Application of three-dimensional bioprinting ink containing platelet-rich plasma derived from human umbilical cord blood in the treatment of full-thickness skin defects in nude mice
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摘要:
目的 探讨含人脐血来源富血小板血浆（HUCB-PRP）的海藻酸钠-明胶（AG）生物墨水（称为HUCB-PRP-AG生物墨水）的可打印性能和细胞相容性，及该生物墨水的三维打印组织治疗裸鼠全层皮肤缺损创面的效果。 方法 采用实验研究方法。制备含体积分数2.5%、5.0%、10.0%HUCB-PRP的HUCB-PRP-AG生物墨水，分别命名为1P-AG、2P-AG、4P-AG。取AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG，观察室温下外观，采用旋转流变仪检测黏度、储能模量和损耗模量。利用以上4种生物墨水分别进行三维生物打印并观察打印组织外观（后续使用交联后打印组织），将4种打印组织分别与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在Transwell小室内用HUVEC专用培养基共培养24 h，采用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖水平（样本数为3）；将4种打印组织分别用DMEM培养基培养12、24、48 h，进行干燥称重并计算降解率（样本数为3）；将1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织分别用磷酸盐缓冲液培养0.5、24.0、48.0 h，采用酶联免疫吸附测定法检测培养上清液中血管内皮生长因子（VEGF）的表达（样本数为5）。取16只6~8周龄雌性BALB/c-NU裸鼠建立背部全层皮肤缺损创面模型，分为创面仅覆盖医用水胶体敷料的常规对照组和另予HUCB-PRP滴加的HUCB-PRP组、AG打印组织覆盖的AG组、4P-AG打印组织覆盖的4P-AG组（每组4只），观察每组3只裸鼠伤后4、8、14 d创面愈合情况并计算创面愈合率；取每组剩余裸鼠伤后8 d创面组织，行苏木精-伊红染色后观察组织病理学改变，行免疫组织化学染色后观察CD31阳性新生血管情况。对数据行重复测量方差分析、LSD检验及Bonferroni校正。 结果 在室温下，AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG均呈半透明液态；AG为淡黄色，1P-AG、2P-AG、4P-AG均为淡红色但颜色依次逐渐加深。在温度10 ℃和剪切率0.1~10.0 s-1范围内，AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG的黏度均随着剪切率的增加而减小；在温度10 ℃和角频率1~100 rad/s范围内，4种生物墨水的储能模量均大于损耗模量。4种生物墨水打印组织的分辨率与形态均相近。与1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织共培养24 h的HUVEC增殖水平分别为0.885±0.030、1.126±0.032、1.156±0.045，均明显高于与AG打印组织共培养的HUVEC的0.712±0.019（P<0.01）；与2P-AG、4P-AG打印组织共培养24 h的HUVEC增殖水平均明显高于与1P-AG打印组织共培养的HUVEC（P<0.01）。1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织培养12、24、48 h的降解率均明显高于AG打印组织（P<0.01）；2P-AG、4P-AG打印组织培养24、48 h的降解率均明显高于1P-AG打印组织（P<0.01）；4P-AG打印组织培养12 h的降解率明显高于1P-AG打印组织（P<0.01），培养24、48 h的降解率均明显高于2P-AG打印组织（P<0.01）。培养0.5、24.0、48.0 h，2P-AG打印组织培养上清液中VEGF表达量均明显高于1P-AG打印组织（P<0.01），1P-AG和2P-AG打印组织培养上清液中VEGF表达量均明显低于4P-AG打印组织（P<0.01）。常规对照组与HUCB-PRP组裸鼠伤后8 d创面较伤后4 d干燥且缩小，HUCB-PRP组裸鼠伤后14 d创面较常规对照组缩小且无结痂；AG组、4P-AG组裸鼠伤后4 d创面上打印组织明显降解且创面无明显渗出，伤后8 d创面明显上皮化且缩小，伤后14 d创面无结痂；4P-AG组裸鼠伤后14 d创面完全上皮化。与常规对照组比较，AG组裸鼠伤后4 d创面愈合率明显降低（P<0.05），HUCB-PRP组、4P-AG组裸鼠伤后各时间点及AG组裸鼠伤后8、14 d创面愈合率均明显升高（P<0.01）；与HUCB-PRP组比较，AG组裸鼠伤后4、8 d及4P-AG组裸鼠伤后4 d创面愈合率均明显降低（P<0.01），AG组裸鼠伤后14 d及4P-AG组裸鼠伤后8、14 d创面愈合率均明显升高（P<0.01）；4P-AG组裸鼠伤后各时间点创面愈合率均明显高于AG组（P<0.01）。