此,揭示CXC类趋化因子及其受体在糖尿病创面愈合中的作用机制具有重要的科学意义,可为探究新的糖尿病创面治疗靶点提供方向。
本研究用高浓度葡萄糖培养HFF,收集细胞培养上清液作为高糖CM；同时常规培养HFF,收集细胞培养上清液作为正常CM。用2种CM处理HaCaT细胞,结果显示高糖CM组HaCaT细胞迁移能力较正常CM组减弱。CM中某种趋化因子含量的多少与细胞分泌此趋化因子的能力相关。为进一步明确何种趋化因子抑制KC迁移,本研究团队利用液相悬浮芯片检测HFF的CM中趋化因子含量,利用实时荧光定量RT-PCR技术检测HFF中趋化因子配体的mRNA表达水平。结果显示,与正常CM比较,高糖CM中的CXCL1和CXCL2含量增多,CXCL8和CXCL12含量减少,2种CM中均未检出CXCL3；与正常组比较,高糖组HFF中CXCL12的 mRNA表达显著下调,CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA表达显著上调。据报道,糖尿病小鼠创面组织中CXCL12的mRNA表达较非糖尿病小鼠创面下调[33],与本研究结果一致。本研究团队推测,高糖组HFF中CXCL12表达与分泌减少,可能是导致HaCaT细胞迁移障碍的重要原因。
本研究利用蛋白质印迹法检测HaCaT细胞中CXCR4（CXCL12受体）蛋白表达,结果显示高糖CM组HaCaT细胞中CXCR4表达较正常CM组下降,与高糖组HFF中的CXCL12变化趋势一致。这提示,HFF分泌CXCL12能力下降可能是导致HaCaT细胞中CXCR4表达下调的原因。本研究针对高糖CM中CXCL12含量减少的情况,利用重组人CXCL12蛋白干预不同CM处理的HaCaT细胞,划痕试验结果显示,高糖CM+CXCL12组细胞迁移率较高糖CM组显著升高；蛋白质印迹法检测结果显示,高糖CM+CXCL12组细胞CXCR4蛋白表达量也较高糖CM组显著升高,提示CXCL12蛋白可能通过上调CXCR4来改善高糖CM处理的HaCaT细胞的迁移能力。文献报道,利用CXCL12拮抗剂可以明显延长糖尿病小鼠创面愈合时间,过表达CXCL12则可将创面愈合时间从55 d（未干预的糖尿病小鼠创面愈合时间）缩短至23 d[33, 34, 35],这一研究结果与本研究中外源性重组人CXCL12蛋白加速高糖CM处理的HaCaT细胞迁移的实验结果一致。
综上,本研究证实高糖抑制HFF分泌CXCL12,高糖CM导致HaCaT细胞迁移能力减弱、细胞中CXCR4表达降低,外源性重组人CXCL12可通过上调CXCR4表达增强HaCaT细胞的迁移能力,这在一定程度上揭示了CXCL12在糖尿病创面愈合中的作用,为将其作为难愈性创面治疗靶点提供了理论依据。后续本研究团队将进一步明确CXCL1-CXCR2调控糖尿病创面愈合的机制,及CXCL1与CXCR2、CXCL12与CXCR4间的相互作用,以期为探究多种趋化因子联合治疗难愈性创面的临床方案提供更为可靠的依据。
黎宁：起草文章并开展研究；陈华玲、黄玉群：实施培训；李茂君：采集数据；李海胜：项目指导、培训及经费支持；王丽华：对文章进行审阅所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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表1 2组护士培训前后理论和技能考核得分比较（分，
组别 人数 培训前 培训后 理论考试 技能考核 理论考试 技能考核 联合组 28 74±4 88.9±4.0 90±4 94.8±3.1 常规组 27 72±5 87.3±2.6 85±4 91.3±2.6 t值 -1.26 -1.63 -3.89 -4.24 P值 0.210 0.104 <0.001 <0.001 注：联合组采用思维导图联合情景模拟训练的培训方式，常规组采用理论与操作技能相结合的培训方式 
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表2 2组护士培训前后应急处置能力各维度考核得分比较（分，
组别 人数 培训前 培训后 团队协作能力 应急反应能力 操作技术能力 专科业务能力 护患沟通能力 团队协作能力 应急反应能力 操作技术能力 专科业务能力 护患沟通能力 联合组 28 10.4±1.3 9.4±1.4 13.1±1.3 11.0±1.1 11.3±0.8 16.8±1.3 15.8±1.2 18.1±0.9 16.4±1.1 15.9±0.7 常规组 27 10.2±1.3 9.1±1.1 13.3±1.1 11.2±1.0 11.3±0.8 13.0±1.0 12.2±1.3 17.3±1.4 15.5±1.1 15.4±0.8 t值 -0.55 -0.62 -0.48 -0.76 -0.12 -6.49 -6.44 -2.21 -2.85 -2.34 P值 0.581 0.534 0.630 0.448 0.907 <0.001 <0.001 0.027 0.004 0.019 注：联合组采用思维导图联合情景模拟训练的培训方式，常规组采用理论与操作技能相结合的培训方式
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表3 2组护士培训前后在转运危重高仿真模拟人过程中转运护理措施执行不规范率比较[名（%）]
组别 人数 培训前 培训后 物品准备不全 患者沟通效果不佳 管道护理不到位 交接不清 终末处理不到位 物品准备不全 患者沟通效果不佳 管道护理不到位 交接不清 终末处理不到位 联合组 28 8（28.57） 7（25.00） 8（28.57） 14（50.00） 15（53.57） 1（3.57） 1（3.57） 1（3.57） 2（7.14） 3（10.71） 常规组 27 10（37.04） 10（37.04） 7（25.93） 14（51.85） 14（51.85） 7（25.93） 3（11.11） 3（11.11） 9（33.33） 10（37.04） χ 2值 0.45 1.55 0.05 0.01 0.02 3.87 0.31 0.31 5.89 5.28 P值 0.504 0.214 0.826 0.912 0.898 0.049 0.577 0.577 0.015 0.022 注：联合组采用思维导图联合情景模拟训练的培训方式，常规组采用理论与操作技能相结合的培训方式
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表4 2组护士对培训满意度的比较（分，
组别 人数 培训模式 培训内容 培训效果 总得分 联合组 28 23.9±0.4 22.9±0.3 24.6±0.5 73.3±1.4 常规组 27 19.5±1.0 21.8±0.4 18.5±0.9 64.2±4.2 t值 5.22 0.81 4.67 10.71 P值 <0.001 0.416 <0.001 <0.001 注：联合组采用思维导图联合情景模拟训练的培训方式，常规组采用理论与操作技能相结合的培训方式
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