Effects of enhancing the expression of aryl hydrocarbon receptor in post-traumatic mice macrophages on the inflammatory cytokine level and bactericidal ability
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摘要:
目的 探讨严重创伤后小鼠腹腔巨噬细胞（PM）中芳香烃受体（AhR）的表达规律并分析增强创伤后PM的AhR表达对炎症因子水平和杀菌能力的影响。 方法 采用实验研究方法。取40只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠（小鼠周龄、性别、品系下同），按随机数字表法（分组方法下同）分为对照组、创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组，每组10只。将后3组小鼠构建骨折+失血的严重创伤模型，对照组小鼠不做处理。分别在未创伤和创伤后2、6、12 h时，提取对照组、创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组小鼠原代PM（提取细胞下同），分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法检测AhR的蛋白和mRNA表达，采用转录组测序分析AhR信号通路相关分子的基因表达。取20只小鼠分为对照组、创伤后6 h组，每组10只，提取PM后，采用免疫沉淀法检测AhR泛素化水平。取12只小鼠，分为单纯二甲基亚砜（DMSO）组、创伤后6 h+DMSO组、单纯MG-132组、创伤后6 h+MG-132组，每组3只，并行相应处理后，提取PM，采用蛋白质印迹法检测AhR蛋白的表达。取20只小鼠构建创伤后6 h模型并提取PM，分为空载腺病毒（Ad-NC）组和AhR过表达腺病毒（Ad-AhR）组，部分细胞转染相应腺病毒36 h后，采用蛋白质印迹法检测AhR的蛋白表达；将剩余Ad-NC组细胞分为单纯Ad-NC组、Ad-NC+内毒素/脂多糖（LPS）组，将剩余Ad-AhR组细胞分为单纯Ad-AhR组和Ad-AhR+LPS组，并行相应处理12 h后，采用酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达（样本数为6）。取20只小鼠提取PM并分为对照+Ad-NC组、创伤后6 h+Ad-NC组、对照+Ad-AhR组、创伤后6 h+Ad-AhR组，并行相应处理后，采用平板涂布法检测细胞内载菌量（样本数为6）。对数据行单因素方差分析、LSD检验、析因设计方差分析、独立样本 t检验。 结果 与对照组（1.16±0.28）比较，创伤后2 h组（0.59±0.14）、创伤后6 h组（0.72±0.16）、创伤后12 h组（0.71±0.17）PM中AhR的蛋白表达水平均明显降低（ P<0.05）。对照组、创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组PM中AhR的mRNA表达量组间总体比较，差异无统计学意义（ P>0.05）。AhR信号通路相关分子包括 AhR、AhR抑制因子、细胞色素P450家族成员1b1、细胞色素P450家族成员11a1 、热休克蛋白90、芳香烃受体-相互作用蛋白、热休克蛋白70相互作用蛋白。除创伤后2 h组PM的热休克蛋白90表达水平较对照组高，其他分子的表达水平在创伤后变化不明显。与对照组比较，创伤后6 h组PM中AhR泛素化水平升高。与单纯DMSO组比较，创伤后6 h+DMSO组PM中AhR的蛋白表达量下降，单纯MG-132组PM中AhR的蛋白表达量无明显变化。与创伤后6 h+DMSO组比较，创伤后6 h+MG-132组PM中AhR的蛋白表达量上调。转染36 h，与Ad-NC组比较，Ad-AhR组PM中AhR的蛋白表达水平明显升高。处理12 h，与Ad-NC+LPS组比较，Ad-AhR+LPS组PM上清液中IL-6、TNF-α的表达水平均明显降低（ t值分别为4.80、3.82， P<0.05）。对照+Ad-NC组、创伤后6 h+Ad-NC组、对照+Ad-AhR组、创伤后6 h+Ad-AhR组1×10 6个PM的胞内载菌量分别为（3.0±1.8）、（41.8±10.2）、（1.8±1.2）、（24.2±6.3）集落形成单位。与创伤后6 h+Ad-NC组比较，创伤后6 h+Ad-AhR组PM的胞内载菌量明显减少（ t=3.61， P<0.05）。 结论 严重创伤后小鼠PM中AhR发生泛素化降解导致其蛋白表达降低，增强创伤后巨噬细胞AhR的表达可降低LPS诱导的炎症因子IL-6和TNF-α的表达，且提升创伤后巨噬细胞的杀菌能力。 