Influence of family with sequence similarity 134, member B-mediated reticulophagy on lipopolysaccharide-induced apoptosis of mouse dendritic cells
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摘要:
目的 探讨序列相似性家族134成员B（FAM134B）介导的内质网自噬对内毒素/脂多糖（LPS）诱导的小鼠树突状细胞（DC）凋亡的影响，为改善创面感染等引起的脓毒症免疫抑制提供依据。 方法 采用实验研究方法。取第3~10代对数生长期的小鼠DC系DC2.4进行实验。将DC分为LPS刺激0 h（不刺激）组、LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组，采用1 μg/mL LPS（浓度下同）培养相应时间后，采用蛋白质印迹法检测FAM134B、微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）以及转运蛋白SEC61B蛋白表达，并计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值（样本数为3）。将DC分为进行相应处理的磷酸盐缓冲液（PBS）组与LPS组，培养24 h，采用免疫荧光法检测FAM134B表达情况及其分别与溶酶体探针、LC3B共定位情况，通过透射电子显微镜观察细胞内自噬溶酶体数量。将DC分为转染含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒的敲减FAM134B组与转染空载慢病毒的空载体组，转染后72 h，于倒置荧光相差显微镜下观察细胞荧光表达情况，另将仅常规培养的DC设为空白对照组并于相应时间点行相同观察。将DC分为单纯PBS组、单纯LPS组，将成功转染含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒的DC分为敲减FAM134B+PBS组、敲减FAM134B+LPS组，将成功转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组，给予相应刺激并培养24 h，采用蛋白质印迹法检测FAM134B蛋白表达（样本数为3），通过流式细胞术检测细胞凋亡率（样本数为3），行Hoechst染色观测细胞凋亡情况并计算凋亡率（样本数为5），采用蛋白质印迹法检测剪切型胱天蛋白酶3（caspase-3）、B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达并计算Bax/Bcl-2比值（样本数为5）。对数据行单因素方差分析、LSD检验、析因设计方差分析。 结果 与LPS刺激0 h组相比，LPS刺激12 h组和LPS刺激24 h组细胞中FAM134B蛋白表达均明显升高（ P<0.05），LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组细胞中SEC61B蛋白表达均明显降低（ P<0.05），LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值均明显升高（ P<0.05），其中LPS刺激24 h组细胞中3个蛋白的变化最显著，将24 h作为后续LPS刺激时长。培养24 h，与PBS组相比，LPS组细胞中FAM134B的表达及其与LC3B及溶酶体探针的共定位均显著增强，自噬溶酶体数量明显增多。空载体组与敲减FAM134B组细胞转染后72 h均表现出高强度荧光，而空白对照组细胞在相应时间点无荧光表现。培养24 h，敲减FAM134B+PBS组细胞中FAM134B蛋白表达较单纯PBS组和空载体+PBS组明显降低（ P值均<0.05），敲减FAM134B+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达较单纯LPS组和空载体+LPS组显著降低（ P值均<0.05），单纯LPS组细胞中FAM134B蛋白表达较单纯PBS组明显升高（ P<0.05），空载体+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达较空载体+PBS组明显升高（ P<0.05）。培养24 h，流式细胞术检测显示，单纯PBS组、单纯LPS组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组与敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率分别为（13.3±0.8）%、（32.6±4.3）%、（17.0±1.5）%、（51.7±3.3）%、（52.4±3.1）%与（62.3±2.6）%。培养24 h，与单纯LPS组和空载体+LPS组相比，敲减FAM134B+LPS组经流式细胞术与Hoechst染色检测的细胞凋亡率以及细胞中剪切型caspase-3蛋白表达、Bax/Bcl-2比值均明显升高（ P<0.05）；与对应的PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组相比，单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组经流式细胞术与Hoechst染色检测的细胞凋亡率以及细胞中剪切型caspase-3蛋白表达、Bax/Bcl-2比值均明显升高（ P<0.05）。 结论 小鼠DC中FAM134B介导的内质网自噬在LPS刺激下活化增强并于24 h达活化高峰，且活化的内质网自噬对细胞凋亡具有显著抑制效应。 Abstract:Objective To investigate the influence of family with sequence similarity 134, member B (FAM134B)-mediated reticulophagy on lipopolysaccharide (LPS)-induced apoptosis of mouse dendritic cells (DCs), so as to provide a basis for improving the immune suppression of sepsis caused by wound infection and other factors. Methods The experimental research methods were used. The DC line DC2.4 of the 3 rd to 10 th passage in the logarithmic growth stage was collected for experiments. DCs were divided into LPS stimulation 0 h (no stimulation) group, LPS stimulation 6 h group, LPS stimulation 12 h group, LPS stimulation 24 h group, and LPS stimulation 72 h group, which were cultured with 1 μg/mL LPS (the same concentration below) for the corresponding time. The protein expressions of FAM134B, microtubule-associated protein 1 light chain 3B (LC3B), and transporter protein SEC61B were determined by Western blotting, and the ratio of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ was calculated ( n=3). DCs were divided into phosphate buffer solution (PBS) group and LPS group for corresponding treatment. After 24 hours of culture, the expression of FAM134B and its co-localization with lysosomal probes and LC3B were detected using immunofluorescence method, while the number of autolysosomes in cells were observed through transmission electron microscope. DCs were divided into the FAM134B-knockdown group that were transfected with lentivirus containing small interfering RNA (siRNA) sequence of FAM134Bgene and the empty vector group with empty lentivirus transfected. At post transfection hour 72, the fluorescence expression of cells was observed under the inverted fluorescence phase contrast microscope, meanwhile, the normally cultured DCs were set as blank control group, and the same observation was performed at the corresponding time point. DCs were divided into PBS alone group and LPS alone group, DCs successfully transfected with lentivirus containing siRNA sequence of FAM134B gene were divided into FAM134B-knockdown+PBS