A prospective study of the perforator evaluation and eccentric design of anterolateral thigh flap based on superficial fascial perforators assisted by modified computed tomography angiography
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摘要:
目的 通过改良CT血管造影（CTA）术，探讨基于浅筋膜穿支的股前外侧皮瓣术前全程穿支评估与术中偏心设计，并观察其临床效果。 方法 采用前瞻性观察性研究方法。2021年1月—2022年7月，滨州医学院附属医院手（显微）外科和口腔颌面外科共收治符合入选标准的12例口腔颌面部肿瘤患者及10例上肢开放性损伤伴大面积软组织缺损患者，其中男12例、女10例；年龄33~75岁，平均56.6岁。口腔颌面部肿瘤患者均在同期行肿瘤扩大切除+根治性颈部淋巴结清扫术后采用股前外侧皮瓣重建口腔或颌面；上肢软组织缺损患者在Ⅰ期行彻底清创后，于Ⅱ期采用股前外侧皮瓣修复创面。清创后创面面积为3.5 cm 结果 改良CTA检查的总辐射剂量小于传统CTA检查。共观察到双侧供区穿支48支，其中31支（64.6%）向外下方走行、9支（18.8%）内下方走行、6支（12.5%）外上方走行、2支（4.2%）内上方走行，浅筋膜穿支平均长度为19.94 mm。术前观测到的目标穿支来源及其源动脉管径、走行、分支与术中探查到的基本一致；术前观察到肌间隙型（含肌皮-肌间隙）穿支15支、肌皮型穿支10支，与术中探查一致；术前体表穿支穿出点标记与术中实际穿支穿出点距离为（0.38±0.11）mm。术后皮瓣均成活，无血管危象发生；5例患者植皮供区创面及17例患者直接拉拢缝合供区创面均愈合良好。术后随访2个月~1年，平均8.2个月，皮瓣质地柔软、轻度臃肿；口腔颌面部肿瘤患者的饮食、闭开口活动无障碍，舌癌患者的言语功能轻度障碍但能完成基本的语言交流，上肢软组织损伤患者腕及肘关节、前臂旋转功能无明显受限；股部供区无明显紧绷感，髋、膝关节活动无受限。 结论 对股前外侧皮瓣供区行改良CTA可视化重建，能够评估全程穿支，尤其是浅筋膜穿支，将该皮瓣用于重建口腔或颌面及修复上肢皮肤软组织缺损可取得良好效果。术前明确穿支类型、数目、来源以及穿支穿出点分布及其源动脉的管径、走行、分支，实现了以浅筋膜穿支整体为中心的股前外侧皮瓣偏心设计，有较强的指导价值。 Abstract:Objective To explore the preoperative whole perforator evaluation and intraoperative eccentric design of anterolateral thigh flap (ALTF) based on superficial fascial perforators by modified computed tomography angiography (CTA), and the clinical effects were observed. Methods A prospective observational study was adopted. Twelve patients with oral and maxillofacial tumors and 10 patients with open injury of the upper limb with large soft tissue defects were hospitalized in the Department of Hand & Microsurgery and Department of Oral & Maxillofacial Surgery of Affiliated Hospital of Binzhou Medical University from January 2021 to July 2022, with 12 males and 10 females, aged from 33 to 75 years, an average age of 56.6 years. The wounds of the patients with oral and maxillofacial tumors were reconstructed by ALTF after the extensive tumor resection and radical cervical lymph node dissection in the same stage; the wounds of the patients with skin and soft tissue defect on the upper limb were covered by ALTF in stage Ⅱ after debridement in stage Ⅰ. After debridement, the area of wound was 3.5 cm×3.5 cm-25.0 cm×10.0 cm and the area of the required flap area was 4.0 cm×4.0 cm-23.0 cm×13.0 cm. Modified CTA scan was performed on the donor site of ALTF before the operation, with the parameters of modified CTA being set to mainly reduce the tube voltage and