Clinical effects of expanded flaps in reconstructing scar contracture deformities in the face and neck after extensive burns
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摘要:
目的 探讨扩张皮瓣整复大面积烧伤后面颈部瘢痕挛缩畸形的临床效果。 方法 采用回顾性观察性研究方法。2016年5月—2022年9月，武汉大学同仁医院暨武汉市第三医院收治17例大面积烧伤后面颈部瘢痕挛缩畸形患者，其中男13例、女4例，年龄23~55岁，颈部挛缩程度Ⅱ度者3例、Ⅲ度者14例，12例患者合并面部瘢痕挛缩畸形。Ⅰ期于面、胸、肩、腹部等处置入34个额定容量为100~600 mL的长方形皮肤软组织扩张器（以下简称扩张器）注射生理盐水扩张。Ⅱ期切除瘢痕组织、松解挛缩，纠正畸形，局部转移2个扩张面部皮瓣、带蒂转移17个扩张皮瓣、游离移植15个扩张皮瓣修复松解后继发创面（对7个皮瓣行动脉增压），并使用吲哚菁绿荧光显影技术评估移植时皮瓣动脉血流灌注和静脉回流状况。除2个面部皮瓣外的32个皮瓣切取面积为10 cm×8 cm~36 cm×16 cm，将31个皮瓣供区创面直接缝合封闭，1个皮瓣供区创面采用自体刃厚头皮移植修复。观察并记录扩张器的埋置部位皮肤状态、扩张时间、注射生理盐水总量，皮肤软组织扩张术并发症发生情况，Ⅱ期术后皮瓣成活情况。随访患者面颈部远期整复效果和皮瓣供区恢复情况。末次随访时，采用利克特5级量表评价患者的疗效满意度。 结果 17例患者的34个扩张器埋置部位中，22个部位为深Ⅱ度烧伤后浅表瘢痕皮肤，8个部位为多次供皮后浅表瘢痕皮肤，4个部位为正常皮肤。经4~15个月的扩张，扩张器注射生理盐水总量为238~2 000 mL，扩张区域无并发症发生。Ⅱ期术后，2个带蒂移植皮瓣蒂部远端部分坏死，坏死创面分别经皮瓣修整和对侧扩张胸三角皮瓣游离移植后愈合，其余皮瓣均完全成活。随访6~18个月，2个扩张脐旁皮瓣和1个扩张腹股沟皮瓣较臃肿，行修薄术后臃肿改善，其余皮瓣外观、质地良好；所有皮瓣供区均恢复良好。末次随访时，所有患者面颈部瘢痕挛缩畸形均明显改善，患者疗效满意度：8例非常满意、9例比较满意。 结论 采用胸部、腹部等部位的扩张皮瓣，综合应用局部转移、带蒂转移、游离移植方式，可使大面积烧伤后面颈部瘢痕挛缩畸形得到有效整复，在恢复术区功能的同时改善外观，且患者满意度高，值得临床推广。 Abstract:Objective To investigate the clinical effects of expanded flaps in reconstructing scar contracture deformities in the face and neck after extensive burns. Methods A retrospective observational study was conducted. From May 2016 to September 2022, 17 patients with scar contracture deformities in the face and neck after extensive burns were admitted to Tongren Hospital of Wuhan University ＆ Wuhan Third Hospital, including 13 males and 4 females, aged 23 to 55 years, with 3 patients having degree Ⅱ cervical contracture, 14 patients having degree Ⅲ cervical contracture, and 12 patients having facial scar contracture deformity. In the first stage, 34 rectangular skin and soft tissue expanders (hereinafter referred to as expanders) with rated capacity of 100-600 mL were inserted into the face, chest, shoulder, and abdomen, and then the normal saline was injected for expansion. In the second stage, the scar tissue was removed and the contracture was released to correct the deformity. Two expanded facial flaps were transplanted in local fashion, 17 expanded flaps were transplanted in pedicled fashion, and 15 expanded flaps were freely transplanted to repair the secondary wounds after release, with artery pressurization was performed in 7 flaps. Indocyanine green fluorescence imaging was used to evaluate the arterial blood perfusion and venous return of the flaps during transplantation. The incision area of 32 flaps except 2 facial flaps was 10 cm×8 cm-36 cm×16 cm. The wounds of 31 flap donor sites were closed by direct suture, and the wound of 1 flap donor site was repaired by