伤后8 d，常规对照组裸鼠创面组织可见大量炎症细胞浸润、少量新生微血管以及少量CD31阳性新生血管，HUCB-PRP组裸鼠创面组织可见大量炎症细胞浸润、丰富新生微血管以及较多CD31阳性新生血管，AG组裸鼠创面组织可见轻度炎症浸润、少量新生微血管以及少量CD31阳性新生血管，4P-AG组裸鼠创面组织可见轻度炎症浸润、大量新生微血管以及大量CD31阳性新生血管。 结论 HUCB-PRP-AG生物墨水具备良好的可打印性能和细胞相容性，其三维打印组织可促进裸鼠全层皮肤缺损创面血管化，加速创面愈合。 Abstract:Objective To investigate the printability and cytocompatibility of sodium alginate-gelatin (AG) bioink containing platelet-rich plasma derived from human umbilical cord blood (HUCB-PRP), named HUCB-PRP-AG bioink, and the effect of the three-dimensionally printed tissue with the bioink on full-thickness skin defect wounds in nude mice. Methods The method of experimental research was used. HUCB-PRP-AG bioinks with 2.5%, 5.0%, and 10.0% of HUCB-PRP by volume were prepared and named 1P-AG, 2P-AG, and 4P-AG, respectively. The appearances of AG, 1P-AG, 2P-AG, and 4P-AG at room temperature were observed, and their viscosity and storage/loss modulus were measured by a rotational rheometer. The above four bioinks were used for three-dimensional bioprinting respectively, and the appearances of the printed tissue were observed (the printed tissue was subsequently cross-linked and used). The four kinds of bioprinted tissue were respectively co-cultured with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in Transwell chambers with HUVEC special medium for 24 h, and the cell proliferation level was detected by cell counting kit 8 (n=3). The four kinds of bioprinted tissue were respectively cultured in Dulbecco's modified eagle medium for 12, 24, and 48 h, which were dried and weighed, and the degradation rate was calculated (n=3). The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in the culture supernatant of 1P-AG, 2P-AG, or 4P-AG cultured in phosphate buffer solution at 0.5, 24.0, and 48.0 h was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (n=5). Sixteen female BALB/c-NU nude mice aged 6-8 weeks were selected to establish a full-thickness skin defect wound model on the back and were divided into conventional control group with wounds being covered with medical hydrocolloid dressing alone, HUCB-PRP group with additional HUCB-PRP dripping to the wounds, AG group additionally covered with AG printed tissue, and 4P-AG group additionally covered with 4P-AG printed tissue, respectively (with 4 nude mice in each group). The wound healing of 3 nude mice in each group was observed