tube current, and increase the contrast dose and the dual phase scan. The acquired image data were sent to GE AW 4.7 workstation and adopted the volume reconstruction function for visual reconstruction and evaluation of the whole perforator. The information of perforator and source artery was marked on the body surface before operation according to the above evaluation. During the operation, an eccentric flap centered on the visible superficial fascia whole perforator was designed and cut according to the desired flap area and shape. The donor sites of the flap were repaired by direct sutures or full-thickness skin grafts. The total radiation dose was compared between the modified CTA scan and the traditional CTA scan. The distribution of outlet point of perforator of double thighs, the length and direction of superficial fascia perforators based modified CTA were recorded. The type, number, and origin of the target perforator, distribution of of outlet point of perforator, and the diameter, course, and branch of the source artery observed before the operation were compared with those observed during the operation. The healing of donor site wound and the survival of flaps in recipient site were observed after operation. The texture and appearance of flap, oral and upper limb functions, and the functions of femoral donor sites were followed up. Results The total radiation dose of modified CTA scan was lower than that of the traditional CTA scan. A total of 48 perforators of double thighs were observed, among which, 31 (64.6%) perforators went outward and downward, 9 (18.8%) perforators went inward and downward, 6 (12.5%) perforators went outward and upward, and 2 (4.2%) perforators went inward and upward, and the average length of superficial fascia perforators was 19.94 mm. The preoperative observed type, number, and source of the perforator, the distribution of the outlet point of the perforator, diameter, course, and branches of the source artery were basically consistent with the intraoperative exploration. The types of 15 septocutaneous (including musculoseptocutaneous) perforators and 10 musculocutaneous perforators observed before the operation was consistent with intraoperative exploration. The distance between the mark of the surface perforator point and the actual exit point of the perforator during operation was (0.38±0.11) mm. All flaps survived without vascular crisis. The donor site wounds of 5 cases of skin grafting and 17 