autologous split-thickness scalp transplantation. The skin condition of inserted place, expansion time, and total amount of normal saline injection of expanders, complications of skin and soft tissue expansion surgery, and survival of flap after the second stage surgery were observed and recorded. The long-term face and neck reconstruction effect and recovery of flap donor area were followed up. At the last follow-up, the 5-level Likert scale was used to evaluate the efficacy satisfaction of patients. Results Of the 34 expander inserted places in 17 patients, 22 places were superficial scar skin after deep partial-thickness burns, 8 places were superficial scar skin after multiple skin donations, and 4 places were normal skin. After 4 to 15 months of expansion, the total normal saline injection volume was 238 to 2 000 mL, with no complications occurred. After the second stage surgery, the distal part of 2 pedicled flaps was partially necrotic, and the necrotic wounds were healed after flap dressing and free transplantation of contralateral expanded triangular flaps, respectively; the other flaps survived completely. During 6 to 18 months of follow-up, except for 2 expanded paraumbilical flaps and 1 expanded groin flap, which were bloated and improved by flap thinning, the appearance and texture of the other flaps were good, and all the flap donor sites recovered well. At the last follow-up, the face and neck scar contracture deformities were significantly improved in all patients, and the satisfaction of curative effect of patient was very satisfactory in 8 patients and relatively satisfactory in 9 patients. Conclusions The expanded flaps of chest, abdomen, and other parts, combined with local advance, pedicled, and free transplantation, can effectively reconstruct scar contracture deformities in the face and neck after extensive burns, restore the function of operative area and improve the appearance simultaneously, with high degree of patient satisfaction, which is worthy of promotion in clinic. -
Key words:
- Burns /
- Cicatrix /
- Neck /
- Contracture /
- Dilatation /
- Perforator flap /
- Microsurgery
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(1)证实人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（hUCMSC-sEV）对皮肤创面愈合相关的3种细胞的水平和垂直迁移以及增殖均有促进作用。
(2)证实所构建的负载hUCMSC-sEV的甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶能够延长hUCMSC-sEV作用于小鼠全层皮肤缺损创面的时间，从而促进创面愈合。
Highlights:
(1)It was confirmed that the small extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs-sEVs) had promoting effects on horizontal and vertical migration and proliferation of three types of cells related to skin wound healing.