on post injury day (PID) 4, 8, and 14, and the wound healing rate was calculated. The wound tissue of the remaining nude mouse in each group was collected on PID 8, the histopathological changes were observed after hematoxylin and eosin staining, and the CD31-positive new blood vessels were observed after immunohistochemical staining. Data were statistically analyzed with analysis of variance for repeated measurement, least significant difference test, and Bonferroni correction. Results At room temperature, AG, 1P-AG, 2P-AG, and 4P-AG were semi-transparent liquid, and AG was light yellow, while 1P-AG, 2P-AG, and 4P-AG were light red but the color successively deepened. The viscosity of AG, 1P-AG, 2P-AG, and 4P-AG decreased with the increase of shear rate at the temperature of 10 ℃ and shear rate of 0.1-10.0 s-1; the storage moduli of the four bioinks were greater than the loss moduli at the temperature of 10 ℃ and angular frequency range of 1-100 rad/s. Both the resolution and morphology of the printed tissue of four bioinks were similar. The proliferation levels of HUVECs co-cultured with 1P-AG, 2P-AG, and 4P-AG printed tissue for 24 h were 0.885±0.030, 1.126±0.032, and 1.156±0.045, respectively, which were significantly higher than 0.712±0.019 of HUVECs co-cultured with AG printed tissue (P<0.01). The proliferation levels of HUVECs co-cultured with 2P-AG and 4P-AG printed tissue for 24 h were significantly higher than the level of HUVECs co-cultured with 1P-AG printed tissue (P<0.01). The degradation rates of 1P-AG, 2P-AG, and 4P-AG printed tissue were significantly higher than those of AG printed tissue at 12, 24, and 48 h of culture (P<0.01). The degradation rates of 2P-AG and 4P-AG printed tissue at 24 and 48 h of culture were significantly higher than those of 1P-AG printed tissue (P<0.01). The degradation rate of 4P-AG printed tissue at 12 h of culture was significantly higher than that of 1P-AG printed tissue (P<0.01), and the degradation rates of 4P-AG printed tissue at 24 and 48 h of culture were significantly higher than those of 2P-AG printed tissue (P<0.01). At 0.5, 24.0, and 48.0 h of culture, the expressions of VEGF in the culture supernatant of 2P-AG printed tissue were significantly higher than those of 1P-AG printed tissue (P<0.01), and the expressions of VEGF in the culture supernatant of 1P-AG and 