cases of direct suturing wounds healed well. The postoperative follow-up was 2 months to 1 year, with an average of 8.2 months, the flaps were soft and slightly bloated; the function of diet and mouth closing was accessible in patients with oral and maxillofacial tumors, the speech function was mildly impaired in patients with tongue cancer, but they could complete basic oral communication; the wrist and elbow joints and forearm rotation function were not significantly limited in patients with upper limb soft tissue injuries; there was no obvious tightness in the donor sites, and the function of the hip and knee joints was not limited. Conclusions The whole perforator and even the subcutaneous perforator of the donor site of ALTF can be evaluated by modified CTA, and the flap can be used in oral or maxillofacial reconstruction and repair of skin and soft tissue defects of upper limbs to achieve good results. By clarifying the type, number, and source of the perforator, the distribution of the outlet point of the perforator, diameter, course, and branches of the source artery before the operation, the eccentric design of the ALTF based on the superficial fascia perforator was realized. This study has strong guiding value. -
Key words:
- Surgical flaps /
- Angiography /
- Computed tomography /
- Wound repair /
- Anterolateral thigh flap /
- Perforator
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(1)制备了负载银离子和脂肪干细胞的抗菌型水凝胶，对其进行了物理性能和生物学性能表征。
(2)根据该水凝胶的性质，基于三维生物打印技术制备了双层结构的抗菌型水凝胶，验证了该水凝胶可促进大鼠全层皮肤缺损创面愈合。
各种急慢因素导致的皮肤缺损是亟待解决的重要临床问题之一，水凝胶敷料为创面修复提供了新的治疗材料［1］。然而，水凝胶敷料的湿性环境可能有助于细菌生长［2］。纳米银作为一种高效的抗菌材料，具有抗菌谱广、耐药性低、安全性高等优良特点［3, 4, 5］。本研究团队在前期工作中将纳米银加入胶原/壳聚糖支架中，使该支架具有抗菌性能，从而控制创面炎症并促进创面有序修复［6］。
近年来，三维生物打印技术的快速发展为创面敷料及组织支架的制备提供了快速精准的方法［7, 8］。挤出式打印因成本相对较低，可选择的生物墨水种类较多，成为目前应用最广的打印技术［9］。生物墨水是指具有三维打印成形能力并包裹活细胞或者可用于包裹活细胞的生物材料［10, 11］。常见的生物墨水包括胶原、明胶和甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）等，GelMA具有可调节的生物和机械性能及快速成胶机制。本研究团队拟基于三维生物打印技术利用不同浓度的GelMA构建双层水凝胶结构，同时负载纳米银，以期获得具有抗菌性能的水凝胶，并将其应用于大鼠全层皮肤缺损创面，探索该水凝胶对创面修复的影响。
1. 材料与方法
本研究中动物实验通过浙江大学医学院附属第二医院动物伦理委员会批准，批号：2019-063号；细胞实验通过浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会批准，批号：审研2020-036。
1.1 动物、细胞、菌株及主要试剂与仪器来源
18只健康清洁级体重220~250 g的4~6周龄雄性SD大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。