Abstract:Objective To explore the expression pattern of aryl hydrocarbon receptor (AhR) in mice peritoneal macrophages (PMs) after major trauma and analyze the effects of enhanced AhR expression on the inflammatory cytokine level and bactericidal ability after trauma. Methods The experimental study method was used. Forty 6-8-week-old male C57BL/6J mice (the same mouse age, sex, and strain below) were divided into control group, post trauma hour (PTH) 2 group, PTH 6 group, and PTH 12 group according to the random number table (the same grouping method below), with 10 mice in each group. Mice in the latter 3 groups were constructed as severe trauma model with fracture+blood loss, while mice in control group were left untreated. The primary PMs (the same cells below) were extracted from the mice in control group, PTH 2 group, PTH 6 group, and PTH 12 group when uninjured or at PTH 2, 6, and 12, respectively. Then the protein and mRNA expressions of AhR were detected by Western blotting and real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, respectively, and the gene expressions of AhR signaling pathway related molecules were analyzed by transcriptome sequencing. Twenty mice were divided into control group and PTH 6 group, with 10 mice in each group, and the PMs were extracted. The level of ubiquitin of AhR was detected by immunoprecipitation. Twelve mice were divided into dimethyl sulfoxide (DMSO) alone group, PTH 6+DMSO group, MG-132 alone group, and PTH 6+MG-132 group, with 3 mice in each group. After the corresponding treatment, PMs were extracted, and the protein expression of AhR was detected by Western blotting. Twenty mice were constructed as PTH 6 model. Then, the PMs were extracted and divided into empty negative control adenovirus (Ad-NC) group and AhR overexpression adenovirus (Ad-AhR) group. The protein expression of AhR was detected by Western blotting at 36 h after some PMs were transfected with the corresponding adenovirus. The rest cells in Ad-NC group were divided into Ad-NC alone group and Ad-NC+endotoxin/lipopolysaccharide (LPS) group, and the rest cells in Ad-AhR group were divided into Ad-AhR alone group and Ad-AhR+LPS group. The expressions of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor α (TNF-α) in the cell supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay at 12 h after the corresponding treatment ( n=6). Twenty mice were obtained to extract PMs. The cells were divided into control+Ad-NC group, PTH 6+Ad-NC group, control+Ad-AhR group, and PTH 6+Ad-AhR group, and the intracellular bacterial load was detected by plate spread method after the corresponding treatment ( n=6). Data were statistically analyzed with one-way analysis of variance, least significant difference test, analysis of variance for factorial design, and independent sample ttest. Results Compared with 1.16±0.28 of control group, the protein expressions of AhR in PMs in PTH 2 group (0.59±0.14), PTH 6 group (0.72±0.16), and PTH 12 group (0.71±0.17) were all significantly decreased ( P<0.05). The overall comparison of the difference of AhR mRNA expression in PMs among control group, PTH 2 group, PTH 6 group, and PTH 12 group showed no statistical significance ( P>0.05). The AhR signaling pathway related molecules included AhR, AhR inhibitor, cytochrome P450 family member 1b1, cytochrome P450 family member 11a1, heat shock protein 90, aryl hydrocarbon receptor-interaction protein, and heat shock protein 70 interaction protein. The heat shock protein 90 expression of PMs in PTH 2 group was higher than that in control group, while the expressions of other molecules did not change significantly after trauma. Compared with that in control group, the level of ubiquitin of AhR in PMs in PTH 6 group was increased. Compared with that in DMSO alone group, the protein expression of AhR in PMs in PTH 6+DMSO group was decreased, while that in PMs in MG-132 alone group had no significant change. Compared with that in PTH 6+DMSO group, the protein expression of AhR in PMs in PTH 6+MG-132 group was up-regulated. At transfection hour 36, compared with that in Ad-NC group, the protein expression of AhR in PMs in Ad-AhR group was increased. At treatment hour 12, compared with those in Ad-NC+LPS group, the expressions of IL-6 and TNF-α in PM supernatant of Ad-AhR+LPS group were significantly decreased (with tvalues of 4.80 and 3.82, respectively, P<0.05). The