2P-AG printed tissue were significantly lower than those of 4P-AG printed tissue (P<0.01). The wounds of nude mice in conventional control group and HUCB-PRP group were dry and smaller on PID 8 compared with those on PID 4, and the wounds of nude mice in HUCB-PRP group were smaller with no scabs on PID 14 compared with those in conventional control group. The printed tissue on the wound of nude mice in AG and 4P-AG groups was significantly degraded with no obvious exudation being observed on the wounds on PID 4, the wounds were significantly epithelialized and smaller on PID 8, and there was no scab on the wound on PID 14. The wounds of nude mice in 4P-AG group were completely epithelialized on PID 14. Compared with those in conventional control group, the wound healing rate of nude mice in AG group was significantly decreased on PID 4 (P<0.05), and the wound healing rates of nude mice in HUCB-PRP group and 4P-AG group at all time points after injury and in AG group on PID 8 and 14 were significantly increased (P<0.01). Compared with those in HUCB-PRP group, the wound healing rates of nude mice were significantly decreased on PID 4 and 8 in AG group and on PID 4 in 4P-AG group (P<0.01), while the wound healing rates of nude mice were significantly increased on PID 14 in AG group and on PID 8 and 14 in 4P-AG group (P<0.01). The wound healing rate of nude mice in 4P-AG group was significantly higher than that in AG group at all time points after injury (P<0.01). On PID 8, a large number of inflammatory cells infiltration, a small amount of new microvessels, and a small amount of CD31-positive new blood vessels were observed in the wounds of nude mice in conventional control group; a large number of inflammatory cells infiltration, abundant new microvessels, and quite a lot CD31-positive new blood vessels were observed in the wounds of nude mice in HUCB-PRP group; light inflammatory inflammation, a small amount of new microvessels, and a small amount of CD31-positive new blood vessels were observed in the wounds of nude mice in AG group; light inflammatory inflammation, a large number of new microvessels, and a large number of CD31-positive new blood vessels were observed in the wounds of nude mice in 4P-AG group. Conclusions HUCB-PRP-AG bioink has good printability and cytocompatibility, and its three-dimensionally printed tissue can promote vascularization of full-thickness skin defect wounds in nude mice and accelerate wound healing. -