纳米银溶液购自上海沪正纳米科技有限公司，GelMA由浙江大学高分子科学与工程系王利群教授实验室惠赠，高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、中性蛋白酶、Ⅰ型胶原酶购自美国Gibco公司，光交联剂购自日本TCI公司，细胞计数试剂盒8（CCK-8）购自上海碧云天生物技术有限公司，细胞活力（活死细胞染色）检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922购自美国模式培养物集存库公司。扫描电子显微镜购自德国Zeiss公司，光学显微镜及摄像系统、酶标仪购自日本Olympus公司，倒置荧光显微镜购于德国莱卡公司，Regenovo型三维生物打印机购自杭州捷诺飞生物科技股份有限公司，电感耦合等离子体质谱仪购自美国PerkinElmer公司，Pannoramic 250 FLASH Ⅲ型数字全景扫描仪购于匈牙利3DHISTECH公司。
1.2 纳米银和含银GelMA水凝胶的物理化学表征
1.2.1 纳米银颗粒的形态和粒径及分布
取10、50、100 mg/L的纳米银溶液各1滴，分别滴在盖玻片上，经60 ℃恒温干燥箱烘干后，分别在100 000、500 000倍扫描电子显微镜下观察纳米银颗粒的形态、粒径及分布。
1.2.2 含银GelMA水凝胶的孔隙结构
分别将蓝光照射交联（下同）后GelMA终质量分数为10%、15%、20%的含银GelMA水凝胶浸没于PBS中，水凝胶溶胀平衡后，用冷冻干燥机干燥24 h。于真空下将材料纵切面喷金后，在200倍扫描电子显微镜下观察孔隙微观结构并拍照记录，采用ImageJ 1.8图像分析软件（美国国立卫生研究院）计算孔径大小。样本数为3。
1.3 含银GelMA水凝胶的纳米银释放浓度测定
将0.2 mL 20 mg/L纳米银溶液与0.2 mL质量分数30% GelMA混匀后获得含终质量分数15% GelMA和终质量浓度10 mg/L纳米银的水凝胶，交联制成直径为15 mm、高度为2.0 mm的含银GelMA水凝胶。猪全层皮肤缺损创面愈合过程的前3周胶原酶含量为2 U/mL［12］。将上述含银GelMA水凝胶置于3 mL 2 U/mLⅠ型胶原酶溶液中，分别于处理1、3、7、14 d，取上清液，采用质谱仪检测纳米银释放浓度。样本数为3。
1.4 含银GelMA水凝胶的抗菌性测试
先将金黄色葡萄球菌ATCC 25923和大肠埃希菌ATCC 25922复苏，然后采用平板划线法将2种细菌分别接种于普通血琼脂平板后倒置于恒温细胞培养箱中，37 ℃培养24 h。分别将含终质量浓度0（无纳米银）、25、50、100 mg/L纳米银和质量分数15% GelMA的GelMA水凝胶平铺于前述血琼脂平板表面，培养24 h，观察并测量其抑菌圈的直径。样本数为3。
1.5 纳米银溶液的细胞毒性实验和含银GelMA水凝胶的生物相容性检测
1.5.1 原代Fb和脂肪干细胞（ASC）的提取与培养
取浙江大学医学院附属第二医院泌尿外科2020年7月收治的1名健康5岁男童包皮环切术后废弃包皮（经患儿父母同意）和该院整形外科2020年7月收治的1名健康23岁女性抽脂手术后废弃脂肪（经患者同意），采用酶解法分离提取Fb和ASC，均培养至第3~6代用于后续实验。
1.5.2 Fb加入纳米银溶液后的细胞增殖活性
将Fb以每孔5×104个的密度接种于48孔板中，分为空白对照组、2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组、10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组、50 mg/L纳米银组。空白对照组Fb仅采用高糖DMEM培养基培养，其余5组Fb分别采用含相应终质量浓度的纳米银的DMEM培养基培养。培养48 h，用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，以此表示Fb的增殖活性。样本数为3。
1.5.3 在含银GelMA水凝胶表面种植Fb后的细胞增殖活性
将Fb分为0 mg/L含银GelMA水凝胶组、10 mg/L含银GelMA水凝胶组、50 mg/L含银GelMA水凝胶组、100 mg/L含银GelMA水凝胶组，分别将160 μL的含0、10、50、100 mg/L纳米银的GelMA水凝胶加入至48孔板中，交联后，将Fb以每孔5×104个的密度接种于含银GelMA水凝胶上。分别于培养1、3、7 d，同1.5.2检测Fb的吸光度值，以此表示Fb的增殖活性。样本数为3。
1.5.4 ASC与GelMA水凝胶混合种植后的细胞增殖活性
将1×106个/mL ASC均匀混合于1 mL含质量分数10% GelMA的GelMA水凝胶中。将部分上述水凝胶以每孔160 μL加入至48孔板中，交联后，设为非打印组；部分上述水凝胶利用三维生物打印形成圆形网格状结构（直径15 mm、高度1.5 mm、孔径1.5 mm），打印完成并交联后移至48孔板中，设为三维生物打印组。分别于培养1、3、7 d，同1.5.2检测ASC的吸光度值，以此表示Fb的增殖活性。样本数为3。
1.5.5 ASC与GelMA水凝胶混合种植后的生物相容性
取GelMA水凝胶和ASC同1.5.4分组及处理，加入DMEM培养基培养5 d。分别于培养1、3、5 d，按细胞活力检测试剂盒说明书加入适量试剂，置于100倍倒置荧光显微镜下观察。活细胞显示为绿色荧光，死细胞显示为红色荧光。样本数为3。
1.6 4种三维生物打印GelMA支架的制备
取1.5×106个/mL ASC 1 mL与质量分数为15% GelMA水凝胶2 mL混匀，得到含5×105个/mL ASC及质量分数为10% GelMA的ASC/GelMA水凝胶。取200 mg/L纳米银溶液1 mL与质量分数为20%的GelMA 3 mL混匀，得到含50 mg/L纳米银及终质量分数15% GelMA的含银GelMA水凝胶。先将ASC/GelMA水凝胶注入三维生物打印机料筒中，打印圆形网格状结构。然后将含银GelMA水凝胶注入三维生物打印机料筒中，在圆形网格状结构上打印圆形实心结构（直径15 mm、高度0.5 mm），交联后，获得水凝胶支架/纳米银/ASC支架。参照上述方法，分别制备出下层为高度1.5 mm的含质量分数10% GelMA水凝胶实心结构、上层为高度0.5 mm的含质量分数15% GelMA水凝胶实心结构的单纯水凝胶支架，下层为高度1.5 mm的含质量分数10% GelMA水凝胶实心结构、上层为高度0.5 mm的纳米银为50 mg/L的含银GelMA水凝胶实心结构的水凝胶/纳米银支架，下层为高度1.5 mm的10% GelMA水凝胶网格状结构、上层为高度0.5 mm的纳米银为50 mg/L的含银GelMA水凝胶实心结构的水凝胶支架/纳米银支架。
