Influences and mechanism of berberine on wound healing of full-thickness skin defects in diabetic mice
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摘要:
目的 探讨小檗碱对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制。 方法 采用实验研究方法。配制含小檗碱终质量浓度分别为0（不含小檗碱）、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μg/mL的小鼠真皮成纤维细胞（MDF）正常糖完全培养基（以下简称常规培养基）。取原代MDF，分别用常规培养基和MDF高糖（30 mmol/L葡萄糖）完全培养基（以下简称高糖培养基）培养，收集第3~6代细胞进行以下实验。取采用常规培养基培养的细胞，饥饿处理12 h后更换为含不同浓度小檗碱的常规培养基培养48 h，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）筛选小檗碱最适作用浓度（样本数为6），用于后续细胞实验。取2种培养基培养的细胞，将采用常规培养基培养的细胞纳入正常对照组，将采用高糖培养基培养的细胞按照随机数字表法（分组方法下同）分为单纯高糖组和高糖+小檗碱组。分别用相应的培养基培养48 h后，采用CCK-8检测细胞活力，采用划痕试验和Transwell实验检测细胞24 h迁移能力，采用实时荧光定量反转录PCR法和蛋白质印迹法分别检测细胞中血小板源性生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β 1（TGF-β 1）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和胱天蛋白酶3（caspase-3）的mRNA和蛋白表达水平，前述实验的样本数分别为6、3、9、3、6。取15只8周龄雄性BALB/c小鼠，构建糖尿病小鼠模型后在其背部制作全层皮肤缺损创面，分为单纯糖尿病组、糖尿病+低浓度（25 μg/mL）小檗碱组和糖尿病+高浓度（75 μg/mL）小檗碱组，分别作相应处理，每组5只鼠。伤后0（即刻）、3、7、14、21 d，采用ImageJ软件测量创面面积。伤后21 d，采用苏木精-伊红染色和Masson染色分别检测创面组织病理学变化及胶原生成情况，采用免疫组织化学法和实时荧光定量反转录PCR法分别检测创面组织中MMP-9、PDGF、TGF-β 1、VEGF、CD31和caspase-3的蛋白和mRNA表达水平。动物实验的样本数均为5。对数据行单因素方差分析、独立样本 t检验、Tukey检验、析因设计方差分析。 结果 培养48 h，筛选出小檗碱质量浓度为20.00 μg/mL时细胞的活力最大。培养48 h后，与正常对照组相比，单纯高糖组、高糖+小檗碱组细胞活力均明显减弱（ P<0.05）；与单纯高糖组相比，高糖+小檗碱组细胞活力明显增强（ P<0.05）。培养48 h后，划痕试验结果显示，与正常对照组相比，单纯高糖组、高糖+小檗碱组细胞24 h迁移率均明显下降（ P<0.05）；与单纯高糖组相比，高糖+小檗碱组细胞24 h迁移率明显升高（ P<0.05）。培养48 h后，Transwell实验结果显示，与正常对照组细胞24 h迁移数（141±7）个相比，单纯高糖组、高糖+小檗碱组细胞24 h迁移数的（28±3）、（86±6）个均明显减少（ t值分别为117.28、31.80， P<0.05）；与单纯高糖组相比，高糖+小檗碱组细胞24 h迁移数明显增多（ P<0.05）。培养48 h后，与正常对照组相比，单纯高糖组、高糖+小檗碱组细胞中PDGF、VEGF、TGF-β 1、MMP-9 mRNA水平均明显降低（ P<0.05），caspase-3 mRNA水平均明显升高（ P<0.05）；与单纯高糖组相比，高糖+小檗碱组细胞中PDGF、VEGF、TGF-β 1、MMP-9 mRNA水平均明显升高（ P<0.05），caspase-3 mRNA表达水平明显降低（ P<0.05）。培养48 h后，与正常对照组相比，单纯高糖组、高糖+小檗碱组细胞中PDGF、VEGF、TGF-β 1、MMP-9蛋白表达水平均明显降低（ P<0.05），caspase-3蛋白表达水平均明显升高（ P<0.05）；与单纯高糖组相比，高糖+小檗碱组细胞中PDGF、VEGF、TGF-β 1、MMP-9蛋白表达水平均明显升高（ P<0.05），caspase-3蛋白表达水平明显降低（ P<0.05）。与单纯糖尿病组相比，糖尿病+低浓度小檗碱组小鼠伤后14、21 d及糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠伤后3、7、14、21 d创面面积均明显减小（ P<0.05）；与糖尿病+低浓度小檗碱组相比，糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠伤后3、7、14、21 d创面面积均明显减小（ P<0.05）。伤后21 d，单纯糖尿病组小鼠创面组织尚未形成上皮，真皮层有大量炎症细胞和肉芽组织；糖尿病+低浓度小檗碱组小鼠创面组织大部分完成上皮化，真皮层有大量炎症细胞；糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠创面大部分完成上皮化，真皮层有少量毛囊和炎症细胞。伤后21 d，与单纯糖尿病组相比，糖尿病+低浓度小檗碱组、糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠创面胶原面积均明显增加（ P<0.05）；与糖尿病+低浓度小檗碱组相比，糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠创面胶原面积明显增加（ P<0.05）。伤后21 d，与单纯糖尿病组相比，糖尿病+低浓度小檗碱组、糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠创面组织中MMP-9、PDGF、TGF-β 1、VEGF和CD31蛋白表达水平均明显升高（ P<0.05），caspase-3蛋白表达水平均明显降低（ P<0.05）；与糖尿病+低浓度小檗碱组相比，糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠创面组织中MMP-9、PDGF、TGF-β 1、VEGF和CD31蛋白表达水平均明显升高（ P<0.05），caspase-3蛋白表达水平明显降低（ P<0.05）。伤后21 d，与单纯糖尿病组相比，糖尿病+低浓度小檗碱组、糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠创面组织中MMP-9、PDGF、TGF-β 1、VEGF和CD31 mRNA水平均明显升高（ P<0.05），caspase-3 mRNA水平均明显降低（ P<0.05）；与糖尿病+低浓度小檗碱组相比，糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠创面组织中MMP-9、PDGF、TGF-β 1、VEGF和CD31 mRNA水平均明显升高（ P<0.05），caspase-3 mRNA水平明显降低（ P<0.05）。 