创面修复和组织再生受多种因素的影响，大多数小面积创面可以通过皮肤收缩以及上皮细胞的迁移与爬行完成愈合；但当面临大面积深度烧伤、瘢痕畸形矫正后创面以及软组织严重缺损等情况时，人体皮肤自身修复能力不能满足患者对于功能和外观的需求。近年来由于材料学和制造技术的进步，多种基于生物材料制作的真皮支架，已可实现加速创面愈合和显著改善创面修复质量的目标。本文主要就用于构建人工真皮支架的生物材料的相关特性以及基于这些生物材料的人工真皮支架构建策略的最新进展进行综述。
1. 生物材料
当前应用于皮肤组织工程研究的生物材料主要分为以下3类：（1）天然生物材料，包括天然真皮基质——ADM、变性真皮基质和瘢痕真皮基质［1］。（2）生物合成材料，包括胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、弹性蛋白、壳聚糖、角蛋白、海藻酸盐、透明质酸等。（3）有机高分子材料，包括聚烯烃弹性体、聚乙二醇、聚β-羟基丁酸酯、聚乙烯醇、聚己内酯等［2］。这些生物材料在被用于构建人工真皮支架时，各自的优点明显但也存在不足。总体而言，用于构建人工真皮支架的生物材料，应具备良好的生物相容性、生物活性和生物降解性这3个基本特性。
1.1 生物相容性
生物材料的生物相容性最新的定义是材料局部触发和引导宿主蛋白质和细胞进行非纤维化、血管化重建和功能性组织整合的能力［3］。生物相容性材料是指在体内不引起不良宿主反应的材料，在被植入体内后，它们能与宿主组织有效整合且避免免疫排斥所致的炎症反应。免疫系统在支架植入过程中具有重要作用，其一方面决定了材料的生物相容性，另一方面对创面的再生起重要影响。有研究者开发了一种基于生物合成材料右旋糖酐的水凝胶，将该水凝胶应用于动物实验时炎症反应小，能促进巨噬细胞向M2表型极化，可以在小鼠Ⅲ度烧伤创面愈合后形成的瘢痕上促进皮肤和毛发再生［4］。
1.2 生物活性
生物材料的生物活性是指生物材料与生物体内微环境相互作用的能力，具体体现在生物材料力学性能、表面形态、三维多孔结构等特征对细胞的黏附、增殖、迁移等行为的影响［5］。成分越接近宿主组织的生物材料往往表现出越好的生物活性，因此，在支架表面添加ECM成分（如胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白）进行修饰可以构建类似于天然组织的仿生环境，调节细胞行为，提高支架的生物活性。天然ECM的组成成分相近，但成分的比例因组织类型或所处生理/病理状态而异［6］。因此，用于皮肤再生的人工真皮支架中不同生物材料的比例也需要视具体情况而定。
生物材料的生物活性还包括促进血管化的能力。有研究者观察到如果细胞与最近的血管的距离超过200 μm，细胞就会死亡［7］。因此，建立成熟的血管网络是组织工程中的关键环节。另外，生物活性也受到抗菌能力的影响，具有一定抗菌活性的生物材料不仅可以作为物理屏障保护创面从而减少感染，还可以进一步促进Fb的迁移和分化，这一点对于人工真皮支架的临床应用而言至关重要。目前大部分人工真皮支架仍需添加抗菌剂，如季铵类化合物、金属离子、纳米颗粒及抗菌肽等以预防感染。有国外学者采用电纺丝技术，将掺杂不同浓度银离子的羟基磷灰石与聚己内酯电纺丝纳米纤维组合，构建人工真皮支架，通过体外细菌培养实验观察到该含银离子支架对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用，且通过体外成骨细胞实验观察到与无银离子的支架相比，该含银离子支架可显著促进细胞的迁移和增殖［8］。也有研究者将氧化葡聚糖、抗菌肽修饰透明质酸和富血小板血浆（PRP）混合形成水凝胶，并证实该水凝胶对培养的3种病原菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌株具有明显的抑制作用［9］。
1.3 生物降解性
应用于组织工程的生物材料应具有可降解性，并且降解产物无毒易清除且不会破坏正常组织。支架降解过快或者过慢都会影响其支持细胞的功能，并可能诱导细胞坏死或炎症反应，因此生物降解速率可控的胶原蛋白在皮肤组织工程研究与应用中具有光明前景［10］。脂肪族聚酯，比如聚乙烯醇、聚己内酯及其共聚物，因高机械强度、高柔韧性、易加工性和降解产物无毒，也在临床中被广泛应用。胶原蛋白及脂肪族聚酯这2类生物材料不仅可以作为黏附组织支架支持创面愈合过程，还可以作为生物反馈控制的药物输送系统增强组织再生过程。因此，具有药物输送潜力的可生物降解支架在皮肤组织工程中发挥着举足轻重的作用。然而，过度设计可降解结构可能会损害生物材料的机械性能。
随着生物材料学的进一步发展，研究者完全可以通过改变生物材料的成分、结构等，调整优化生物材料的特性，构建能够完全再生皮肤的真皮支架。
2. 人工真皮支架的构建
皮肤组织工程研究中人工真皮支架的构建策略，从早期仅提供机械支撑结构，演变为目前基于生物材料的具有一定生物化学成分和空间构造、模拟目标组织中细胞自然生态的结构［11］。目前这种人工真皮支架构建策略是诱导新生组织形成及实现新生组织的各项功能的必要条件。