1.7 三维生物打印抗菌型水凝胶支架对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响
1.7.1 模型制备及分组处理
将18只大鼠常规麻醉备皮，在脊柱两边对称位置制作4个直径为1.5 cm的圆形全层皮肤缺损创面，一边2个且相邻创面之间的最小间隔≥2 cm。以大鼠的头部朝向为上，将每只大鼠的左上方创面纳入单纯水凝胶组，右上方创面纳入水凝胶/纳米银组，左下方创面纳入水凝胶支架/纳米银组，右下方创面纳入水凝胶支架/纳米银/ASC组，每组18个创面，分别植入相应支架。创面消毒后包扎，单笼饲养，隔1~2 d换药。
1.7.2 创面大体情况和愈合率
选择6只大鼠分别于伤后4、7、14、21 d换药时，观察创面愈合情况并拍照。采用ImageJ图像分析软件测量创面面积，并计算创面愈合率。
1.7.3 创面组织病理学变化
分别于伤后7、14、21 d，将6只大鼠同前麻醉后，收集背部创面及距创缘0.5 cm内的组织。用40 g/L多聚甲醛固定创面组织48 h后，常规石蜡包埋、切片（厚度为6 μm）。取伤后7、14 d每组6张切片，常规行HE染色后，用数字全景扫描仪进行扫描，采用NDP图像分析软件（日本滨松光子学株式会社）观察并截取1.25、2.50倍镜下图片，观察组织病理学改变；另取伤后21 d每组3张切片，行Masson染色后，于200倍光学显微镜下观察胶原排列情况。
1.8 统计学处理
采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 纳米银颗粒的形态和粒径分布
不同质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒均呈圆形，散在分布，粒径均匀。纳米银颗粒的分布随着纳米银溶液浓度的升高而变得紧密。见图1。
1 3种质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒的形态。1A.100 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒散在分布 扫描电子显微镜×100 000；1B.50 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒分布较图1A稀疏 扫描电子显微镜×100 000；1C.10 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒分布较图1B更加稀疏 扫描电子显微镜×100 000；1D.10 mg/L的纳米银溶液里，纳米银颗粒呈圆形，粒径较均匀 扫描电子显微镜×500 0002.2 含银GelMA水凝胶的孔隙结构
含不同终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶都呈现大小不一且相互连通的孔隙结构，且孔隙壁随着质量分数的增加而增厚，见图2。含终质量分数10%、15%、20% GelMA的含银GelMA水凝胶孔径分别为（292±88）、（206±55）、（184±64）μm，总体比较，差异有统计学意义（F=9.93，P<0.001）。含质量分数10% GelMA的含银GelMA水凝胶的孔径明显大于含质量分数15%和20% GelMA的含银GelMA水凝胶（P值分别为0.002、<0.001）。含质量分数15%和20% GelMA的含银GelMA水凝胶孔径比较，差异无统计学意义（P=0.401）。
2 含3种终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶冻干后的孔隙结构 扫描电子显微镜×200。2A、2B、2C.分别为含终质量分数10%、15%、20% GelMA的含银GelMA水凝胶，图2B较图2A致密，图2C较图2B致密注：GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶2.3 含银GelMA水凝胶的纳米银释放浓度
处理1、3、7 d，含银GelMA水凝胶的体外纳米银释放浓度的变化趋势相对平缓；处理14 d，其体外纳米银释放浓度迅速增加。见图3。
2.4 含银GelMA水凝胶的抗菌性
培养24 h，含0、25、50、100 mg/L纳米银的GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌产生的抑菌圈直径分别为0、0、0.7、2.1 mm和0、1.4、3.2、3.3 mm。
2.5 纳米银溶液的细胞毒性及含银GelMA水凝胶的生物相容性
2.5.1 Fb加入纳米银溶液后的细胞增殖活性