group and FAM134B-knockdown+LPS group, and DCs successfully transfected with empty lentivirus were divided into empty vector+PBS group and empty vector+LPS group. These cells were stimulated correspondingly and cultured for 24 hours. The protein expression of FAM134B was detected using Western blotting ( n=3); the apoptotic rate of cells was determined by flow cytometry ( n=3); the situation of apoptosis was observed by Hoechst staining, and the apoptotic rate was calculated ( n=5); the protein expressions of cleaved cysteine aspartic acid specific protease-3 (caspase-3), B cell lymphoma 2 (Bcl-2), and Bcl-2-associated X protein (Bax) were detected using Western blotting, and the ratio of Bax/Bcl-2 was calculated ( n=5). Data were statistically analyzed with one-way analysis of variance (ANOVA), least significant difference test, and ANOVA for factorial design. Results Compared with those in LPS stimulation 0 h group, the protein expressions of FAM134B of cells in LPS stimulation 12 h group and LPS stimulation 24 h group were significantly increased ( P<0.05), the protein expressions of SEC61B of cells in LPS stimulation 6 h group, LPS stimulation 12 h group, LPS stimulation 24 h group, and LPS stimulation 72 h group were significantly decreased ( P<0.05), and the ratios of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ of cells in LPS stimulation 24 h group and LPS stimulation 72 h group were obviously increased ( P<0.05). As the most significant changes of three proteins were seen in the cells of LPS stimulation 24 h group, 24 h was used as the duration of subsequent LPS stimulation. After 24 hours of culture, the expression of FAM134B and its co-localization with LC3B and lysosomal probes in the cells of LPS group were all significantly enhanced, with a significant increase in the number of autolysosomes in comparison with those in PBS group. Both the empty vector group and the FAM134B-knockdown group showed high intensity fluorescence in the cells at post transfection hour 72, but the blank control group showed no fluorescence in the cells at the corresponding time point. After 24 hours of culture, the protein expression of FAM134B of cells in FAM134B-knockdown+PBS group was significantly lower than the expressions in PBS alone group and empty vector+PBS group (with P values all <0.05), the protein expression of FAM134B of cells in FAM134B-knockdown+LPS group was significantly lower than the expressions in LPS alone group and empty vector+LPS group (with P values all <0.05), the protein expression of FAM134B of cells in LPS alone group was significantly higher than that in PBS alone group ( P<0.05), while the protein expression of FAM134B of cells in empty vector+LPS group was significantly higher than that in empty vector+PBS group ( P<0.05). After 24 hours of culture, flow cytometry assay revealed that the apoptotic rate of cells in PBS alone group, LPS alone group, empty vector+PBS group, empty vector+LPS group, FAM134B-knockdown+PBS group, and FAM134B-knockdown+LPS group were (13.3±0.8)%, (32.6±4.3)%, (17.0±1.5)%, (51.7±3.3)%, (52.4±3.1)%, and (62.3±2.6)%, respectively. After 24 hours of culture, compared with those in LPS alone group and empty vector+LPS group, the protein expression of cleaved caspase-3, the ratio of Bax/Bcl-2, and the apoptotic rates of cells detected by flow cytometry and Hoechst staining were significantly increased in FAM134B-knockdown+LPS group ( P<0.05); compared with those in the corresponding PBS treatment group, namely, PBS alone group, empty vector+PBS group, and FAM134B-knockdown+PBS group, the protein expression of cleaved caspase-3, the ratio of Bax/Bcl-2, and the apoptotic rates of cells detected by flow cytometry and Hoechst staining were significantly increased in LPS alone group, empty vector+LPS group, and FAM134B-knockdown+LPS group ( P<0.05). Conclusions The activation of reticulophagy mediated by FAM134B in mouse DCs is enhanced and peaked in 24 hours under LPS stimulation, and the activated reticulophagy has a significant inhibitory effect on cell apoptosis. -
(1)证明了在LPS的刺激下，序列相似性家族134成员B（FAM134B）介导的内质网自噬于小鼠树突状细胞中活化明显，并对细胞凋亡有显著抑制作用，为脓毒症免疫治疗提供新靶点。
(2)在基因水平证实，干扰 FAM134B基因的表达可激活线粒体凋亡途径，进而影响小鼠树突状细胞的凋亡，为明确脓毒症时细胞免疫功能障碍的关键信号机制提供新思路。
Highlights:
(1)Proved that under the stimulation of LPS, family with sequence similarity 134, member B (FAM134B)-mediated reticulophagy was significantly activated in mouse dendritic cells and had a significant inhibitory effect on cell apoptosis, providing a new target for immunotherapy of sepsis.