生物材料是组织工程的基石。在使用生物材料构建人工真皮支架时，需要充分考虑材料的生物相容性、生物活性、生物降解性和人工真皮支架的临床应用可行性。为了满足这些要求，可以从生物材料成分、空间结构、支架修饰等方面着手人工真皮支架的构建。一方面，人工真皮支架空间结构应保持适当的孔隙率和纤维形态，同时提供细胞附着和组织生长所必需的高表面积体积比。另一方面，许多生物成分如蛋白质、细胞因子和生长因子等都能在皮肤再生和创面愈合的级联反应过程中起重要作用，且均可参与到人工真皮支架的构建修饰之中。理想的人工真皮支架应能模拟天然皮肤的ECM微环境并提供有效的结构支持，介导细胞功能行使，全面恢复皮肤功能的同时预防瘢痕。
2.1 空间结构
人工真皮支架可按空间结构分类，主要包括多孔支架、纤维支架、微粒支架和三维打印支架等。
2.1.1 多孔支架
海绵或泡沫形式的生物材料通常具有由随机分布的孔隙组成的互连结构，该结构对组织再生、血管化和ECM沉积具有重要作用。影响多孔支架性能的主要因素有孔隙大小、孔隙率、孔隙连通性和孔隙形态，这些参数的最佳范围往往取决于生物材料类型和应用部位。
当前主要有几种方法如反蛋白石水凝胶法［12］、冷冻干燥法［13］、高内相乳液法［14］等，可以通过控制孔径参数来调控多孔支架的部分特性。有研究者使用冷冻干燥法，以重组人胶原蛋白和壳聚糖为材料，再与1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺交联，制备了一种孔隙率>90%的多孔支架。该研究团队通过体外研究观察到，可以通过适当增加重组人胶原蛋白浓度或引入壳聚糖来调整支架的膨胀能力、稳定性和机械性能，并在大鼠全层皮肤缺损创面模型上证实，这种支架能够通过促进Fb增殖和ECM在创面中的沉积来加速组织再生［15］。有研究者制作并对比了具有小（孔径200 μm）、中（孔径302 μm）和大（孔径382 μm）孔的明胶支架的性能，通过体外细胞实验研究证实，中孔的明胶支架比小孔或大孔的明胶支架更有利于细胞聚集，从而促进血管生成［16］。另有研究者设计了孔径在400~750 µm的明胶支架，通过体外细胞实验研究观察到，与孔径较小的支架相比，孔径>580 µm的支架更能促进人真皮Fb（HDF）增殖［17］。目前来看，虽然使多孔支架达到促进创面修复最佳效果的孔隙大小等一系列参数尚未明确，但可在仿生正常皮肤空间结构的基础上，根据所使用的生物材料加以改进。
2.1.2 纤维支架
由多种可降解聚合物制成的纤维支架具有理想的促进皮肤创面愈合潜力。纳米纤维支架的结构更接近创面微环境形态，该类支架可以提供支持细胞分化的诱导结构［18］及细胞附着条件［19］，且由于孔径小，因此对微生物的侵袭具有一定抵抗力［20］。此外，纳米纤维结构能够诱导生物分子如蛋白质和DNA的快速扩散和细胞浸润。常用的纳米纤维支架的制造方法包括电纺丝［21］、自组装［22］等。目前，市面上的纤维支架主要包括不载细胞支架（Nevelia®）和载细胞支架（Apligraf®和Transcyte®）［23, 24］。
在临床中应用时，纤维支架上细胞生长易分布不均，细胞浸润较差，造成创面愈合时间随支架厚度增加而显著延长［25］。因此，有必要通过材料学方法对纤维支架进行表面基团修饰或者空间结构修饰，从而进一步改善纤维支架对细胞活性的支持作用。有研究者将聚己内酯电纺纳米纤维材料分别与聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）、海藻酸钠和Ⅰ型胶原蛋白组装在一起开发出3种人工真皮支架，将这些支架分别命名为PEGDA-聚己内酯支架、海藻酸钠-聚己内酯支架和Ⅰ型胶原蛋白-聚己内酯支架。进一步使用HDF进行体外研究观察到，PEDGA-聚己内酯支架对HDF的黏附较另外2种支架好，且显示出良好的吸收和降解特性；海藻酸钠-聚己内酯支架上的HDF表现出较另外2种支架更强的活力；相比于另外2种支架，Ⅰ型胶原蛋白-聚己内酯支架作为皮肤移植物具有更好的生物学和机械特性［26］。另外有研究者从生蛋壳膜中提取和合成可溶性蛋壳蛋白（soluble eggshell protein，SEP），并使用电纺丝技术制成含有3层纳米纤维复合结构的人工真皮支架。该支架外层由聚乙烯醇、壳聚糖和提取的SEP组成，内层由聚环氧乙烷和凝胶组成，中间层掺入生物活性材料氧化锌纳米粒子。评估结果表明，该支架具有足够的稳定性、合适的力学性能和良好的吸水性，其中，SEP和氧化锌纳米粒子可以增强支架的生物相容性。此外，该支架上培养的Fb的扫描电子显微镜照片显示细胞很好地附着在支架上并保持其自然的纺锤形。力学分析表明，与单层纳米纤维结构相比，该3层纳米纤维支架具有合适的抗拉强度和显著增加的断裂伸长率［27］。
2.1.3 微粒支架
微粒支架也是当前临床应用中，尤其是在需要精确程度的位点特异性靶向和受控方式时，如递送特定药物和生长因子时，常用的人工真皮支架类型。通过一系列复杂的设计，微粒支架可以通过与生物分子的相互作用巧妙地激活和控制生物分子的释放。目前已有多种方法被用于制造微粒支架，包括溶剂蒸汽处理、溶剂/非溶剂烧结、水包油分散和选择性激光烧结［28］。然而，微粒支架可能存在生物相容性问题，有证据表明其可能诱导炎症反应和阻碍人体创面再上皮化［29］。
2.1.4 三维打印支架