培养48 h，空白对照组、2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组、10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组及50 mg/L纳米银组Fb的增殖活性分别为0.4210±0.0327、0.5757±0.0381、0.6170±0.0193、0.3137±0.0295、0.1810±0.0083、0.1783±0.0021，组间总体比较，差异有统计学意义（F=113.10，P<0.001）。2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组Fb的增殖活性均明显高于空白对照组（P<0.001），10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组、50 mg/L纳米银组Fb的增殖活性均明显低于空白对照组（P值分别为0.001、<0.001、<0.001）。
2.5.2 在含银GelMA水凝胶表面种植Fb后的细胞增殖活性
与0 mg/L含银GelMA水凝胶组相比，培养1 d，50 mg/L含银GelMA水凝胶组、100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性均明显降低（P值分别为0.045、<0.001），10 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性无明显变化（P=0.591）；培养3 d，50 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显升高（P=0.010），100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显降低（P=0.001），10 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性无明显变化（P=0.140）；培养7 d，100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显降低（P=0.022），50 mg/L含银GelMA水凝胶组和10 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性均无明显变化（P值分别为0.671、0.052）。见表1。
表1 4组含银GelMA水凝胶表面种植人成纤维细胞培养各时间点的细胞增殖活性比较（组别 样本数 1 d 3 d 7 d 0 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.115±0.015 0.163±0.021 0.351±0.084 10 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.118±0.023 0.199±0.050 0.362±0.037 50 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.078± 0.015a 0.237±0.021a 0.453±0.099 100 mg/L含银GelMA水凝胶组 3 0.022±0.021a 0.044±0.026a 0.220±0.075a F值 17.97 28.49 8.90 P值 0.001 <0.001 0.006 注：GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；时间因素主效应，F=162.47，P<0.001；处理因素主效应，F=32.61，P<0.001；两者交互作用，F=3.46，P=0.130；与0 mg/L含银GelMA水凝胶组相比，aP<0.05 2.5.3 ASC与GelMA水凝胶混合种植后的细胞增殖活性
培养1 d，三维生物打印组的ASC增殖活性与非打印组相近（P>0.05）；培养3、7 d，三维生物打印组的ASC增殖活性均明显高于非打印组（P<0.05）。见表2。
表2 2组人ASC与GelMA水凝胶混合种植后培养各时间点的细胞增殖活性比较（组别 样本数 1 d 3 d 7 d 非打印组 3 0.218±0.028 0.367±0.031 0.598±0.058 三维生物打印组 3 0.244±0.027 0.739±0.042 1.516±0.219 t值 2.04 21.50 12.95 P值 0.058 <0.001 <0.001 注：ASC为脂肪干细胞，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；时间因素主效应，F=95.60，P<0.001；处理因素主效应，F=79.67，P<0.001；两者交互作用，F=27.94，P<0.001 2.5.4 ASC与GelMA水凝胶混合种植的生物相容性
培养1 d，三维生物打印组和非打印组ASC仍呈圆形、均未伸展，且三维生物打印组死细胞数略多于非打印组。培养3、5 d，三维生物打印组和非打印组绝大多数ASC为活细胞，且2组细胞逐渐呈伸展状态。见图4。
4 2组人ASC与GelMA水凝胶混合种植后培养各时间点活/死细胞情况 钙黄绿素-溴乙啡锭×100。4A、4B、4C.分别为非打印组培养1、3、5 d情况，图4B、4C细胞较图4A伸展；4D、4E、4F.分别为三维生物打印组培养1、3、5 d情况，其中图4D的死细胞略多于图4A，图4E、4F的活细胞数分别多于图4B、4C注：ASC为脂肪干细胞，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；活细胞显示为绿色荧光，死细胞显示为红色荧光2.6 三维生物打印抗菌型水凝胶支架对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响
2.6.1 创面大体情况和愈合率