结论 小檗碱可以通过上调MMP-9、PDGF、TGF-β 1、VEGF等因子的表达，下调促凋亡因子caspase-3的表达，从而促进MDF的增殖和迁移以及糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的愈合。 Abstract:Objective To investigate the influences and mechanism of berberine on wound healing of full-thickness skin defects in diabetic mice. Methods The experimental research method was adopted. Mouse dermal fibroblasts (MDF) conventional-glucose complete medium (hereinafter referred to as conventional medium) were prepared with final mass concentrations of berberine of 0 (no berberine), 1.25, 2.50, 5.00, 10.00, 20.00, 40.00, 80.00, and 160.00 μg/mL, respectively. Primary MDF were cultured using conventional medium and MDF high-glucose (30 mmol/L glucose) complete medium (hereinafter referred to as high-glucose medium), and the 3 rd to 6 th passage cells were collected for the following experiments. Cells cultured in conventional medium were taken and subjected to starvation treatment for 12 hours, and then cultured in conventional media containing different concentrations of berberine for 48 hours to screen out the optimal working concentration of berberine using the cell counting kit 8 (CCK-8), the sample number was 6, and the selected optimal berberine concentration was used for subsequent cell culture experiments. Cells cultured in 2 media were taken, of which the cells cultured in conventional medium were included to the normal control group; cells cultured in high-glucose medium were divided into high-glucose alone group and high-glucose+berberine group according to the random number table (the same grouping method below). After 48 h of cultivation, cell viability was detected by CCK-8, cell migration capacity was evaluated by scratch test and Transwell assays, and mRNA and protein expression levels of platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor-β 1 (TGF-β 1), matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), and cysteine aspartic acid specific protease (caspase-3) in the cells were detected by real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction and Western blotting, respectively, and the sample numbers of the aforementioned experiments were 6, 3, 9, 3, and 6, respectively. Fifteen 8-week-old male BALB/c mice were used to establish diabetic mouse model, then full-thickness skin defect wounds on their backs were made and divided into diabetes alone group, diabetes+low-concentration berberine group (25 μg/mL), and diabetes+high-concentration berberine group (75 μg/mL) for corresponding treatments, with 5 mice in each group. The wound areas were measured using ImageJ software on post injury day (PID) 0 (immediately), 3, 7, 14, and 21. On PID 21, histological changes and collagen formation in the wound tissue were detected by hematoxylin-eosin and Masson staining, respectively, protein expression and mRNA levels of MMP-9, PDGF, TGF-β 1, VEGF, CD31, and caspase-3 in the wound tissue were detected by immunohistochemistry