(2)At the genetic level, it has been confirmed that interfering with the expression of FAM134Bgene can activate the mitochondrial apoptosis pathway, thereby affecting the apoptosis of mouse dendritic cells, providing a new idea for clarifying the key signaling mechanisms of cellular immune dysfunction in sepsis.
脓毒症的本质是因感染引起宿主反应失调，从而导致致命性器官功能障碍 ［ 1］ 。大量研究提示，免疫应答障碍系导致脓毒症预后不良的主要因素 ［ 2, 3］ 。然而，迄今为止，尚未能明确诱发和加重细胞免疫功能障碍的关键信号机制。树突状细胞（DC）是专职抗原呈递细胞，成熟DC可激活初始T淋巴细胞的增殖并启动适应性免疫应答 ［ 4］ 。许多资料表明，在脓毒症发生与发展过程中，DC数量锐减与机体免疫功能低下密切相关 ［ 5, 6］ 。但是，关于脓毒症状态下DC死亡的分子机制尚不明确。内质网自噬是维持细胞自身功能稳态的一种适应性反应，其能选择性吞噬受损内质网膜，进而对内质网进行质量控制 ［ 7］ 。序列相似性家族134成员B（FAM134B）是首个被发现可介导内质网自噬的受体；FAM134B可通过其微管相关蛋白1轻链3（LC3）结合结构域与LC3B结合，进而介导内质网自噬的发生 ［ 8］ 。业已明确，FAM134B介导的内质网自噬可抑制许多炎性疾病的发生与发展，且细胞器选择性自噬功能异常也是多种炎症疾病发病的重要因素 ［ 9, 10］ 。
本研究旨在探讨LPS刺激模拟脓毒症状态下DC中FAM134B介导内质网自噬的变化规律，并通过调控 FAM134B基因表达进一步探究该基因介导内质网自噬对DC凋亡的影响及其意义。
1. 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂与仪器来源
小鼠DC系DC2.4购自河北北纳生物科技有限公司。含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒和空载慢病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，LPS购自美国Sigma公司，兔抗小鼠FAM134B单克隆抗体、兔抗小鼠LC3B单克隆抗体、兔抗小鼠SEC61B单克隆抗体、Alexa Fluor 647标记的兔抗小鼠LC3B单克隆抗体、兔抗小鼠B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）单克隆抗体、兔抗小鼠Bcl-2相关X蛋白（Bax）单克隆抗体及兔抗小鼠剪切型胱天蛋白酶3（caspase-3）单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，Alexa Fluor 647标记的特异性溶酶体荧光染料和RPMI-1640培养基购自美国Thermo Fisher Scientific公司，膜联蛋白Ⅴ-别藻蓝蛋白/7-氨基放线菌素D-藻红蛋白检测试剂盒购自美国BioLegend公司，Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体购自北京金普来生物科技有限公司，小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体、Hoechst 33258购自北京普利莱基因技术有限公司。CANTO PLUS型流式细胞仪购自美国BD公司，DYY-7型电泳仪购自北京六一仪器厂，ImageQuant LAS 4000型化学发光成像分析仪购自美国GE通用电气公司，LEICA CTR4000型倒置荧光相差显微镜、Leica SP5型激光扫描共聚焦显微镜购自德国Leica公司，Spectra MR型多功能酶标仪购自美国DYNEX Technologies公司，JEM-1400 FLASH型透射电子显微镜购自日本电子株式会社。
1.2 细胞培养
采用T25培养瓶培育小鼠DC系DC2.4细胞，加入8 mL完全培养基（含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、5 958 mg/L 缓冲剂和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基），置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中进行常规培养。每1~2天行细胞换液，待细胞融合度达80%时进行传代，取第3~10代对数生长期的细胞进行实验。
1.3 LPS刺激后细胞中内质网自噬相关蛋白的蛋白表达
将DC分为LPS刺激0 h（不刺激）组、LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组，用1 μg/mL LPS（浓度下同）培养相应时间后，收集每组细胞约2×10 6个，提取细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法检测FAM134B、LC3B、SEC61B的蛋白表达。一抗分别为兔抗小鼠FAM134B单克隆抗体、兔抗小鼠LC3B单克隆抗体、兔抗小鼠SEC61B单克隆抗体和小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体（稀释比均为1∶5 000，比例下同）。采用化学发光成像分析仪获取图像，采用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）分析各目的蛋白条带灰度值，以β肌动蛋白为内参照，计算相应蛋白的相对表达量，另计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值（以此表示LC3B蛋白表达）。本实验样本数为3。
1.4 LPS刺激对细胞中内质网自噬的影响
1.4.1 FAM134B表达及其与溶酶体探针和LC3B共定位检测