伤后4 d，单纯水凝胶组和水凝胶/纳米银组大鼠创面中的渗液较多，水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面干燥且未见明显感染迹象。伤后7 d，单纯水凝胶组和水凝胶/纳米银组大鼠创面中仍有少量渗液，水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面干燥结痂。伤后14 d，4组大鼠创面上的水凝胶均脱落，单纯水凝胶组、水凝胶/纳米银组和水凝胶支架/纳米银组大鼠创面基底呈淡红色，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面基本愈合。伤后21 d，单纯水凝胶组大鼠仍有少量创面未愈，其余3组大鼠创面已明显闭合。见图5。
5 4组大鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合情况。5A、5B、5C.分别为单纯水凝胶组伤后7、14、21 d创面情况，伤后7 d创面渗液较多，伤后21 d仍有部分创面未愈；5D、5E、5F.分别为水凝胶/纳米银组伤后7、14、21 d创面情况，图5D与图5A创面面积相近，图5E大部分创面愈合；5G、5H、5I.分别为水凝胶支架/纳米银组伤后7、14、21 d创面情况，图5G创面相对干燥，图5H创面基底红润，图5I创面已愈合；5J、5K、5L.分别为水凝胶支架/纳米银/脂肪干细胞组伤后7、14、21 d创面情况，图5L创面完全上皮化且无结痂注：每个创面周围缝合内径1.6 cm、外径2.5 cm的圆形硅胶圈伤后4、7 d，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率明显高于其他3组（P值均<0.05）。伤后14 d，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率明显高于水凝胶/纳米银组和单纯水凝胶组（P值分别为0.038、<0.001），水凝胶支架/纳米银/ASC组与水凝胶支架/纳米银组的创面愈合率相近（P=0.279）。伤后21 d，单纯水凝胶组大鼠创面愈合率明显低于水凝胶支架/纳米银/ASC组（P<0.001），水凝胶支架/纳米银/ASC组与水凝胶支架/纳米银组和水凝胶/纳米银组的大鼠创面愈合率相近（P值分别为0.429、0.575）。见表3。
表3 4组全层皮肤缺损大鼠创面伤后各时间点创面愈合率比较（%，组别 创面数（个） 4 d 7 d 14 d 21 d 单纯水凝胶组 6 16.7± 8.4a 25.2±8.5a 89.7±3.9a 95.7±2.1a 水凝胶/纳米银组 6 22.5± 11.2a 39.4±4.9a 93.2±3.7a 99.3±0.9 水凝胶支架/ 纳米银组 6 28.3± 9.4a 47.1±4.6a 95.0±2.7 99.5±0.8 水凝胶支架/纳米银/ 脂肪干细胞组 6 41.4± 8.1 56.0±2.6 96.9±2.2 100±0 F值 10.13 42.63 6.30 11.08 P值 <0.001 <0.001 0.002 <0.001 注：时间因素主效应，F=730.50，P<0.001；处理因素主效应，F=26.17，P<0.001；两者交互作用，F=5.90，P<0.001；与水凝胶支架/纳米银/脂肪干细胞组相比，aP<0.05 2.6.2 创面组织病理学变化
伤后7 d，4组大鼠创面上的水凝胶均保持在位，但与单纯水凝胶组相比，其余3组的水凝胶与创面黏附更加紧密，且部分与创面新生组织相融合。伤后14 d，单纯水凝胶组的水凝胶已与创面脱离，而其余3组仍有部分水凝胶存在于创面新生组织中，且水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面中可见水凝胶支架下层网格状结构的横截面。伤后14 d的4组大鼠创面间距均较伤后7 d缩小。
伤后21 d，单纯水凝胶组大鼠创面胶原沉积呈团状、排列无序、成熟度较低，而水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组、水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面胶原交错分布，排列相对有序；水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组大鼠创面胶原排列较稀疏，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面胶原排列更致密。
3. 讨论
理想的创面敷料应具有抗菌和溶胀特性，以抑制细菌生长并及时吸收创面渗液［13, 14］。纳米银作为一种常见的纳米颗粒，对多种细菌具有高效的抗菌作用［3，15］。纳米银粒径小、表面积大的独特结构，可以与细菌DNA和某些特定的蛋白基团迅速结合，从而杀灭细菌［16］。纳米银除了具有高效的抗菌作用外，同时具有浓度依赖性的细胞毒性［17］。因此，应用时需要寻找到一个合适的纳米银浓度平衡抗菌作用以及细胞毒性。
在本研究中，GelMA水凝胶具有相互连通的孔隙结构，孔径随GelMA质量分数的增加而减小，能及时吸收创面渗液并维持创面的湿性愈合微环境。与直接应用纳米银溶液不同，当将纳米银包裹在GelMA水凝胶中后，还需要检测纳米银是否能从交联后的GelMA中被顺利释放。含银GelMA水凝胶的纳米银释放结果显示其能缓慢释放纳米银，处理14 d后，纳米银释放浓度迅速增加。有研究显示，水凝胶中的纳米银质量浓度>200 mg/L就能杀灭金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌［18, 19］。在本研究中，当纳米银质量浓度≥50 mg/L时，含银GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌同时具有抗菌作用。有研究显示，纳米银对小鼠创面愈合过程中的Fb及KC均具有毒性，且对小鼠Fb的毒性质量浓度低至4 mg/L［20］。