number of intracellular bacteria of 1×10 6 PMs in control+Ad-NC group, PTH 6+Ad-NC group, control+Ad-AhR group, and PTH 6+Ad-AhR group was (3.0±1.8), (41.8±10.2), (1.8±1.2), and (24.2±6.3) colony forming unit, respectively. Compared with that in PTH 6+Ad-NC group, the number of intracellular bacteria of PMs in PTH 6+Ad-AhR group was significantly decreased ( t=3.61, P<0.05). Conclusions Ubiquitin degradation of AhR in PMs of mice after major trauma results in decreased protein expression of AhR. Increasing the expression of AhR in post-traumatic macrophages can reduce the expressions of LPS-induced inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α, and improve the bactericidal ability of macrophages after trauma. -
(1)证实严重创伤导致小鼠腹腔巨噬细胞中芳香烃受体（AhR）蛋白的泛素化水平升高，表达降低。
(2)证实增强创伤后小鼠巨噬细胞AhR的表达可降低LPS诱导的炎症因子IL-6和TNF-α的表达，且提升创伤后巨噬细胞的杀菌能力。
创伤是全球面临的重要公共卫生问题，全世界每年10%的死亡和16%的残疾是由创伤造成的。随着急救治疗的发展，尽管严重创伤后原发伤处理及支持治疗已取得进展，但创伤后感染引起的脓毒症和MODS是创伤患者晚期死亡的常见原因 ［ 1, 2］ 。创伤后先天性和适应性免疫功能的改变导致机体的易感染性增加和抗感染能力减弱，而巨噬细胞在上述免疫反应中发挥关键作用 ［ 3］ ，其功能障碍是引起机体过度炎症反应和抗感染能力减弱的主要原因之一 ［ 4］ 。调节巨噬细胞功能障碍是预防创伤后脓毒症的主要辅助措施之一，探寻抗炎和抗感染的双向调控分子及信号通路具有重要意义。
芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一种配体激活的转录因子，由805个氨基酸构成，属于碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族，可通过基因组与非基因组通路发挥功能。既往认为AhR主要介导环境中毒物代谢，最近研究表明其参与了感染、炎症与免疫反应的调控，LPS诱导的炎症基因表达以及炎症巨噬细胞的活性调节，而且 AhR基因敲除小鼠对脓毒症易感 ［ 5, 6］ 。AhR在抵抗细菌的先天防御中也起着关键作用，以AhR活化为特征的脓毒症小鼠可有效抵御革兰阳性菌和革兰阴性菌的致死性攻击 ［ 7］ ， AhR敲除小鼠对铜绿假单胞菌诱导的感染更敏感 ［ 8］ 。综上，AhR主要参与机体炎症调控与抗感染过程，然而，AhR在创伤后巨噬细胞中的变化及作用尚不明确。
因此，本研究建立小鼠严重创伤模型并动态提取腹腔巨噬细胞（PM）开展研究，旨在探究严重创伤后小鼠PM中AhR的表达规律，同时分析其对伤后巨噬细胞炎症因子表达及杀菌能力的影响，有助于探索干预严重创伤的新靶点并发掘预防伤后感染治疗的新措施 。
1. 材料与方法
本实验研究所涉及的动物实验由陆军军医大学伦理委员会审批通过，批号：AMUWEC20211429。
1.1 动物和细胞及主要试剂与仪器来源
112只6~8周龄体重20~22 g无特殊病原体级健康雄性C57BL/6J小鼠购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SYXK（渝）2017-0002。RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司。青霉素和链霉素双抗购自上海碧云天生物技术有限公司，红细胞裂解液购自天津灏洋华科生物科技有限公司，兔抗小鼠AhR多克隆抗体购自瑞士Enzo Life Sciences公司，小鼠源泛素化单克隆抗体、兔抗小鼠β肌动蛋白多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG多克隆抗体均购自美国CST公司，高纯总RNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，反转录试剂盒、SYBR ®Prime Ex TaqTM Ⅱ试剂盒均购自日本TAKARA公司，小鼠IL-6、TNF-α的ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，蛋白酶体抑制剂MG-132购自美国MedChemexpress生物科技公司，大肠埃希菌来自陆军军医大学大坪医院检验科，LPS、二甲基亚砜（DMSO）、LB培养基试剂均购自美国Sigma公司。ChemiDoc MP型成像仪、C1000 Thermal Cycler型定量PCR仪、CFX96 Touch型荧光定量PCR检测系统均购自美国Bio-Rad公司，SYNERGY H1型酶标仪购自美国Bio-Tek公司。