and real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, respectively, the sample number of animal experiments was all 5. Data were statistically analyzed with one-way analysis of variance, independent sample t-test, Tukey's test, and factorial design analysis of variance. Results After 48 hours of cultivation, the cell viability was the highest when the mass concentration of berberine was 20.00 μg/mL. After 48 h of cultivation, compared with that in normal control group, cell viability in both high-glucose alone group and high-glucose+berberine group reduced significantly ( P<0.05); compared with that in high-glucose alone group, the cell viability in high-glucose+berberine group was significantly enhanced ( P<0.05). After 48 h of cultivation, scratch test results showed that, the cell migration rates in 24 h in both high-glucose alone group and high-glucose+berberine group were significantly decreased than that in normal control group ( P<0.05); compared with that in high-glucose alone group, the cell migration rate in 24 h in high-glucose+berberine group was significantly enhanced ( P<0.05). After 48 h of cultivation, the results of Transwell experiments showed that, compared with (141±7) of cells migrating in 24 h in normal control group, the number of cells migrating in 24 h in high-glucose alone group and high-glucose+berberine group were 28±3 and 86±6, respectively, which were significantly decreased ( P<0.05); compared with that in high-glucose alone group, the number of cells migration in 24 h in high-glucose+berberine group was significantly increased ( P<0.05). After 48 h of cultivation, compared with those in normal control group, the mRNA levels of PDGF, VEGF, TGF-β 1, and MMP-9 of cells in high-glucose alone group and high-glucose+berberine group were significantly decreased ( P<0.05), the mRNA levels of caspase-3 were significantly increased ( P<0.05); compared with those in high-glucose alone group, the mRNA levels of PDGF, VEGF, TGF-β 1, and MMP-9 of cells in high-glucose+berberine group were significantly increased ( P<0.05), the mRNA expression level of caspase-3 was significantly decreased ( P<0.05). After 48 h of cultivation, compared with those in normal control group, the protein expression levels of PDGF, VEGF, TGF-β 1, and MMP-9 of cells in high-glucose group and high-glucose+berberine group were significantly decreased ( P<0.05), the protein expression levels of caspase-3 were significantly increased ( P<0.05); compared with those in high-glucose alone group, the protein expression levels of PDGF, VEGF, TGF-β 1, and MMP-9 of cells in high-glucose+berberine group were significantly increased ( P<0.05), and the protein expression level of caspase-3 was significantly decreased ( P<0.05). Compared with those in diabetes alone group, the wound areas of mice in diabetes+low-concentration berberine group on PID 14 and 21 and in diabetes+high-concentration berberine group on PID 3, 7, 14, and 21 were significantly decreased ( P<0.05); compared with that in diabetes+low-concentration berberine group, the