将DC分为PBS组与LPS组，给予相应刺激并培养24 h，收集每组细胞约2×10 6个进行免疫荧光染色。一抗为兔抗小鼠FAM134B单克隆抗体（稀释比为1∶200）、Alexa Fluor 647标记的兔抗小鼠LC3B单克隆抗体（稀释比为1∶100），二抗为Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体（稀释比为1∶1 000），溶酶体探针为Alexa Fluor 647标记的特异性溶酶体荧光染料（稀释比为1∶1 000）。采用含抗荧光淬灭封片剂封片后，于600倍激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞中FAM134B（阳性染色为绿色）表达及其分别与LC3B（阳性染色为红色）和溶酶体探针（阳性染色为红色）的共定位情况。
1.4.2 自噬溶酶体数量观察
取DC，同1.4.1分组处理，收集每组细胞2×10 7个，固定并制片，于1 000倍透射电子显微镜下观察细胞内自噬溶酶体数量。
1.5 敲减 FAM134B基因DC的修饰编辑及鉴定
1.5.1 修饰编辑
将DC按3×10 4个/mL重新悬浮于完全培养基中，按每孔2 mL接种于6孔板中，分为转染含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒的敲减FAM134B组和转染空载慢病毒的空载体组。参照文献［ 11］的基因转染方法，将DC与慢病毒共培养24 h后，更换新的完全培养基。另将仅常规培养的DC设为空白对照组。
1.5.2 鉴定
转染后72 h，于50倍倒置荧光相差显微镜下观察细胞内荧光表达情况，其中携带绿色荧光且活力较好的细胞为成功转染 FAM134B基因的细胞。
1.6 干扰 FAM134B基因表达对LPS诱导细胞凋亡的影响
1.6.1 FAM134B蛋白表达检测
将DC分为单纯PBS组、单纯LPS组，将成功转染含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒的DC分为敲减FAM134B+PBS组、敲减FAM134B+LPS组，将成功转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组，给予相应刺激并培养24 h，收集每组细胞约2×10 6个，提取细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法检测FAM134B的蛋白表达。一抗为兔抗小鼠FAM134B单克隆抗体和小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗及结果分析方法同1.3。本实验样本数为3。
1.6.2 细胞凋亡情况观测
（1）流式细胞术检测。将细胞按每孔2×10 5个接种于6孔板中，同1.6.1进行分组处理，收集各孔悬浮和贴壁细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。本实验样本数为3。（2）Hoechst染色观测。将细胞同1.6.1进行分组处理，收集每组细胞约2×10 6个，进行常规Hoechst染色及制片，于400倍倒置荧光相差显微镜下观察细胞荧光表达情况（凋亡细胞呈现亮蓝色，活细胞呈现暗蓝色），并计算细胞凋亡率。本实验样本数为5。
1.6.3 凋亡相关蛋白的蛋白表达检测
将细胞同1.6.1进行分组处理，收集每组细胞约2×10 6个，提取细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法检测Bax、Bcl-2、剪切型caspase-3的蛋白表达。一抗为兔抗小鼠Bax单克隆抗体、兔抗小鼠Bcl-2单克隆抗体、兔抗小鼠剪切型caspase-3单克隆抗体和小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗及结果分析方法同1.3，另计算Bax/Bcl-2比值。本实验样本数为5。
1.7 统计学处理
采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，用
2. 结果
2.1 内质网自噬相关蛋白的蛋白表达
与LPS刺激0 h组相比，LPS刺激12 h组和LPS刺激24 h组细胞中FAM134B蛋白表达均明显升高（ P<0.05），LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组细胞中SEC61B蛋白表达均明显降低（ P<0.05），LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值均明显升高（ P<0.05），其中LPS刺激24 h组细胞中3个蛋白的变化最显著。见 图1与 表1。将24 h作为后续LPS刺激时长。
注：FAM134B为序列相似性家族134成员B，LC3B为微管相关蛋白1轻链3B；条带上方1、2、3、4、5分别指示内毒素/脂多糖（LPS）刺激0 h（不刺激）组、LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组表1 5组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4中内质网自噬相关蛋白的蛋白表达比较（组别 样本数 FAM134B SEC61B LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值 LPS刺激0 h（不刺激）组 3 0.51±0.10 1.67±0.05 0.79±0.26 LPS刺激6 h组 3 0.75±0.30 1.11±0.21 0.91±0.18 LPS刺激12 h组 3 1.00±0.16 0.94±0.13 0.94±0.09 LPS刺激24 h组 3 1.20±0.07 0.83±0.22 1.59±0.09 LPS刺激72 h组 3 0.80±0.08 1.22±0.26 1.29±0.08 F值 7.70 8.93 13.13 P值 <0.001 <0.001 <0.001 P 1值 0.099 0.004 0.371 P 2值 0.004 0.001 0.289 P 3值 <0.001 <0.001 <0.001 P 4值 0.530 0.016 0.003 注：LPS为内毒素/脂多糖，FAM134B为序列相似性家族134成员B，LC3B为微管相关蛋白1轻链3B； F值、 P值为组间各指标总体比较所得； P 1值、 P 2值、 P 3值、 P 4值分别为LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组、LPS刺激72 h组与LPS刺激0 h组各指标比较所得 2.2 内质网自噬水平