1.2 创伤后小鼠PM中AhR的蛋白和mRNA表达检测及信号通路相关分子的转录组测序
1.2.1 小鼠分组与创伤模型构建
取40只小鼠，按随机数字表法（分组方法下同）分为对照组、创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组，每组10只。按照本课题组前期实验方法 ［ 9］ ，将后3组小鼠用钳夹夹断双后肢造成股骨非开放性骨折，同时复合眼眶放血30%~40%构建小鼠骨折+失血的严重创伤模型；对照组小鼠不做处理。对照组和创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组小鼠分别在未创伤和创伤后2、6、12 h脱颈处死后提取原代PM（提取细胞下同）进行后续实验。
1.2.2 AhR蛋白表达检测
采用RPMI-1640完全培养基调整4组PM浓度为2×10 6个/mL，接种于6孔板中，每孔1 mL。细胞2 h贴壁后常规提取细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法检测PM中AhR蛋白的表达情况。其中一抗为兔抗小鼠AhR多克隆抗体，二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体，稀释比均为1∶1 000。采用凝胶化学发光成像系统获取图像，采用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）行灰度分析，以免染胶的总蛋白为内参照，计算AhR蛋白表达量。
1.2.3 AhR的mRNA表达检测和信号通路相关分子的转录组测序
同1.2.2取细胞并接种。细胞2 h贴壁后采用TRIzol法提取细胞总RNA，并采用实时荧光定量RT-PCR法检测AhR的mRNA表达。PCR引物由北京擎科生物科技公司合成， AhR的上游引物为5'-CAAATCCTTCTAAGCGACACAG-3'、下游引物为5'-TGACGCTGAGCCTAAGAACA-3'，产物大小为126 bp；β肌动蛋白的上游引物为5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'、下游引物为5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，产物大小为228 bp。以β肌动蛋白为内参照，采用基于Δ循环阈值（Ct）的2 -ΔΔCt法处理结果，计算各组细胞AhR的mRNA表达量。将同样的TRIzol裂解样本于-80 ℃冻存后送往上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序。测序数据比对小鼠参考基因组（
http：//asia.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index ），分析各组PM中AhR信号通路相关分子的基因表达情况，并用热图展示。1.3 创伤后PM中AhR泛素化水平及蛋白表达
1.3.1 创伤后PM中AhR泛素化水平
取20只小鼠，分为对照组、创伤后6 h组，每组10只，同1.2.1相应组别处理。取原代PM，采用免疫沉淀法检测PM中AhR泛素化水平。其中一抗为小鼠源泛素化单克隆抗体、兔抗小鼠β肌动蛋白多克隆抗体，二抗为HRP标记的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG多克隆抗体，稀释比均为1∶1 000。
1.3.2 创伤后PM中AhR的蛋白表达
取12只小鼠，分为单纯DMSO组、创伤后6 h+DMSO组、单纯MG-132组、创伤后6 h+MG-132组，每组3只。前2组小鼠均腹腔注射200 μL含体积分数5% DMSO的PBS，后2组小鼠均腹腔注射200 μL采用体积分数5% DMSO的PBS配制的终质量浓度为1 mg/mL的MG-132，创伤后6 h+DMSO组与创伤后6 h +MG-132组小鼠均在同1.2.1构建创伤模型前2 h进行腹腔注射。单纯DMSO组和单纯MG-132组，创伤后6 h+DMSO组和创伤后6 h+MG-132组小鼠分别在未创伤和创伤后6 h取原代PM。采用蛋白质印迹法检测PM中AhR的蛋白表达情况，抗体及其稀释比均同1.2.2。
1.4 PM释放的IL-6和TNF-α水平检测