wound area in diabetes+high-concentration berberine group was significantly decreased on PID 3, 7, 14, and 21 ( P<0.05). On PID 21, the wound of mice in diabetes alone group was not epithelialized with a large number of inflammatory cells and granulation tissue in the dermis; most of the wound tissue of mice in diabetes+low-concentration berberine group was already epithelialized, although there was a large number of inflammatory cells in the dermis; and most of the wound tissue of mice in diabetes+high-concentration berberine group had completed epithelialization with a small number of hair follicles and inflammatory cells in the dermis. On PID 21, compared with that in diabetes alone group, the collagen area of wound of mice in diabetes+low-concentration berberine group and diabetes+high-concentration berberine group was significantly increased ( P<0.05); compared with that in diabetes+low-concentration berberine group, the collagen area of wound of mice in diabetes+high-concentration berberine group was significantly increased ( P<0.05). On PID 21, compared with those in diabetes alone group, the protein expression levels of MMP-9, PDGF, TGF-β 1, VEGF, and CD31 in wound tissue of mice in diabetes+low-concentration berberine group and diabetes+high-concentration berberine group were significantly increased ( P<0.05), the protein expression levels of caspase-3 were significantly decreased ( P<0.05); compared with those in diabetes+low-concentration berberine group, the protein expression levels of MMP-9, PDGF, TGF-β 1, VEGF, and CD31 in wound tissue of mice in diabetes+high-concentration berberine group were significantly increased ( P<0.05), the protein expression level of caspase-3 was significantly decreased ( P<0.05). On PID 21, compared with those in diabetes alone group, the mRNA levels of MMP-9, PDGF, TGF-β 1, VEGF, and CD31 in wound tissue of mice in diabetes+low-concentration berberine group and diabetes+high-concentration berberine group were significantly increased ( P<0.05), the mRNA levels of caspase-3 were significantly decreased ( P<0.05); compared with those in diabetes+low-concentration berberine group, the mRNA levels of MMP-9, PDGF, TGF-β 1, VEGF, and CD31 in wound tissue of mice in diabetes+high-concentration berberine group were significantly increased ( P<0.05), the mRNA level of caspase-3 was significantly decreased ( P<0.05). Conclusions Berberine can promote the proliferation and migration of MDF and the healing of full-thickness skin defect wounds of mice in diabetic mice by up-regulating the expression of biofactors including MMP-9, PDGF, TGF-β 1, and VEGF, and down-regulating the expression of caspase-3, a pro-apoptotic factor in wound tissue of mice. -
Key words:
- Berberine /
- Diabetes mellitus, experimental /
- Fibroblasts /
- Cytokines /
- Wound repair