培养24 h，与PBS组相比，LPS组细胞中FAM134B的表达及其与LC3B及溶酶体探针的共定位均显著增强，见 图2。培养24 h，与PBS组相比，LPS组细胞中小空泡状的自噬溶酶体数量明显增多，见 图3。
注：各图中右上小图为细胞核染色（蓝色）图，右中小图为序列相似性家族134成员B（FAM134B）染色（绿色）图，右下小图为微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）或溶酶体探针染色（均为红色）图，各图中左侧大图为右侧3张小图的合成图；FAM134B与LC3B共定位代表其与自噬小体结合情况，FAM134B与溶酶体探针共定位代表其与溶酶体结合情况；图2A、2B为加入FAM134B与LC3B双抗后的染色，图2C、2D为加入FAM134B抗体与溶酶体探针后的染色2.3 细胞的修饰编辑情况
空载体组与敲减FAM134B组细胞转染后72 h均表现出高强度荧光，而空白对照组细胞在相应时间点无荧光表现，见 图4。
2.4 干扰 FAM134B基因表达对LPS诱导细胞凋亡的影响
2.4.1 FAM134B蛋白表达
培养24 h，单纯PBS组、单纯LPS组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组与敲减FAM134B+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达分别为0.290±0.026、1.107±0.091、0.343±0.045、1.060±0.106、0.117±0.038与0.126±0.025（刺激类型的主效应， F=287.56， P<0.001；细胞转染类型的主效应， F=164.52， P<0.001；二者交互作用， F=71.14， P<0.001）。与单纯PBS组和空载体+PBS组相比，敲减FAM134B+PBS组细胞中FAM134B蛋白表达明显降低（ P值分别为0.006、0.001）；与单纯LPS组和空载体+LPS组相比，敲减FAM134B+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达显著降低（ P值均<0.001）；单纯LPS组细胞中FAM134B蛋白表达较单纯PBS组明显升高（ P<0.001），空载体+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达较空载体+PBS组明显升高（ P<0.001），敲减FAM134B+PBS组与敲减FAM134B+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达相近（ P=0.852）。见 图5。
注：FAM134B为序列相似性家族134成员B；条带上方1、2、3、4、5、6分别指示单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯内毒素/脂多糖（LPS）组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组、敲减FAM134B+LPS组；2个空载体组转染空载慢病毒，2个敲减组转染含FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒2.4.2 细胞凋亡情况
2.4.2 .1 流式细胞术检测的细胞凋亡率
培养24 h，单纯PBS组、单纯LPS组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组与敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率分别为（13.3±0.8）%、（32.6±4.3）%、（17.0±1.5）%、（51.7±3.3）%、（52.4±3.1）%与（62.3±2.6）%（刺激类型的主效应， F=106.47， P<0.001；细胞转染类型的主效应， F=162.73， P<0.001；二者交互作用， F=3.99， P=0.048）。与单纯LPS组和空载体+LPS组相比，敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率明显升高（ P值分别为<0.001、0.001）；与对应的PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组相比，单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率分别明显升高（ P值分别为<0.001、<0.001、0.001）。
2.4.2 .2 Hoechst染色观测的细胞凋亡情况
培养24 h，单纯PBS组、单纯LPS组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组与敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率分别为（3.6±1.4）%、（45.7±2.9）%、（6.4±0.5）%、（54.2±6.4）%、（28.6±1.0）%与（86.2±1.4）%（刺激类型的主效应， F=1 986.67， P<0.001；细胞转染类型的主效应， F=335.72， P<0.001；二者交互作用， F=16.53， P<0.001）。与单纯LPS组和空载体+LPS组相比，敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率明显升高（ P值均<0.001）；与对应的PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组相比，单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率分别明显升高（ P<0.001）。见 图6。