取20只小鼠同1.2.1构建创伤6 h模型并提取PM。待细胞生长达50%~60%融合时，将PM分为空载腺病毒（Ad-NC）组和AhR过表达腺病毒（Ad-AhR）组。Ad-AhR及Ad-NC委托上海汉恒生物科技有限公司合成。2组部分细胞转染相应腺病毒36 h后，采用蛋白质印迹法检测PM中AhR的蛋白表达判断腺病毒是否转染成功。腺病毒转染成功后，将剩余Ad-NC组细胞分为单纯Ad-NC组、Ad-NC+LPS组，将剩余Ad-AhR组细胞分为单纯Ad-AhR组和Ad-AhR+LPS组。其中Ad-NC+LPS组、Ad-AhR+LPS组细胞采用终质量浓度为10 μg/mL的LPS刺激12 h构建炎症模型，单纯Ad-NC组、单纯Ad-AhR组细胞继续培养12 h。按照小鼠IL-6、TNF-α的ELISA试剂盒说明书操作，收集4组细胞上清液用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度值，反映细胞中的IL-6、TNF-α的表达水平。样本数为6。
1.5 PM内载菌量检测
取20只小鼠同1.3.1分组并提取PM。将细胞分为对照+Ad-NC组、创伤后6 h+Ad-NC组、对照+Ad-AhR组、创伤后6 h+Ad-AhR组，并分别转染相应腺病毒。将4组细胞以20∶1的感染复数加入大肠埃希菌感染1 h后弃去培养基。细菌感染结束后，使用庆大霉素杀灭胞外菌后继续培养4 h，加入体积分数为1%聚乙二醇辛基苯基醚水溶液裂解细胞，再倍比稀释10、100、1 000倍后在60 mm×15 mm的LB固体培基中采用平板涂布法接种细菌，每个稀释倍数做3个重复平板。37 ℃培养过夜后，拍照并计数，每3个重复平板的平均菌落数为PM内载菌量。样本数为6。
1.6 统计学处理
采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.2统计软件进行分析，计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 创伤后不同时间点PM的AhR蛋白表达
对照组、创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组PM中AhR蛋白表达量分别为1.16±0.28、0.59±0.14、0.72±0.16、0.71±0.17，组间总体比较，差异有统计学意义（ F=6.89， P=0.006）。与对照组比较，创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组PM中AhR的蛋白表达量均明显降低（ P值分别为0.006、0.029、0.027）。见 图1。
2.2 创伤后不同时间点PM中AhR的mRNA表达和信号通路相关分子的转录组测序
对照组、创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组PM中AhR的mRNA表达量分别为1.00±0.05、0.89±0.04、1.16±0.05、1.03±0.03，组间总体比较，差异无统计学意义（ F=3.24， P=0.084）。AhR信号通路相关分子包括 AhR、AhR抑制因子、细胞色素P450家族成员1b1、细胞色素P450家族成员11a1 、热休克蛋白90、芳香烃受体-相互作用蛋白、热休克蛋白70相互作用蛋白。除创伤后2 h组PM的热休克蛋白90表达水平较对照组高，其他分子的表达水平创伤后变化不明显。见 图2。
注：左侧缩写均为基因名称，AhR为芳香烃受体，Ahrr为芳香烃受体抑制因子，Cyp1b1为细胞色素P450家族成员1b1，Cyp11a1为细胞色素P450家族成员11a1，Hsp90为热休克蛋白90，Aip为芳香烃受体-相互作用蛋白，Chip为热休克蛋白70相互作用蛋白；热图上方1、2、3、4分别指示未致创伤的对照组、创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组2.3 创伤后PM中AhR泛素化水平及蛋白表达
与对照组比较，创伤后6 h组PM中AhR泛素化水平升高。见 图3。
与单纯DMSO组比较，创伤后6 h+DMSO组PM中AhR的蛋白表达量下降，单纯MG-132组PM中AhR的蛋白表达量无明显变化。与创伤后6 h+DMSO组比较，创伤后6 h+MG-132组PM中AhR的蛋白表达量上调。见 图4。
2.4 PM中的IL-6和TNF-α表达水平
转染36 h，与Ad-NC组比较，Ad-AhR组PM中AhR的蛋白表达水平升高。见 图5。
处理12 h，与Ad-NC+LPS组比较，Ad-AhR+LPS组PM上清液中IL-6、TNF-α的表达水平均明显降低（ P<0.05）。见 表1。