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创面修复需要经历复杂的生物学过程，当创面愈合某个阶段失调时，可导致皮肤组织的延期愈合或者不愈合 ［ 1］ 。虽然自体皮肤移植是治疗难愈性创面的“金标准”，但是该治疗方案也存在皮源缺乏、瘢痕增生以及治疗费用昂贵等限制因素 ［ 2］ 。因此，寻求新的方式和途径治疗难愈性创面是必然要求。组织工程皮肤是具有生物活性的人工皮肤替代物，有望用于治疗急慢性皮肤创面。种子细胞是组织工程皮肤的基础，目前干细胞已成组织工程皮肤中种子细胞的最佳选择 ［ 3］ 。与其他具有多向分化潜能的干细胞相比，脂肪干细胞（ADSC）具有含量丰富、来源广泛，伦理问题较少等优势 ［ 4］ ，有利于商品化生产及应用。除此之外，ADSC还可以通过分泌多种细胞因子、分化为其他类型细胞等方式促进血管新生和再上皮化 ［ 5, 6, 7］ 、降低炎症水平 ［ 8］ 、调节免疫反应 ［ 9］ ，进而加速创面愈合。支架材料按来源可分为天然材料、合成材料、复合材料。理想的皮肤组织工程支架应该具有适合种子细胞黏附和生长的孔隙结构、良好的生物相容性以及与人体皮肤相似的机械性能 ［ 10］ 。本文概述各类支架材料的生物学特性、各类支架材料构建的皮肤组织工程支架在体外实验中对ADSC的影响以及不同形态的组织工程皮肤的应用情况。
1. 天然材料
天然材料主要指存在于植物、动物和微生物中的有机大分子化合物，常用于皮肤组织工程的天然材料有纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、透明质酸、壳聚糖等 ［ 11］ 。天然材料通常具有良好的组织相容性和可降解性，以及较低的免疫原性，有利于ADSC的黏附和生长，因此被广泛用于制造皮肤组织工程支架 ［ 12］ 。
1.1 纤维蛋白
纤维蛋白多存在于血浆中，是自体血源性蛋白支架的重要组成部分。常使用的自体血源性蛋白支架包括富血小板血浆（PRP）、富血小板纤维蛋白以及浓缩生长因子等，三者的区别主要是分离方式不同 ［ 13］ 。在离心或者特殊试剂（凝血酶/氯化钙等）的作用下，血浆中的血小板和白细胞可被激活，进而释放大量生长因子和细胞因子，促进皮肤组织修复与再生。使用PRP作为负载ADSC的生物活性支架，具有以下诸多优势：（1）加入凝血酶后的PRP即可转变为凝胶状，凝胶质地可以使皮肤替代物较好地覆盖创面，也可以给种子细胞提供一定的机械支持 ［ 14］ 。（2）富含的多种生物活性成分可以调控和影响血管化的进程，PRP对组织工程皮肤的血管化进程有显著促进作用 ［ 15］ ，这对实现组织工程皮肤快速血管化有重要意义。创面愈合是一个复杂的病理生理过程，每个阶段均受到多种细胞因子调控。PRP中的活性成分具有种类繁多且成分不明的特点。虽然有实验研究表明，PRP凝胶联合ADSC有助于加速创面愈合 ［ 14, 15, 16, 17］ ，但这一特点也加大了在探讨ADSC与PRP的相互作用机制方面的研究难度。
有关研究表明，自体PRP可增强大鼠ADSC的活力和迁移能力，PRP与ADSC联合应用可通过调节人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物/蛋白激酶B通路，促进创面愈合中的血管新生，从而加速大鼠全层皮肤缺损创面的愈合 ［ 15］ ，这可为难愈性创面快速血管化问题提供一个新思路。有研究表明，将自体PRP凝胶负载大鼠ADSC应用于糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面可在毛细血管再生以及内皮细胞增殖方面产生积极作用，机制探索显示，ADSC联合PRP凝胶可以通过信号转导及转录激活因子3/VEGF轴增强糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面的血管生成 ［ 16］ 。既往研究显示，在糖尿病大鼠溃疡创面中存在Notch信号通路的病理性激活，同时伴有VEGF和基质细胞衍生因子1基因表达的显著减少，白化病小鼠ADSC联合自体PRP凝胶的应用可以下调过度激活的Notch信号通路、增强血管生成，促进表皮细胞增殖和募集，最终加速糖尿病创面愈合 ［ 17］ 。
1.2 胶原蛋白
胶原蛋白是皮肤中的主要结构蛋白，其具有以下优势：（1）来源丰富、无毒以及提取纯化容易；（2）弱抗原性，极少引起免疫反应；（3）可降解性和可吸收性；（4）可为细胞附着、迁移和增殖提供支持等 ［ 18, 19］ 。此外，单纯胶原蛋白溶胶存在机械强度低、对ADSC的包裹性较差的不足，在构建组织工程皮肤的时候，常需要对胶原蛋白进行改性处理，使其能形成稳定的凝胶形态 ［ 20, 21, 22］ 。目前常采用物理交联和化学交联的方式改性。
有研究团队通过使用胶原蛋白基水凝胶包封特定亚群的小鼠ADSC并应用于小鼠烧伤创面，结果表明该水凝胶可显著加快创面再上皮化时间、上调相关促血管生成因子的基因表达以及下调促纤维化基因和促炎基因的表达，从而缩短创面愈合时间，提升愈合质量 ［ 20］ 。以往研究中用到的胶原蛋白多为动物来源，这些胶原蛋白存在着一定的免疫原性和致病性污染的问题，随着重组人胶原蛋白制备工艺的成熟，生物活性更高、透皮吸收率更强的人源性胶原蛋白可实现大规模生产及应用。一项研究表明，由一种具有特定序列重组人Ⅰ型胶原肽海绵构成的支架可以诱导人ADSC的增殖、迁移和ECM的产生，同时该支架负载ADSC后可以有效促进小鼠辐照创面的愈合 ［ 22］ 。
1.3 明胶
明胶是经胶原蛋白适度水解和热变性得到的天然高分子材料，在明胶的制备过程中，胶原蛋白天然的螺旋结构往往遭到破坏。明胶的结构复杂，侧链上含有多种可修饰的活性位点（如氨基、羧基、羟基等），这些活性位点可通过动态共价结合的方式与其他合成材料共同构建复合材料 ［ 23］ ，也可以经小分子化合物修饰改性为新型智能生物材料 ［ 24］ ，从而使支架具备特定的性能，例如：光敏性、响应性以及温敏性等。
相关研究表明，经过改性后形成的明胶水凝胶在具有光敏性的同时还拥有良好的三维网状结构，对小鼠ADSC活性和干性的维持有着积极的作用。该生物活性支架可以通过改善慢性创面的高炎症状态，促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化 ［ 24］ 。基于明胶构建的水凝胶在细胞黏附和组织重建方面有着较大的优势，但单纯的明胶基水凝胶往往面临力学性能较弱的问题，因此在实际应用时多需要与其他材料共同构建成复合材料来保证组织工程皮肤有较为适宜的机械张力。
1.4 透明质酸
透明质酸在人体的组织间隙中广泛存在，也是皮肤ECM的重要组成成分，具有良好的生物相容性、可降解性以及可修饰特性 ［ 25］ 。有学者制备了负载人ADSC的透明质酸水凝胶并应用于糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面，结果表明，该生物活性支架可通过改善免疫反应和加速上皮形成来加速创面愈合过程 ［ 26］ 。
在实际使用中，为了形成具有自愈合能力、可注射性能、导电性能等的功能性水凝胶，往往需要对透明质酸进行改性处理。虽然透明质酸的活性位点少于明胶，但是由于其分子量更小，结构相对单一，其可进行化学修饰的能力更强，更有利于探究细胞与支架材料的相互关系及其作用机制。有学者开发了一种接枝多巴胺的透明质酸水凝胶贴片，并探究负载人ADSC的透明质酸基水凝胶贴片对糖尿病小鼠溃疡创面愈合的促进作用，结果显示，与空白组、ADSC组以及透明质酸基水凝胶贴片组相比，负载ADSC的透明质酸基水凝胶贴片组小鼠创面修复效果最好，机制研究显示，透明质酸基水凝胶贴片和ADSC联合应用可能是通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路，促进糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面中的血管生成和组织再生，从而加速创面修复 ［ 27］ 。