(2)It was confirmed that the constructed gelatin methacrylate anhydride hydrogel loaded with hUCMSCs-sEVs could prolong the time of treatment with hUCMSCs-sEVs on the full-thickness skin defect wounds in mice, thereby promoting wound healing.
临床上对创面的治疗方法通常为换药、负压吸引及手术治疗 ［ 1］ ，随着患者对创面修复要求的提高，现有的治疗方法逐渐无法满足临床需求。既往研究表明，KC和Fb是皮肤创面愈合中的关键细胞 ［ 2, 3］ 。如何增强皮肤细胞的活性，增强其再生功能，进而促进创面愈合，是目前创面修复领域的研究热点。随着再生医学的发展，干细胞疗法为创面的修复和再生性愈合带来了新的思路 ［ 4, 5］ 。
间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一种多能干细胞，近期研究显示，MSC主要依靠旁分泌产生的细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）发挥效应，小EV（small extracellular vesicle，sEV）是直径<200 nm的EV ［ 6］ 。研究表明人MSC来源的sEV可以作用于靶细胞，发挥促进组织修复的作用 ［ 7, 8］ 。但直接外用或浅表注射至创面的sEV在创面的有效存留时间较短，无法达到预期疗效，且提高其剂量并不能显著改善上述情况 ［ 9］ 。因此，如何延长sEV在创面的存留时间，使其更好地发挥疗效是目前亟须解决的问题。
水凝胶是一种有良好生物相容性的材料。甲基丙烯酸酐化明胶（gelatin methacrylate anhydride，GelMA）水凝胶含有的多肽序列有利于细胞及组织黏附 ［ 10］ ，且可滴加GelMA溶液至创面部位，使其在紫外光照射下原位成胶 ［ 11］ 。
本研究着眼于人脐带MSC（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUCMSC）来源的sEV（small extracellular vesicle derived from human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUCMSC-sEV）对创面的全层修复，详尽表征了其对创面愈合的重要细胞：人表皮KC（human epidermal keratinocyte，HEK）、人真皮Fb（human dermal fibroblast，HDF）及人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的作用，并进一步开发了一种负载hUCMSC-sEV的GelMA（以下简称hUCMSC-sEV/GelMA）水凝胶，探究该水凝胶能否改善伤处皮肤细胞的功能从而促进皮肤创面愈合，以期为临床全层皮肤缺损创面治疗提供新思路。
1. 材料与方法
本实验研究遵循解放军总医院实验动物伦理审查委员会和国家有关实验动物管理使用的规定。
1.1 动物、细胞及主要试剂与仪器来源
24只健康清洁级6周龄体重23~25 g雄性C57BL/6J小鼠购自北京科宇动物养殖中心，许可证号：SCXK（京）2018-0010。HUVEC细胞系、原代hUCMSC、原代HEK、原代HDF购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
DMEM培养基、EpiLife培养基、人KC生长添加剂、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液购自美国Gibco公司，无EV血清购自美国SBI公司，小鼠抗人CD63、CD9、肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）及钙联蛋白单克隆抗体购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，BeyoClick™ 5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）-488细胞增殖检测试剂盒及结晶紫染色液购自上海碧云天生物技术有限公司，Transwell培养板购自美国Corning公司，GelMA购自苏州永沁泉智能设备有限公司。311型二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher公司，GelDoc XR+凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司，CKX53型倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司，DMI1型倒置相差显微镜、TCS SPE型激光扫描共聚焦显微镜购自德国Leica公司，LVEM 25E型透射电子显微镜购自加拿大 Delong Instrument公司，Sigma 300型扫描电子显微镜购自德国ZEISS公司。
1.2 细胞培养
用含有体积分数10%的无sEV血清和常规浓度的青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基培养hUCMSC，用含有体积分数1%的人KC生长添加剂与常规浓度的青霉素-链霉素溶液的EpiLife完全培养基培养HEK，用含有体积分数10%的胎牛血清和常规浓度的青霉素-链霉素溶液的DMEM完全培养基培养HDF与HUVEC。将细胞置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中培养，每2天更换1次培养液。于细胞生长至70%融合时进行传代。
1.3 hUCMSC-sEV的提取与鉴定