表1 4组创伤后小鼠腹腔巨噬细胞处理12 h后上清液中IL-6和TNF-α表达水平比较（pg/mL，组别 样本数 IL-6 TNF-α 单纯Ad-NC组 6 451±207 379±181 Ad-NC+LPS组 6 5 580±779 4 534±642 单纯Ad-AhR组 6 399±200 345±190 Ad-AhR+LPS组 6 3 397±797 3 063±689 t值 4.80 3.82 P值 <0.001 0.003 注：Ad-NC为空载腺病毒，LPS为内毒素/脂多糖，AhR为芳香烃受体，Ad-AhR为AhR过表达腺病毒，IL-6为白细胞介素6，TNF-α为肿瘤坏死因子α；IL-6、TNF-α表达的感染腺病毒类型主效应， F值分别为22.63、14.20， P值均<0.001；刺激类型主效应， F值分别为299.20、296.70， P值均<0.001；两者交互作用， F值分别为20.57、12.97， P值均<0.001； t值、 P值为Ad-NC+LPS组和Ad-AhR+LPS组各指标比较所得 2.5 PM胞内载菌量
对照+Ad-NC组、创伤后6 h+Ad-NC组、对照+Ad-AhR组、创伤后6 h+Ad-AhR组1×10 6个PM的胞内载菌量分别为（3.0±1.8）、（41.8±10.2）、（1.8±1.2）、（24.2±6.3）CFU。4组PM胞内载菌量的感染腺病毒类型主效应， F=14.37， P<0.001；细胞受伤类型主效应， F=151.60， P<0.001；两者交互作用， F=11.03， P=0.003。与创伤后6 h+Ad-NC组比较，创伤后6 h+Ad-AhR组PM的胞内载菌量明显减少（ t=3.61， P<0.001）。
3. 讨论
伤后感染引起脓毒症和MODS的主要原因之一是严重创伤导致机体免疫功能紊乱。创伤后机体的先天性和适应性免疫功能均处于紊乱状态，使机体对病毒、细菌、真菌等病原体感染的易感性增加，加剧了创伤后脓毒症的发生 ［ 10］ 。巨噬细胞在先天和适应性免疫反应介导的抗感染应答中发挥主导作用，其双向性功能改变（炎症介质生成增多、吞噬杀菌及抗原提呈能力降低）在引发创伤后免疫功能紊乱中扮演重要角色 ［ 4］ 。但是，创伤后巨噬细胞功能紊乱的具体机制还未完全明晰，缺乏合适的双向调控靶点。本团队前期研究显示AhR是十分具有潜力的创伤后双向调控分子 ［ 5， 9］ ，AhR是机体免疫调控和抗感染的关键组成部分，调节AhR相关通路是控制炎症和感染的重要途径。本研究揭示了创伤后巨噬细胞中AhR的变化及作用。
无活性的AhR存在于细胞质中，与伴侣蛋白，包括热休克蛋白90、p23蛋白和X相关蛋白2等结合形成复合体。多种内、外源性配体结合AhR后与胞质蛋白复合体解离并启动基因组通路，AhR入核促进靶基因转录；另外，AhR还可通过非基因组通路调控其他转录因子发挥功能 ［ 11］ 。研究报道，大鼠创伤性脑损伤后AhR在皮层和海马中的表达上调，上调的AhR主要存在于非神经元的T细胞中，可能通过调节T细胞的分化在创伤性脑损伤导致的变性和再生过程中发挥作用 ［ 12］ 。小鼠大脑中动脉闭塞引起的脑缺血能上调小胶质细胞AhR的表达，并参与氧化应激和随后的炎症反应 ［ 13］ 。大鼠视神经损伤后导致视网膜神经节细胞中AhR表达上调，并参与了细胞周期失调和细胞凋亡过程 ［ 14］ 。AhR在中枢神经系统受到内部和外部刺激时具有神经保护作用，慢性神经损伤增强了小鼠损伤神经中AhR的表达；而AhR缺失会加剧神经损伤，AhR 激动剂奥美拉唑则逆转了上述变化 ［ 15］ 。与上述AhR在神经系统损伤中的效应不同，本研究使用骨折+失血导致的严重创伤模型，结果显示创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组PM中的AhR蛋白表达均较对照组下调。分析原因，一方面可能是由于不同组织细胞的异质性导致AhR变化不一致；另一方面是损伤类型的不同，创伤性脑损伤、脑缺血和神经损伤都是局部损伤，同时检测的是损伤部位AhR的变化，然而骨折+失血是全身创伤，并且检测的是远隔腹腔里巨噬细胞的变化。
本研究显示，创伤后PM中AhR蛋白表达降低，但mRNA表达水平无明显变化，可能是由于AhR发生了转录后修饰。文献报道，在人类和啮齿类动物的9种不同细胞中观察到AhR蛋白在与配体结合后迅速下调，同时AhR的下调是泛素化介导的并依赖于26S蛋白酶体途径 ［ 16］ 。与对照组相比，创伤后6 h组PM的AhR泛素化水平明显升高。进一步使用蛋白酶体抑制剂MG-132于创伤前进行干预显示，创伤后6 h+MG-132组PM中AhR的蛋白表达水平明显上调，提示创伤后PM中AhR蛋白表达下调的原因与泛素化降解相关。进一步分析何种因素造成AhR泛素化降解，本研究团队推测可能是由于创伤后存在内源性配体激活PM中的AhR。例如，严重创伤后血浆犬尿氨酸水平升高以及犬尿氨酸-色氨酸比值可作为创伤后脓毒症和MODS的预测指标 ［ 17］ ，犬尿氨酸是AhR重要的内源性配体，创伤后极有可能作用于PM导致AhR泛素化降解。近来研究报道无配体激活的AhR也可通过选择性自噬方式降解，这种降解在p23含量下调时尤为明显 ［ 18］ 。因此，AhR蛋白表达降低的机制值得后续进一步深入探究。