2.4.3 凋亡相关蛋白的蛋白表达
培养24 h，与单纯LPS组和空载体+LPS组相比，敲减FAM134B+LPS组细胞中剪切型caspase-3蛋白表达、Bax/Bcl-2比值均明显升高（ P<0.001）。与对应的PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组相比，单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组细胞中剪切型caspase-3蛋白表达、Bax/Bcl-2比值均明显升高（ P值分别为0.032、0.021、<0.001与0.033、0.002、<0.001）。见 图7与 表2。
注：caspase-3为胱天蛋白酶3，Bcl-2为B细胞淋巴瘤2，Bax为Bcl-2相关X蛋白；条带上方1、2、3、4、5、6分别指单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯内毒素/脂多糖（LPS）组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减序列相似性家族134成员B（FAM134B）+PBS组、敲减FAM134B+LPS组；2个空载体组转染空载慢病毒，2个敲减组转染含FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒表2 6组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4培养24 h凋亡相关蛋白的蛋白表达比较（组别 样本数 剪切型caspase-3 Bax/Bcl-2比值 单纯PBS组 5 0.37±0.04 0.70±0.26 单纯LPS组 5 0.60±0.08 1.45±0.18 空载体+PBS组 5 0.37±0.11 1.18±0.12 空载体+LPS组 5 0.62±0.07 2.35±0.82 敲减FAM134B+PBS组 5 0.62±0.30 2.32±0.79 敲减FAM134B+LPS组 5 1.29±0.18 14.10±0.47 P 1值 0.032 0.033 P 2值 0.021 0.002 P 3值 <0.001 <0.001 P 4值 <0.001 <0.001 P 5值 <0.001 <0.001 注：PBS为磷酸盐缓冲液，LPS为内毒素/脂多糖，FAM134B为序列相似性家族134成员B，caspase-3为胱天蛋白酶3，Bcl-2为细胞淋巴瘤2，Bax为Bcl-2相关X蛋白；2个空载体组转染空载慢病毒，2个敲减组转染含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒；剪切型caspase-3、Bax/Bcl-2比值的刺激类型的主效应， F值分别为44.27、575.43， P值均<0.001；细胞转染类型的主效应， F值分别为28.98、569.95， P值均<0.001；二者交互作用， F值分别为6.41、358.95， P值分别为0.006、<0.001； P 1值、 P 2值、 P 3值分别为单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组与对应PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组各指标比较所得； P 4值、 P 5值分别为单纯LPS组、空载体+LPS组与敲减FAM134B+LPS组各指标比较所得 3. 讨论
业已明确，脓毒症患者免疫功能低下与患者晚期病死率上升及继发感染事件增加密切相关 ［ 2］ 。因此，了解脓毒症状态下不同免疫细胞数量改变，将有助于更好地理解脓毒症发病及进展过程，同时也为未来设计临床干预靶点提供理论依据 ［ 2］ 。研究证实，脓毒症患者血液中以及脓毒症小鼠脾脏中DC数量减少是造成免疫抑制的重要原因 ［ 2， 12］ ，且脓毒症状态下DC减少是机体处于免疫抑制状态的诊断标准之一 ［ 2， 13］ 。因此有理由相信，通过针对DC凋亡进行调控进而逆转脓毒症免疫异常状态可能成为治疗脓毒症的新途径。
最近有研究显示，FAM134B介导的内质网自噬可缓和脓毒症状态下小鼠心肌细胞炎症反应并减少心肌细胞的凋亡 ［ 14］ 。Luo等 ［ 15］ 观察到，FAM134B介导的内质网自噬可通过缓解内质网应激，进而抑制心肌细胞死亡。另据报道，FAM134B介导内质网自噬还可通过调控内质网内钙离子稳态，进而调节细胞死亡 ［ 16］ 。干扰素基因刺激因子（STING）是一种定位于内质网上的模式识别受体，其过度激活已被证实与细胞死亡密不可分 ［ 17］ 。Moretti等 ［ 18］ 观察到，相关的内质网自噬受体可感知STING的过度激活，进而靶向降解STING，以达到维持细胞活性的目的。这些资料均提示，内质网自噬可通过多种途径调节细胞稳态，进而缓解细胞死亡。然而，研究显示，内质网自噬还可诱导细胞死亡。例如，在Ⅱ型遗传性感觉和自主神经病变患者中，FAM134B突变可引发过度的内质网自噬，最终导致细胞稳态失衡与细胞死亡 ［ 19］ 。目前看来，FAM134B介导内质网自噬对细胞不同死亡方式有着更为复杂的影响。鉴于内质网自噬在维持细胞内蛋白质稳态中的重要意义及其与人类重大疾病的相关性，本研究率先探讨了FAM134B介导内质网自噬在模拟脓毒症状态下DC凋亡中的潜在作用及其意义，旨在揭示其免疫学效应，并为免疫调理提供新线索。