而在含银GelMA水凝胶中，纳米银的细胞毒性明显下降。本研究中，培养7 d，0 mg/L含银GelMA水凝胶组、10 mg/L含银GelMA水凝胶组、50 mg/L含银GelMA水凝胶组的人Fb均保持良好的增殖活性，与其他研究类似。本研究团队还通过活/死细胞荧光染色和细胞增殖实验检测打印过程和打印结构对细胞生物活性的影响，结果显示打印过程对人ASC活性无明显不利影响。并且三维打印的网格状结构比实心结构更有利于细胞与营养物质的交换，促进细胞生长增殖［21, 22］。Zhao等［12］研究显示，含高浓度GelMA的GelMA水凝胶利于HaCaT细胞的生长并能形成复层的表皮层，适于作为表皮组织工程的材料；Chen等［23］研究显示，GelMA水凝胶在体外有利于人内皮集落形成细胞形成血管网，在体内能促进水凝胶内的血管网与动物的新生血管相吻合，且低甲基丙烯酸酐化的GelMA水凝胶成血管效果更好。本研究则利用含不同浓度GelMA的GelMA水凝胶的性质，上层使用含高浓度GelMA的GelMA水凝胶，能保护创面免受外界环境污染并维持湿性愈合微环境；下层使用生物相容性好的含低浓度GelMA的GelMA水凝胶，能及时吸收创面渗液，其网状结构也可促进新生组织的长入。
本研究团队前期研究显示，纳米银可以通过刺激大鼠Fb迁移、调节大鼠巨噬细胞活化及减弱创面炎症反应来促进大鼠全层皮肤缺损创面愈合［6，24］。伤后4、7 d，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率明显高于水凝胶支架/纳米银组。这说明ASC在创面修复前期发挥了促愈合的作用。ASC作为一种较优异的三维生物打印种子细胞，能通过促进Fb迁移、增强内皮细胞和KC的活性、上调VEGF相关的信号通路等促进创面修复［25, 26, 27］。本研究团队前期研究已证实包裹在水凝胶中的人Fb植入裸鼠全层皮肤缺损创面后1周内仍能保持较好的活性［28, 29］。与传统的直接喷洒或局部创周注射相比，水凝胶能提供一个适宜的微环境，确保ASC的活性和功能并参与到创面愈合中。已有研究报道，网格状孔隙结构可以促进水凝胶内的种子细胞迁移并提高猪全层皮肤缺损创面愈合率［21, 22］。
本研究显示，水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组的水凝胶与创面贴合紧密，且部分水凝胶已降解并与新生组织相融合，而单纯水凝胶组的水凝胶部分已脱离创面。水凝胶材料虽然可以维持创面愈合所需的湿性环境，但在无抗菌性材料的情况下也会大大提高创面感染的风险。纳米银的抗菌性能可以降低水凝胶材料的感染风险，其调节炎症反应性能［6，30］也可以促进创面与植入材料相融合。本研究观察到水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组网格状结构的横截面，而水凝胶/纳米银组显示的是一团尚未降解的水凝胶且周围胶原纤维排列较为混乱；且水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面的胶原排列更为有序，这说明网格状结构有效地促进了水凝胶支架与创面的融合并促进了新生组织的更有序长入。
综上所述，含银GelMA水凝胶具有良好的生物相容性及抗菌性能，其三维生物打印的双层结构能更好地与大鼠全层皮肤缺损创面新生组织相融合并促进创面愈合。
张月恒：酝酿和实验设计、论文撰写、数据与图片收集、图片处理；崔文举：CT血管造影术操作，进行图片处理指导；宋坤修：对文章的知识性内容进行批阅、手术实施；孙乐刚、王芳、刘小智、邓志洋：手术实施；张志强：术中图片拍摄；刘永涛：酝酿和实验设计，论文指导、手术实施所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 改良CT血管造影技术下可视化重建图像中22例患者股前外侧皮瓣穿支穿出点分布图
注：坐标原点为髂前上棘与髌骨外侧缘连线中点，绿色圆半径为30 mm，红色圆半径为50 mm，红点代表穿支穿出点在此坐标中的分布
2 采用改良CT血管造影技术辅助基于浅筋膜穿支的股前外侧皮瓣修复舌下腺腺样囊性癌患者创面。2A、2B.分别为右、左侧浅筋膜穿支正位观察；2C、2D.分别为右、左侧浅筋膜穿支斜位观察；2E、2F.分别为右、左侧穿支来源及源动脉观察；2G.右侧穿支为肌间隙穿支类型；2H.左侧穿支为肌皮穿支类型；2I.皮瓣设计；2J.术中探及源动脉走行、管径与术前观测相当，穿支类型与图2G一致；2K.完整切取皮瓣；2L.受区清创后创面；2M.术后即刻；2N.术后5个月随访，皮瓣成活良好；2O.术前可视化重建中目标穿支全程展现
注：箭头示穿支，其中红色箭头示目标穿支
3 采用改良CT血管造影技术辅助基于浅筋膜穿支的股前外侧皮瓣修复口底鳞状细胞癌者创面。3A、3B.分别为右、左侧浅筋膜穿支正位观察，其中图3B中a点为穿支穿出点，b点为可观测的浅筋膜穿支末端与浅表静脉相连；3C、3D.分别为右、左侧浅筋膜穿支斜位观察，其中图3D中a点为穿支穿出点，b点为可观测的浅筋膜穿支末端；3E.右侧穿支起源于旋股外侧动脉降支（dLCFA），为肌皮型，穿支近段显影不清；3F.左侧穿支起源于dLCFA，为肌皮型，穿支近段显影尚可；3G.皮瓣设计；3H.术中探及源动脉走行、管径、分支与术前观测一致，蓝色箭头示源动脉分支与图3F一致；3I.浅筋膜穿支走行、管径与术前观测一致，蓝色箭头示浅筋膜穿支与图3B、3D一致；3J、3K.皮瓣完整切取；3L.受区清创后创面；3M.术后即刻；3N. 术后1个月随访，皮瓣成活良好；3O. 术前可视化重建中目标穿支全程展现
注：箭头示穿支，其中红色箭头示目标穿支
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