在免疫反应中，AhR不仅在T细胞、B细胞、单核细胞、中性粒细胞以及树突状细胞功能调节方面扮演重要角色，还参与炎症基因表达以及炎症巨噬细胞的活性调节。 AhR基因缺失可致LPS诱导的小鼠基因表达发生明显改变，提示在无AhR外源性配体存在的情况下，AhR参与了LPS诱导的炎症基因表达 ［ 6］ 。AhR能够通过不同信号通路调控多种炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β及炎症趋化因子的表达 ［ 19］ ，而且AhR对LPS引起的炎症反应和脓毒症的耐受诱导不可或缺 ［ 7］ 。本研究表明，创伤后AhR的表达受抑与炎症细胞因子水平升高相关，增强PM中AhR的表达能降低LPS刺激的IL-6和TNF-α释放。创伤后巨噬细胞分泌功能紊乱的原因可能与AhR的表达受抑相关，也是导致伤后脓毒症过度炎症反应的重要因素。此外，还需要进一步探究AhR对促炎抗炎平衡的影响。
研究表明，AhR在抵抗细菌的先天防御中起着关键作用，以AhR活化为特征的脓毒症小鼠可有效抵御革兰阳性菌、革兰阴性菌的致死性攻击 ［ 7］ 。 AhR敲除小鼠对铜绿假单胞菌、李斯特菌诱导的感染更敏感 ［ 8， 20］ 。线粒体衍生多肽可通过增强AhR的表达，明显提高受到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌攻击的小鼠的生存率并降低其细菌负荷 ［ 21］ 。肠道微生物群来源的3-吲哚丙酸也可部分激活AhR，促进小鼠巨噬细胞吞噬并减轻器官功能损伤和降低脓毒症病死率 ［ 22］ 。本研究团队使用大肠埃希菌体外感染PM，结果表明创伤后AhR的表达受抑与PM杀菌能力降低相关，增强创伤后巨噬细胞AhR的表达能促进其对大肠埃希菌的杀菌作用。其可能的作用机制包括：（1）AhR通过上调活性氧的生成，促进细菌的清除 ［ 20］ ；（2）AhR可感知部分细菌毒力因子，启动特定的毒素代谢酶基因转录，导致毒力致病因子的降解 ［ 8］ 。
综上所述，本研究建立小鼠骨折+失血的严重创伤模型并提取不同时间点的PM开展研究，结果表明创伤后12 h内PM中AhR的蛋白表达降低，其机制与泛素化降解相关，进一步揭示创伤后AhR的表达受抑与巨噬细胞分泌功能紊乱和杀菌能力降低相关，增强创伤后巨噬细胞AhR的表达能逆转上述效应，为寻找严重创伤后的干预新靶点并发掘预防创伤后脓毒症治疗新措施奠定了基础。
旷田垠、罗莉：实验操作、论文撰写；殷双琴、代伟宏：实验操作；陈涛、梁星河：数据整理、统计学分析；王日兴、梁华平：研究指导、论文修改以及经费支持；朱俊宇：实验操作、论文撰写、研究指导、论文修改以及经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 蛋白质印迹法检测的对照组与3组创伤小鼠腹腔巨噬细胞AhR的蛋白表达
注：AhR为芳香烃受体；条带上方1、2、3、4分别指示未致创伤的对照组、创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组
2 对照组与3组创伤小鼠腹腔巨噬细胞AhR信号通路相关分子的表达水平热图
注：左侧缩写均为基因名称，AhR为芳香烃受体，Ahrr为芳香烃受体抑制因子，Cyp1b1为细胞色素P450家族成员1b1，Cyp11a1为细胞色素P450家族成员11a1，Hsp90为热休克蛋白90，Aip为芳香烃受体-相互作用蛋白，Chip为热休克蛋白70相互作用蛋白；热图上方1、2、3、4分别指示未致创伤的对照组、创伤后2 h组、创伤后6 h组、创伤后12 h组
4 蛋白质印迹法检测的4组小鼠腹腔巨噬细胞中AhR的蛋白表达
注：AhR为芳香烃受体，DMSO为二甲基亚砜；条带上方1、2、3、4分别指示单纯DMSO组、创伤后6 h+DMSO组、单纯MG-132组、创伤后6 h+MG-132组
5 蛋白质印迹法检测的2组创伤后小鼠腹腔巨噬细胞转染腺病毒36 h的AhR蛋白表达
注：AhR为芳香烃受体，Ad-NC为空载腺病毒，Ad-AhR为AhR过表达腺病毒；条带上方1、2分别指示Ad-NC组、Ad-AhR组
表1 4组创伤后小鼠腹腔巨噬细胞处理12 h后上清液中IL-6和TNF-α表达水平比较（pg/mL，
组别 样本数 IL-6 TNF-α 单纯Ad-NC组 6 451±207 379±181 Ad-NC+LPS组 6 5 580±779 4 534±642 单纯Ad-AhR组 6 399±200 345±190 Ad-AhR+LPS组 6 3 397±797 3 063±689 t值 4.80 3.82 P值 <0.001 0.003 注：Ad-NC为空载腺病毒，LPS为内毒素/脂多糖，AhR为芳香烃受体，Ad-AhR为AhR过表达腺病毒，IL-6为白细胞介素6，TNF-α为肿瘤坏死因子α；IL-6、TNF-α表达的感染腺病毒类型主效应， F值分别为22.63、14.20， P值均<0.001；刺激类型主效应， F值分别为299.20、296.70， P值均<0.001；两者交互作用， F值分别为20.57、12.97， P值均<0.001； t值、 P值为Ad-NC+LPS组和Ad-AhR+LPS组各指标比较所得 
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