三维打印支架可满足对材料空间参数的高精度要求，可以通过控制孔隙率和连通性，控制组织再生的方向，实现对微观形态的良好控制。此外，在通过磁共振成像或CT获取对应组织数据和通过数字照片或热图像直接获取创面成像数据后，可以利用计算机辅助设计个性化三维打印支架［30］。目前制备三维打印支架主要采用的是增材制造技术，包括基于细胞和非细胞的三维打印技术。细胞三维打印技术可以分为喷墨式打印、微挤出式打印、激光辅助式打印和立体光刻式打印［31, 32］，非细胞三维打印技术包括选择性激光烧结、选择性激光熔化、电子束熔化、熔融沉积建模和熔融电纺丝［33］。三维打印支架对材料要求很高，Shie等［34］研究并报告了质量分数10%和15%是采用甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）制造三维打印支架的最佳GelMA浓度。后有研究者在此基础上，利用质量分数10%的GelMA设计了一系列具有可调节结构和机械性能的三维打印GelMA支架，通过体外细胞实验研究观察到该系列支架可经增加GelMA刚度来增强纤维化相关基因和蛋白质表达，促进HDF活化，具有改善皮肤真皮愈合和抑制纤维化和瘢痕形成的潜力［35］。
2.2 细胞生物修饰
细胞生物修饰是人工真皮支架构建中的重要内容，可以有效促进创面愈合和皮肤再生。间充质干细胞（MSC）是目前常用的细胞生物修饰选择对象，包括许多不同的细胞类型，其中脂肪来源的MSC（ADSC）能够分化为Fb样表型，产生所有ECM成分，从而可能做到完全恢复真皮结构［36］。有学者总结了22项研究，分析得出将人或鼠源性ADSC嵌入支架中能改善支架性能，增加支架材料的机械强度，将该类支架应用于鼠（包括大鼠、裸鼠等）全层皮肤缺损创面后，缩短了创面的愈合时间［37］。有研究者将人源性ADSC接种在市售ADM（Integra®）支架上，使用HE染色、环境扫描电子显微镜和激光扫描共聚焦显微镜等证实ADSC能被有效地接种在ADM上，并完美融入支架孔隙；且接种了ADSC的ADM的胶原蛋白产量相对于单独的ADM显著提高［38］。目前有更进一步的研究旨在将MSC和ADM与局部药物相结合，制成具有更好创面修复效果的人工真皮支架。例如，有研究者将噻吗洛尔与MSC嵌入市售ADM（Integra®）后应用于小鼠糖尿病创面模型中，对比单纯应用MSC或ADM，复合支架能增强抗炎作用和促进血管生成，显著提升创面的愈合速度［39］。
2.3 生长因子修饰
生长因子在创面愈合过程中能调节细胞行为，然而，由于在人体内半衰期短，其临床应用受限。通过将生长因子与适当的生物材料结合应用可解决此类问题，同时提升支架性能。生物材料可保护各类生物活性分子，同时可提供网络支架结构便于组织再生修复。富血小板血液制品也可提高生物材料的活性，促进组织细胞的增殖和迁移，两者结合相得益彰。如PRP包含高浓度血小板，其被激活后可以释放多种生长因子，包括FGF、EGF、血小板衍生生长因子、VEGF、TGF-β。国内有学者合成了一种负载PRP的多肽纳米纤维水凝胶，有效延长了PRP的作用时间，其缓释效果可以持续4 d；进一步通过在大鼠全层皮肤缺损创面进行实验，对比分别接受单纯PRP、单纯水凝胶以及负载PRP的水凝胶处理后创面中心区域的毛细血管数量、血流灌注量、细胞增殖情况，证实多肽纳米纤维水凝胶联合PRP可协同促进血管再生，加速创面愈合［40］。
3. 总结与展望
人工真皮支架已从以往单纯提供机械支撑发展至能模拟人部分皮肤结构的复合支架，但如何实现完整的皮肤再生仍需进一步研究。即使由于不同部位、不同层次皮肤在纤维蛋白排列、细胞类型、ECM组成、含水量和机械性能方面都不尽相同，对于严重皮肤受损、供皮区稀缺和术后瘢痕等导致皮肤完全或部分功能丧失问题和美观问题，构建并使用合适的人工真皮支架仍是一个理想方案。本文简要讨论了可用于皮肤组织工程研究的生物材料在生物相容性、生物活性及生物降解性方面的具体要求，同时还对真皮支架构建的空间结构修饰策略、活性细胞和细胞因子修饰策略进行了讨论，明确了生物材料应具有良好的生物相容性，而特殊的空间拓扑结构及活性成分的修饰可为真皮支架提供更优的功能。随着组织工程学的进一步发展，未来有望根据实际临床应用所需，在一定生物材料的基础上通过设计合适的空间结构辅以细胞与细胞因子修饰，最终达成创面外观及功能的完全再生。
宋薇、李曌：实验设计、实验操作以及论文撰写；朱世钧：实验操作、数据采集；张超：数据整理与统计分析；姚斌、孔毅、梁莉婷、恩和吉日嘎拉：技术和材料支持；付小兵、黄沙：获取研究经费、对文章的知识性内容作批评性审阅所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 4种生物墨水的表征和流变性能与储能模量/损耗模量比较。1A.大体外观图，室温下均为半透明液态；1B.10 ℃下黏度-剪切率曲线；1C.10 ℃下储能模量/损耗模量-角频率曲线
注：图1A中1、2、3、4与图1B、1C中红色、紫色、蓝色、绿色线均分别指示海藻酸钠-明胶（AG）和含体积分数2.5%、5.0%、10.0%人脐血来源富血小板血浆的AG生物墨水1P-AG、2P-AG、4P-AG；图1C中上方4条虚线为储能模量，下方4条虚线为损耗模量；图1C为经过lg 处理的数据形成的描记图，坐标轴数据为未经lg处理的原始数据
2 4种生物墨水的三维生物打印组织外观相近。2A、2B、2C、2D.分别为AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织
注：AG为海藻酸钠-明胶，1P-AG、2P-AG、4P-AG分别为含体积分数2.5%、5.0%、10.0%人脐血来源富血小板血浆的AG生物墨水