在本实验中，采用1 μg/mL LPS刺激DC，可观察到FAM134B表达水平显著上调，其中以刺激24 h最为明显，因此将24 h作为后续LPS刺激时长。内质网自噬水平研究显示，LPS刺激24 h后细胞中FAM134B的表达及其与溶酶体探针及LC3B的共定位均明显增强，且自噬溶酶体数量明显增多。以上结果均提示，在LPS作用下细胞中内质网自噬活性显著上调，且在刺激24 h达峰值。基于此，本实验重点分析了在LPS刺激24 h状态下干预FAM134B表达对细胞凋亡的影响。本课题组采用慢病毒转染技术对DC转染带有 FAM134B基因干扰病毒载体及相应的空载体，荧光观察结果提示病毒转染成功。同时，对相应细胞进行蛋白层面的检测，结果显示，单纯LPS刺激后细胞中FAM134B蛋白表达较单纯PBS刺激明显升高；敲减 FAM134B后，无论是LPS刺激还是PBS刺激后细胞中FAM134B蛋白表达均较未敲减 FAM134B细胞显著下降；但敲减 FAM134B后，经LPS刺激与PBS刺激细胞中FAM134B蛋白表达相近。虽未能通过PCR技术进一步验证，但该结果可提示病毒载体已经结合到细胞基因组中，并能有效地抑制细胞中 FAM134B基因的转录与表达。同时，FAM134B蛋白作为介导内质网自噬的关键受体，干扰其表达即可影响细胞中内质网自噬的活化，因此本研究选择给予敲减 FAM134B基因细胞相应刺激后，直接观察细胞的凋亡情况。Hoechst33258染色与流式细胞术结果提示，敲减 FAM134B的表达可进一步加剧LPS诱导的细胞凋亡。上述结果表明，FAM134B介导内质网自噬对LPS诱导细胞凋亡具有潜在抑制效应。但于此过程中观察到在干扰 FAM134B表达后，细胞在未受LPS刺激下即存在凋亡增多的现象，因此仍需进一步探究细胞正常状态下FAM134B介导的内质网自噬对细胞凋亡的影响。此外，敲减 FAM134B并经LPS刺激后，细胞中凋亡相关蛋白剪切型caspase-3与Bax/Bcl-2比值显著升高，提示脓毒症时内质网自噬功能受损，可激活线粒体凋亡途径，进而促进细胞的死亡 ［ 20］ 。
值得说明的是，本研究未深入探究FAM134B介导内质网自噬缓解DC凋亡的确切信号途径，存在一定局限性。但本研究仅为阶段性工作，之后将进一步聚焦FAM134B调控DC凋亡的具体分子机制，深入探讨FAM134B介导内质网自噬与内质网应激、内质网钙离子稳态和STING信号通路之间的关系，以及内质网应激、内质网钙离子稳态和STING信号通路对DC凋亡发生的潜在影响，并进一步了解FAM134B作为调控脓毒症免疫抑制状态的潜在干预靶点的可能性。
本研究表明，脓毒症早期DC中FAM134B介导的内质网自噬明显活化，并可显著抑制细胞凋亡的发生，但其确切信号通路和关键调控环节尚待澄清。深刻认识脓毒症状态下FAM134B介导内质网自噬对免疫细胞，特别是DC凋亡的影响，将为丰富脓毒症免疫调理策略开辟新途径。
段昱：实验操作、论文撰写；姚人骐：实验设计、论文修改；郑丽玉：实验操作；董宁、吴瑶：技术和材料支持；姚咏明、戴新贵：对论文的知识性内容作批评性审阅、研究指导、论文修改和经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 蛋白质印迹法检测的5组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4中内质网自噬相关蛋白的蛋白表达
注：FAM134B为序列相似性家族134成员B，LC3B为微管相关蛋白1轻链3B；条带上方1、2、3、4、5分别指示内毒素/脂多糖（LPS）刺激0 h（不刺激）组、LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组
2 2组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4培养24 h FAM134B介导的内质网自噬情况 Alexa Fluor 647-Alexa Fluor 488×600。2A、2B.分别为磷酸盐缓冲液（PBS）组、内毒素/脂多糖（LPS）组FAM134B与LC3B共定位情况，图2B中FAM134B表达及其与LC3B的共定位较图2A明显增强；2C、2D.分别为PBS组、LPS组FAM134B与溶酶体探针共定位情况，图2D中FAM13B表达及其与溶酶体探针的共定位较图2C明显增强
注：各图中右上小图为细胞核染色（蓝色）图，右中小图为序列相似性家族134成员B（FAM134B）染色（绿色）图，右下小图为微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）或溶酶体探针染色（均为红色）图，各图中左侧大图为右侧3张小图的合成图；FAM134B与LC3B共定位代表其与自噬小体结合情况，FAM134B与溶酶体探针共定位代表其与溶酶体结合情况；图2A、2B为加入FAM134B与LC3B双抗后的染色，图2C、2D为加入FAM134B抗体与溶酶体探针后的染色
3 2组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4培养24 h自噬溶酶体数量 透射电子显微镜×1 000。3A、3B.分别为磷酸盐缓冲液组、内毒素/脂多糖组，与图3A相比，图3B细胞中小空泡状的自噬溶酶体数量明显增多
4 2个转染组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4转染后72 h与空白对照组小鼠DC系DC2.4相应时间点荧光表达 绿色荧光蛋白×50。4A、4B、4C.分别为空白对照组、转染空载慢病毒的空载体组与转染含序列相似性家族134成员B（ FAM134B）基因小干扰RNA序列的慢病毒的敲减FAM134B组，图4A无荧光，图4B、4C表现出明显的绿色荧光，且图4B与图4C间荧光强度无明显差别
5 蛋白质印迹法检测的6组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4培养24 h FAM134B蛋白表达
注：FAM134B为序列相似性家族134成员B；条带上方1、2、3、4、5、6分别指示单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯内毒素/脂多糖（LPS）组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组、敲减FAM134B+LPS组；2个空载体组转染空载慢病毒，2个敲减组转染含FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒
6 6组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4培养24 h凋亡情况 Hoechst×200。6A、6B、6C、6D、6E、6F.分别为单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯内毒素/脂多糖（LPS）组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组、敲减FAM134B+LPS组，图6F较图6D、6E凋亡细胞更多，图6D、6E、6F分别较图6A、6B、6C凋亡细胞更多
注：凋亡细胞呈现亮蓝色，活细胞呈现暗蓝色；2个空载体组转染空载慢病毒，2个敲减组转染含序列相似性家族134成员B（FAM134B）基因小干扰RNA序列的慢病毒
7 蛋白质印迹法检测的6组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4培养24 h凋亡相关蛋白的蛋白表达
注：caspase-3为胱天蛋白酶3，Bcl-2为B细胞淋巴瘤2，Bax为Bcl-2相关X蛋白；条带上方1、2、3、4、5、6分别指单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯内毒素/脂多糖（LPS）组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减序列相似性家族134成员B（FAM134B）+PBS组、敲减FAM134B+LPS组；2个空载体组转染空载慢病毒，2个敲减组转染含FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒
表1 5组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4中内质网自噬相关蛋白的蛋白表达比较（
表1. The comparison of protein expressions of reticulophagy associated proteins of mouse dendritic cell (DC) line DC2.4 in five groups
组别 样本数 FAM134B SEC61B LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值 LPS刺激0 h（不刺激）组 3 0.51±0.10 1.67±0.05 0.79±0.26 LPS刺激6 h组 3 0.75±0.30 1.11±0.21 0.91±0.18 LPS刺激12 h组 3 1.00±0.16 0.94±0.13 0.94±0.09 LPS刺激24 h组 3 1.20±0.07 0.83±0.22 1.59±0.09 LPS刺激72 h组 3 0.80±0.08 1.22±0.26 1.29±0.08 F值 7.70 8.93 13.13 P值 <0.001 <0.001 <0.001 P 1值 0.099 0.004 0.371 P 2值 0.004 0.001 0.289 P 3值 <0.001 <0.001 <0.001 P 4值 0.530 0.016 0.003 注：LPS为内毒素/脂多糖，FAM134B为序列相似性家族134成员B，LC3B为微管相关蛋白1轻链3B； F值、 P值为组间各指标总体比较所得； P 1值、 P 2值、 P 3值、 P 4值分别为LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组、LPS刺激72 h组与LPS刺激0 h组各指标比较所得 
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表2 6组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4培养24 h凋亡相关蛋白的蛋白表达比较（
表2. Comparison of protein expressions of apoptosis‑related proteins of mouse dendritic cell (DC) line DC2.4 in six groups after 24 hours of culture
组别 样本数 剪切型caspase-3 Bax/Bcl-2比值 单纯PBS组 5 0.37±0.04 0.70±0.26 单纯LPS组 5 0.60±0.08 1.45±0.18 空载体+PBS组 5 0.37±0.11 1.18±0.12 空载体+LPS组 5 0.62±0.07 2.35±0.82 敲减FAM134B+PBS组 5 0.62±0.30 2.32±0.79 敲减FAM134B+LPS组 5 1.29±0.18 14.10±0.47 P 1值 0.032 0.033 P 2值 0.021 0.002 P 3值 <0.001 <0.001 P 4值 <0.001 <0.001 P 5值 <0.001 <0.001 注：PBS为磷酸盐缓冲液，LPS为内毒素/脂多糖，FAM134B为序列相似性家族134成员B，caspase-3为胱天蛋白酶3，Bcl-2为细胞淋巴瘤2，Bax为Bcl-2相关X蛋白；2个空载体组转染空载慢病毒，2个敲减组转染含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒；剪切型caspase-3、Bax/Bcl-2比值的刺激类型的主效应， F值分别为44.27、575.43， P值均<0.001；细胞转染类型的主效应， F值分别为28.98、569.95， P值均<0.001；二者交互作用， F值分别为6.41、358.95， P值分别为0.006、<0.001； P 1值、 P 2值、 P 3值分别为单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组与对应PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组各指标比较所得； P 4值、 P 5值分别为单纯LPS组、空载体+LPS组与敲减FAM134B+LPS组各指标比较所得
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