1.5 壳聚糖
壳聚糖是一种多糖类聚合物，具有良好的抗菌性能以及促进血管再生性能，目前大部分的研究集中在其在止血、抗感染方面的应用 ［ 28］ 。同时，壳聚糖分子结构上众多的结构修饰基团（羟基、氨基）也为壳聚糖联合ADSC构建组织工程皮肤提供了丰富的策略。
相关的研究表明基于壳聚糖开发的水凝胶有着良好的生物相容性，并且可以促进ADSC迅速分化为成骨细胞 ［ 29］ 。目前，关于负载ADSC的壳聚糖支架的研究大多集中在调控ADSC的增殖和成骨分化方面 ［ 29, 30］ ，这可能是因为壳聚糖基水凝胶通常具有较高的力学性能。通过复合其他材料，降低壳聚糖基水凝胶的硬度，可为开发皮肤组织工程支架提供新思路。研究表明，采用壳聚糖和ADM构建的皮肤组织工程支架具有抑制炎症反应的作用，并且可延长小鼠骨髓间充质干细胞在创面的存活时间 ［ 31］ 。有研究者利用明胶、羧甲基壳聚糖和海藻酸钠制备了可负载大鼠ADSC和骨髓间充质干细胞的水凝胶，分别将负载2种干细胞的水凝胶植入裸鼠双侧皮下，实验表明，置入体内2周后，被包裹在该支架中的2种干细胞仍表现出良好的增殖活性 ［ 32］ 。这项研究为后续构建负载ADSC的皮肤组织工程支架提供了一定的参考价值。
2. 合成材料与复合材料
2.1 合成材料
合成材料通常指的是通过化学合成得到的高分子材料或无机材料等，如聚醇类材料（聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乙二醇等）、聚酯类材料（聚癸二酸甘油酯、聚己内酯等）和无机材料（生物活性陶瓷、无机硅）等。虽然合成材料具有可调节支架的生物降解性以及可调节支架的机械张力等优点 ［ 33］ ，但是其生物组织相容性一般低于天然材料，在构建皮肤支架时多采用2种及以上材料。聚醇类材料均由含羟基的小分子醇或酸聚合形成，由于小分子醇或酸空间结构上具有一定的相似性，可与胶原蛋白、纤维素等极性较高的天然材料配伍，以增强天然材料支架的机械张力。聚酯类材料的降解速率一般较低，在与天然材料配伍时，可降低支架的降解速率。有研究团队制备了仿生化的聚癸二酸甘油酯-聚乳酸支架，并证实该支架的力学性能与脂肪组织相近，有利于人ADSC的存活，同时该支架高度互连的多孔结构和亲水性能也有利于血管新生 ［ 34］ 。此外，通过三维打印技术制备的组织工程支架还有引导人骨髓间充质干细胞黏附、增殖和定向分化的作用 ［ 35］ 。合成材料可以保护细胞因子、小分子药物等生物活性成分不被降解，这或许可以为组织工程皮肤中ADSC干性的维持以及定向分化提供新的策略。
2.2 复合材料
复合材料是将2种或2种以上不同类别的材料，按照一定的比例和方法组合而成的新材料 ［ 36］ 。由于兼顾不同种材料的特性，除了同时具有良好的组织相容性和可降解性这一优势外，还能通过增材制作技术对材料的尺寸、孔隙率以及机械强度进行仿生化改进 ［ 37］ 。用于促进皮肤创面愈合的复合生物材料可形成类天然ECM结构的水凝胶，也可以形成具有适合干细胞植入和代谢的多孔隙的固态支架。
具有抵御细菌的屏障作用、良好的溶胀性能、可包埋细胞和递送生物活性分子的水凝胶是目前组织工程皮肤领域最常见的材料形态 ［ 38］ 。水凝胶的机械性能和降解速率具有良好的可调节性，同时复合材料中多种化学修饰位点也为形成功能化水凝胶提供了丰富的修饰策略。例如，使用甲基丙烯酸酐修饰天然材料后形成光敏性的水凝胶体系给组织工程皮肤的体内打印带来了极大的应用前景。甲基丙烯酰化明胶（GelMA）具备良好的光敏凝胶特性和可降解性，通过改变其接枝率、质量分数可得到具有不同力学性能、黏弹特性的光敏水凝胶。有学者以GelMA和ADM为支架材料，使用三维生物打印技术开发的功能性皮肤模型具有维持细胞活力、促进创面愈合和再上皮化以及提高创面愈合质量的作用 ［ 39］ 。
通过增材制作技术制得的多孔隙固态支架具有精确的三维多孔结构，有利于研究ADSC的黏附、细胞间的通讯以及生物活性因子的负载，或可成为解决组织工程血管化问题的重要途径。但是与水凝胶形态相比较，多孔隙固态贴片还存在着不能完全贴合创面的问题。有研究显示，以细菌纤维素、聚己内酯为材料通过三维生物打印技术制备的皮肤组织工程支架具有与天然皮肤相似的力学性能，良好的力学微环境有利于大鼠ADSC的生长，与二维培养相比，三维培养条件可增强ADSC的旁分泌作用，促进小鼠Fb迁移，加快小鼠急性全层皮肤缺损创面的修复 ［ 40］ 。
实现难愈性创面的再生或无瘢痕修复是皮肤组织工程领域一直面临的挑战 ［ 41］ ，慢性难愈性创面微环境多表现为持续的高炎症状态。相较于传统的敷料，复合材料可以更好地在组织工程皮肤中清除活性氧，可选择异物反应小、细胞毒性小的植物化合物或天然材料（姜黄素、丝胶蛋白等）清除活性氧，有研究团队使用三维生物打印技术制备了一种负载人ADSC和姜黄素的明胶基支架，并将其应用于糖尿病大鼠溃疡创面，结果证实该支架有利于降低创面中的活性氧水平，并抑制ADSC凋亡 ［ 42］ 。丝胶蛋白是一种抗氧化材料，可以帮助Fb抵御自由基的损伤。有团队构建了一种有层粘连蛋白涂层的丝胶蛋白-明胶支架，体外研究表明，该支架上负载的大鼠ADSC可在体外高氧自由基模型中维持其代谢活性；体内研究表明，负载ADSC的该支架可以显著改善大鼠创面的愈合质量，达到接近无瘢痕愈合（创面内胶原蛋白呈网状排布与正常大鼠皮肤相似） ［ 43］ 。
3. 负载ADSC的皮肤替代物用于临床试验的现状
目前，已有临床试验证实ADSC可以促进难愈性创面的愈合。使用负载ADSC的皮肤替代物治疗创面的临床试验在近几年也有见报道。截至2023年1月，在中国临床试验注册中心中未见有负载ADSC的皮肤替代物用于治疗创面的临床试验注册信息；在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的临床试验公共网站上登记着多项关于负载ADSC的皮肤替代物用于治疗难愈性创面的临床试验（ 表1）。其中有2项临床试验结果被PubMed数据库收录，多中心临床试验（NCT02619877）结果表明负载人异体ADSC的水凝胶显著缩短了糖尿病溃疡创面的愈合时间，该水凝胶可以安全有效地治疗糖尿病溃疡创面 ［ 44］ 。此外，另一项临床试验证实，人异体ADSC能够从纤维蛋白凝胶迁移到糖尿病足溃疡创面中，并且相较于单纯水凝胶组，负载ADSC的水凝胶组的糖尿病足溃疡创面治疗效果更好 ［ 45］ 。