3 4组裸鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合情况。3A、3B、3C与3D、3E、3F.分别为常规对照组与HUCB-PRP组伤后4、8、14 d创面，图3B、3E创面分别较图3A、3D创面干燥且缩小，图3F创面明显小于图3C且无结痂；3G、3H、3I与3J、3K、3L.分别为AG组与4P-AG组伤后4、8、14 d创面，图3G与3J创面上打印组织明显降解且创面无明显渗出，图3H与3K创面上皮化明显（乳白色区域）且图3K创面较图3H与3J明显缩小，图3I创面无结痂且基底鲜红，图3L创面上皮化完全且无结痂
注：4组均用医用水胶体敷料覆盖创面，人脐血来源富血小板血浆（HUCB-PRP）组、海藻酸钠-明胶（AG）组、4P-AG组另分别行HUCB-PRP滴加、AG打印组织覆盖、4P-AG打印组织覆盖，4P-AG为含体积分数10.0% HUCB-PRP的AG生物墨水
4 4组裸鼠全层皮肤缺损创面伤后8 d组织病理学变化与CD31阳性新生血管（棕色）情况。4A、4B、4C、4D.分别为常规对照组、HUCB-PRP组、AG组、4P-AG组创面组织，图4A创面基底有大量炎症细胞浸润和少量新生微血管，图4B创面基底可见大量炎症细胞浸润和丰富新生微血管，图4C创面基底可见轻度炎症浸润和少量新生微血管，图4D创面基底可见轻度炎症浸润和大量新生微血管 苏木精-伊红（HE）×50；4E、4F、4G、4H.分别为图4A、4B、4C、4D中方框处放大图，可明显观察到新生微血管情况 HE×400；4I、4J、4K、4L.分别为常规对照组、HUCB-PRP组、AG组、4P-AG组创面组织，图4I和4K均有少量CD31阳性新生血管，图4J有较多CD31阳性新生血管，图4L有大量CD31阳性新生血管 CD31-二氨基联苯胺×400
注：4组均用医用水胶体敷料覆盖创面，人脐血来源富血小板血浆（HUCB-PRP）组、海藻酸钠-明胶（AG）组、4P-AG组另分别行HUCB-PRP滴加、AG打印组织覆盖、4P-AG打印组织覆盖，4P-AG为含体积分数10.0% HUCB-PRP的AG生物墨水；图4A~4D中D为创缘真皮组织，E为创缘表皮组织，N/E为新生表皮组织，N/D为新生真皮组织，黑色虚线为N、E、N/E与N/D的分界线
表1 4种生物墨水三维打印组织培养各时间点降解率比较（%，
材料名称 样本数 12 h 24 h 48 h AG打印组织 3 1.23±0.07 3.57±0.12 7.47±0.06 1P-AG打印组织 3 1.53±0.06a 4.07±0.06a 7.77±0.06a 2P-AG打印组织 3 1.63±0.06a 4.27±0.06ab 8.07±0.06ab 4P-AG打印组织 3 1.77±0.06ab 4.53±0.06abc 8.90±0.10abc 注：AG为海藻酸钠-明胶，1P-AG、2P-AG、4P-AG分别为含体积分数2.5%、5.0%、10.0%人脐血来源富血小板血浆的AG生物墨水；处理因素主效应，F=41 941.00，P<0.001；时间因素主效应，F=316.70，P<0.001；两者交互作用，F=63.69，P<0.001；与AG打印组织比较，aP<0.01；与1P-AG打印组织比较，bP<0.01；与2P-AG打印组织比较，cP<0.01 
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表2 3种生物墨水三维打印组织培养各时间点上清液中VEGF的表达比较（pg/mL，
材料名称 样本数 0.5 h 24.0 h 48.0 h 1P-AG打印组织 5 29.6±0.6 185.4±1.8 199.9±1.0 2P-AG打印组织 5 117.3±1.0a 387.4±3.2a 408.0±1.6a 4P-AG打印组织 5 314.2±2.6ab 547.2±3.3ab 569.4±1.5ab 注：AG为海藻酸钠-明胶，1P-AG、2P-AG、4P-AG分别为含体积分数2.5%、5.0%、10.0%人脐血来源富血小板血浆的AG生物墨水；处理因素主效应，F=14 613.00，P<0.001；时间因素主效应，F=66 236.00，P<0.001；两者交互作用，F=1 275.00，P<0.001；与1P-AG打印组织比较，aP<0.01；与2P-AG打印组织比较，bP<0.01
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表3 4组裸鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合率比较（%，
组别 样本数 4 d 8 d 14 d 常规对照组 3 10.2±0.8 52.3±1.2 71.3±0.8 HUCB-PRP组 3 35.4±1.7a 72.3±0.3a 85.8±0.5a AG组 3 6.7±1.0bc 60.4±1.1ac 89.6±0.6ac 4P-AG组 3 24.2±2.9acd 78.3±0.8acd 98.6±0.8acd 注：4组均用医用水胶体敷料覆盖创面，人脐血来源富血小板血浆（HUCB-PRP）组、海藻酸钠-明胶（AG）组、4P-AG组另分别行HUCB-PRP滴加、AG打印组织覆盖、4P-AG打印组织覆盖，4P-AG为含体积分数10.0% HUCB-PRP的AG生物墨水；处理因素主效应，F=9 258.00，P<0.001；时间因素主效应，F=650.70，P<0.001；两者交互作用，F=105.10，P<0.001；与常规对照组比较，aP<0.01，bP<0.05；与HUCB-PRP组比较，cP<0.01；与AG组，dP<0.01
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