表1 13项关于负载ADSC的皮肤替代物用于治疗难愈性创面的临床试验创面类型 发布年份 皮肤替代物 ADSC来源 项目编号 深Ⅱ度烧伤创面 2015 异体脂肪来源的干细胞水凝胶 同种异体 NCT02619851 糖尿病足溃疡创面 2015 异体脂肪来源的干细胞水凝胶 同种异体 NCT02394886 压疮 2015 负载脂肪来源的基质细胞的纤维蛋白密封剂 自体 NCT02375802 糖尿病足溃疡创面 2015 异体脂肪来源的干细胞水凝胶 同种异体 NCT02619877 烧伤创面 2017 异体脂肪来源的干细胞水凝胶 同种异体 NCT03183648 Ⅱ度及Ⅲ度烧伤创面 2017 负载ADSC的贫血小板血浆纤维蛋白水凝胶 同种异体 NCT03113747 烧伤创面 2017 异体脂肪来源的干细胞水凝胶 同种异体 NCT03183622 烧伤创面 2017 异体脂肪来源的干细胞水凝胶 同种异体 NCT03183648 糖尿病足溃疡创面 2017 异体脂肪来源的干细胞水凝胶 同种异体 NCT03183804 糖尿病足溃疡创面 2018 异体脂肪来源的干细胞水凝胶 同种异体 NCT03754465 糖尿病足溃疡创面 2019 负载ADSC的纤维蛋白水凝胶 同种异体 NCT03865394 糖尿病足溃疡创面 2020 异体脂肪来源的干细胞水凝胶 同种异体 NCT04569409 糖尿病足溃疡创面 2020 异体脂肪来源的干细胞水凝胶 同种异体 NCT04590703 注：ADSC为脂肪干细胞 4. 总结与展望
ADSC可在创面愈合中发挥重要作用，但是在全层皮肤缺损的创面或者糖尿病创面中，毛细血管缺损或者毛细血管生成受损，会减少ADSC作用部位的血供，影响ADSC促进创面愈合的效果。因此，如何提高ADSC在移植创面上的存活率，并增强ADSC在移植后的生物学功能已然成为制备组织工程皮肤过程中需要解决的两大难题。在利用组织工程技术形成的各类支架材料中，能完全贴合创面的功能化水凝胶被认为是最有前途的材料之一，尽管近些年来在技术层面已经取得了较大的突破与创新，但其仍然存在许多局限性，如降解不可控、仿生性不足等；此外，采用增材制作技术（包括光固法、三维印刷法及选择性激光烧结法）能够精准地控制生物支架的外部几何形状和内部三维结构，但是这种技术对设备要求高，无法制备出兼顾高精度、大尺寸特点的组织工程皮肤；在三维生物打印过程中，高压力会使得ADSC的活性在流经喷嘴后显著降低。这些问题或许可以通过多种支架材料的复合、支架材料的表面改性、制备工艺的优化（同时采用2种或多种制备工艺）及添加生物活性因子缓释微球等方式来解决，相信随着制备工艺的不断成熟以及研究方法的不断优化，未来可以制备高度可控的生物支架，更有效地促进ADSC的黏附、增殖，甚至调控ADSC分化，解决创面愈合过程中面临的诸多难题。
郑力铭：实验操作、论文撰写；刘钟元、颜鸿宇、李恒飞：数据整理、统计学分析；张志文：研究指导、论文修改、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 培养48 h后划痕试验检测3组小鼠真皮成纤维细胞24 h迁移情况。1A、1B、1C.分别为正常对照组、单纯高糖组和高糖+小檗碱组划痕0 h（即刻）细胞情况，其划痕情况近似；1D、1E、1F.分别为正常对照组、单纯高糖组和高糖+小檗碱组细胞划痕24 h细胞迁移情况，图1E中划痕剩余面积最大
注：图中竖线为细胞迁移的边缘线；高糖指葡萄糖物质的量浓度为30 mmol/L，小檗碱质量浓度为20.00 μg/mL
2 培养48 h后Transwell实验检测3组小鼠真皮成纤维细胞24 h迁移情况 结晶紫×200。2A、2B、2C.分别为正常对照组、单纯高糖组和高糖+小檗碱组Transwell下室细胞迁移数量，图2B中迁移的细胞数最少
注：高糖指葡萄糖物质的量浓度为30 mmol/L，小檗碱质量浓度为20.00 μg/mL
3 蛋白质印迹法检测3组小鼠真皮成纤维细胞培养48 h后多种细胞因子蛋白表达水平
注：高糖指葡萄糖物质的量浓度为30 mmol/L，小檗碱质量浓度为20.00 μg/mL；条带上方1、2、3分别指示正常对照组、单纯高糖组和高糖+小檗碱组；PDGF为血小板源性生长因子，VEGF为血管内皮生长因子，TGF-β1为转化生长因子β1，MMP-9为基质金属蛋白酶9，caspase-3为胱天蛋白酶3
4 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点创面面积。4A、4B、4C、4D、4E.分别为单纯糖尿病组小鼠伤后0（即刻）、3、7、14、21 d创面情况；4F、4G、4H、4I、4J.分别为糖尿病+低浓度（25 μg/mL）小檗碱组小鼠伤后0、3、7、14、21 d创面情况，图4I、4J创面面积较图4D、4E明显缩小；4K、4L、4M、4N、4O.分别为糖尿病+高浓度（75 μg/mL）小檗碱组小鼠伤后0、3、7、14、21 d创面情况，3组小鼠创面均随时间延长趋向闭合，图4L、4M、4N、4O创面面积分别较图4B、4C、4D、4E和图4G、4H、4I、4J明显缩小
5 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后21 d病理变化及胶原分布。5A、5B、5C.分别为单纯糖尿病组、糖尿病+低浓度（25 μg/mL）小檗碱组、糖尿病+高浓度（75 μg/mL）小檗碱组小鼠创面组织病理情况，其中图5C中的创面上皮化形成情况最好，真皮层有少量毛囊和少量炎症细胞 苏木精-伊红×200；5D、5E、5F.分别为单纯糖尿病组、糖尿病+低浓度小檗碱组、糖尿病+高浓度小檗碱组小鼠创面组织胶原分布情况，其中图5F的创面中胶原分布最密集 Masson×200
表1 实时荧光定量反转录PCR检测的小鼠真皮成纤维细胞中多种细胞因子的引物序列及产物大小
表1. The primer sequences and product sizes of polycytokines in mouse dermal fibroblasts detected by real‑time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
引物名称 引物序列（5'→3'） 产物大小（bp） β肌动蛋白 上游引物： CTGAGAGGGAAACGTGCGT 208 下游引物： CCACAGGATTCCATACCCAAGA PDGF 上游引物： CAGTGCTGGAAGTGGTTAACG 183 下游引物： CATCCTCTTCCACGATGACTAAG VEGF 上游引物： GCTACTGCCGTCCGATTGAG 268 下游引物： GGCTTTGTTCTGTCTTTCTTTGGT TGF-β 1 上游引物： AGAGCCCTGGATACCAACTATTG 286 下游引物： TGCGACCCACGTAGTAGACG MMP-9 上游引物： GTGTCTGGAGATTCGACTTGAAG 130 下游引物： CAGAAATAGGCTTTGTCTTGGTACT caspase-3 上游引物： GTGGGACTGATGAGGAGATGGC 137 下游引物： AAGGGACTGGATGAACCACGAC 注：PDGF为血小板源性生长因子，VEGF为血管内皮生长因子，TGF-β 1为转化生长因子β 1，MMP-9为基质金属蛋白酶9，caspase-3为胱天蛋白酶3 
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表2 含不同质量浓度小檗碱的培养基培养48 h后小鼠真皮成纤维细胞吸光度值比较（
表2. Comparison of absorbance value of mouse dermal fibroblasts cultured in medium with different concentrations of berberine for 48 h
小檗碱质量浓度（μg/mL） 样本数 吸光度值 t值 P值 0 6 0.72±0.05 — — 1.25 6 0.77±0.05 0.42 0.680 2.50 6 0.82±0.05 2.00 0.060 5.00 6 0.92±0.05 3.27 0.004 10.00 6 0.95±0.05 3.74 0.002 20.00 6 0.98±0.07 4.00 0.001 40.00 6 0.97±0.07 3.92 0.002 80.00 6 0.90±0.06 1.83 0.085 160.00 6 0.80±0.04 <0.01 1.000 注：“—”表示无此项；细胞吸光度值总体比较， F=28.74， P<0.001； t值、 P值为其他质量浓度与0 μg/mL比较所得
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表3 3组小鼠真皮成纤维细胞培养48 h后多种细胞因子mRNA和蛋白表达水平的比较（
表3. Comparison of mRNA and protein expression levels of polycytokines of mouse dermal fibroblasts in the three groups after 48 hours of culture
组别 样本数 mRNA 蛋白 PDGF VEGF TGF-β 1 MMP-9 caspase-3 PDGF VEGF TGF-β 1 MMP-9 caspase-3 正常对照组 3 1.063± 0.947± 1.090± 1.053± 0.94± 0.694± 0.769± 0.673± 0.743± 0.317± 0.058 0.041 0.067 0.039 0.04 0.040 0.040 0.052 0.105 0.026 单纯高糖组 3 0.203± 0.260± 0.163± 0.287± 2.29± 0.210± 0.060± 0.150± 0.057± 0.614± 0.021 a 0.014 a 0.005 a 0.024 a 0.22 a 0.029 a 0.010 a 0.047 a 0.008 a 0.024 a 高糖+小檗碱组 3 0.477± 0.533± 0.400± 0.593± 1.75± 0.350± 0.238± 0.300± 0.224± 0.399± 0.031 ab 0.025 ab 0.043 ab 0.039 ab 0.08 ab 0.043 ab 0.035 ab 0.016 ab 0.015 ab 0.022 ab F值 328.67 157.33 242.67 178.00 3 562.33 29.33 212.00 16.00 84.33 72.33 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 0.002 <0.001 0.006 <0.001 <0.001 注：高糖指葡萄糖物质的量浓度为30 mmol/L，小檗碱质量浓度为20.00 μg/mL；PDGF为血小板源性生长因子，VEGF为血管内皮生长因子，TGF-β 1为转化生长因子β 1，MMP-9为基质金属蛋白酶9，caspase-3为胱天蛋白酶3；与正常对照组比较， a P<0.05；与单纯高糖组比较， b P<0.05
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表4 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点创面面积比较（cm 2，
表4. Comparison of wound area of full-thickness skin defect wounds in diabetic mice in the three groups at each time point after injury
组别 样本数 0 d（即刻） 3 d 7 d 14 d 21 d 单纯糖尿病组 5 0.621±0.041 0.521±0.035 0.431±0.015 0.342±0.020 0.112±0.008 糖尿病+低浓度小檗碱组 5 0.623±0.018 0.516±0.013 0.412±0.016 0.238±0.018 a 0.088±0.007 a 糖尿病+高浓度小檗碱组 5 0.626±0.018 0.425±0.019 ab 0.279±0.019 ab 0.155±0.017 ab 0.022±0.004 ab F值 0.05 15.08 61.55 56.62 92.77 P值 0.950 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：小檗碱低质量浓度、高质量浓度分别为25 μg/mL、75 μg/mL；处理因素主效应， F=231.60， P<0.001；时间因素主效应， F=879.40， P<0.001；两者交互作用， F=115.50， P<0.001；与单纯糖尿病组比较， a P<0.05；与糖尿病+低浓度小檗碱组比较， b P<0.05
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表5 伤后21 d 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面组织中各细胞因子的蛋白表达和mRNA水平比较（
表5. Comparison of protein expression and mRNA levels of various cytokines in the wound tissue of full-thickness skin defects of mice in the three groups on post injury day 21
组别 样本数 蛋白表达水平 基质金属蛋白酶9 血小板源性生长因子 转化生长因子β 1 血管内皮生长因子 CD31 胱天蛋白酶3 单纯糖尿病组 5 419±44 470±76 201±9 827±71 293±40 5 347±686 糖尿病+低浓度小檗碱组 5 1 872±242 a 1 116±158 a 1 616±87 a 1 811±254 a 1 498±215 a 3 266±461 a 糖尿病+高浓度小檗碱组 5 3 089±342 ab 2 184±286 ab 2 856±447 ab 3 311±495 ab 3 236±446 ab 2 196±290 ab F值 49.93 41.00 60.38 145.50 108.72 60.39 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：小檗碱低质量浓度、高质量浓度分别为25 μg/mL、75 μg/mL；与单纯糖尿病组比较， a P<0.05；与糖尿病+低浓度小檗碱组比较， b P<0.05
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