取第3~5代hUCMSC培养48 h至80%融合时，收集上清液，采用超速离心法提取hUCMSC-sEV。用无菌PBS重新悬浮沉淀后于-80 ℃冻存。取适量hUCMSC-sEV于透射电子显微镜100 000倍放大倍数下观察形态。取第5代hUCMSC及提取的hUCMSC-sEV，采用蛋白质印迹法检测CD9、CD63、TSG101及钙联蛋白的表达，其中一抗为小鼠抗人CD9、CD63、TSG101及钙联蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体（稀释比为1∶5 000），增强化学发光法显影，采用凝胶成像分析系统获取条带。
1.4 细胞迁移情况
1.4.1 细胞划痕试验
取HUVEC、第3代HEK和HDF，按每孔5×10 6个接种于6孔板中，将细胞分为空白对照组与hUCMSC-sEV组，空白对照组细胞加入2 mL 1.2中的相应完全培养基培养，hUCMSC-sEV组细胞加入2 mL含100 μg/mL hUCMSC-sEV的相应完全培养基培养。待细胞生长至90%融合时用容积为1 mL移液器吸头竖直向下沿孔直径划一条直线，PBS清洗3次后加入前述培养基继续培养。于划痕后0（即刻）、6、12、24 h，于倒置相差显微镜50倍放大倍数下观察划痕情况并拍照，采用Image J 2.1.0图像分析软件（美国国立卫生研究院）测量不同时间点的划痕面积并计算划痕后6、12、24 h的细胞迁移率，细胞迁移率=（划痕后0 h划痕面积-划痕后6、12、24 h划痕面积）÷划痕后0 h划痕面积×100%。该实验样本数为3。
1.4.2 细胞Transwell试验
取HUVEC、第4代HEK和HDF，同1.4.1分组后用相应完全培养基悬浮细胞，调整细胞浓度为4×10 7个/mL，取125 μL细胞悬液加入Transwell培养板上室中。向各Transwell培养板下室中加入与其上室细胞培养基相同的培养基600 μL。培养12 h后进行结晶紫染色（阳性染色为紫色），于倒置相差显微镜40倍放大倍数下观察细胞迁移情况，每组取3个视野，统计迁移至下室的细胞数。该实验样本数为3。
1.5 细胞增殖情况
取HUVEC、第4代HEK和HDF，同1.4.1分组后将2组细胞均按每孔1×10 4个接种于24孔板中，同1.4.1培养24 h后采用EdU-488细胞增殖检测试剂盒行EdU、Hoechst染色。封片后，于倒置荧光显微镜200倍放大倍数下观察、拍照，细胞EdU染色阳性为绿色，细胞核Hoechst 33342染色阳性为蓝色，并计算增殖细胞比例。增殖细胞比例=（EdU染色阳性细胞数÷细胞核数）×100%。该实验样本数为3。
1.6 GelMA水凝胶的制备与表征
1.6.1 GelMA水凝胶的形貌
称取适量GelMA固体溶解于含2.5 g/L光引发剂的PBS中，分别添加PBS或200 μg/mL的hUCMSC-sEV悬液，制成终质量分数15%的GelMA（以下简称单纯GelMA）溶液及含终质量分数15% GelMA和终质量浓度0.2 g/L hUCMSC-sEV的hUCMSC-sEV/GelMA溶液，用波长405 nm的紫外光照射30 s制成水凝胶（光照处理下同）。
将2种GelMA水凝胶样本经真空冻干12 h，从样本中间切开，暴露水凝胶内部表面，真空喷金后分别在扫描电子显微镜500、1 000倍放大倍数下观察水凝胶的微观形貌，并采集图像。
1.6.2 hUCMSC-sEV在hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶中的分布
将200 μg/mL的hUCMSC-sEV悬液（1 mL）与1 μmol/L的1，1'-二十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基氨基氰高氯酸盐染液（0.1 mL）在37 ℃下避光共孵育3 h得到红色荧光染色的hUCMSC-sEV。按照1.6.1中方法制备单纯GelMA水凝胶及hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶，其中hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶使用荧光染色的hUCMSC-sEV制备，于激光扫描共聚焦显微镜400倍放大倍数下观察2种水凝胶中hUCMSC-sEV的分布情况。
1.6.3 hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶中hUCMSC-sEV的释放
同1.6.1分别制备3份100 μL的hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶及单纯GelMA水凝胶样本，并放入48孔板中，每孔加入200 μL PBS。每2天吸出上清液，另加入200 μL PBS。分别于浸泡0（即刻）、2、4、6、8、10、12 d通过蛋白比色定量法测定释放到上清液中的hUCMSC-sEV蛋白量，进而计算hUCMSC-sEV的累积释放率，各时间点hUCMSC-sEV累积释放率=浸泡各时间点内hUCMSC-sEV的蛋白释放总量÷加入的hUCMSC-sEV蛋白总量×100%。该实验样本数为3。
1.7 动物实验
1.7.1 创面模型建立与分组处理
将24只小鼠常规麻醉备皮，按随机数字表法分为PBS组、单纯hUCMSC-sEV组、单纯GelMA水凝胶组及hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组，每组6只，并使用打孔器在每只小鼠背部造1个直径为12 mm的全层皮肤缺损创面。伤后即刻采用微量注射器在PBS组小鼠创缘周围3、6、9、12点方向均匀注射PBS（共100 μL），对单纯hUCMSC-sEV组小鼠采用同样方式注射200 μg/mL的hUCMSC-sEV悬液（100 μL），对单纯GelMA水凝胶组小鼠在其创面表面滴加100 μL单纯GelMA溶液后行光照处理，对hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠在其创面表面滴加100 μL hUCMSC-sEV/GelMA溶液后行光照处理。
1.7.2 创面愈合情况
于伤后0（即刻）、4、8、12 d观察所有小鼠创面愈合情况并拍照，采用Image J 2.1.0图像分析软件测量创面面积并计算伤后4、8、12 d的创面愈合率，创面愈合率=（伤后0 d创面面积-伤后4、8、12 d创面面积）÷伤后0 d创面面积×100%。
1.7.3 创面组织病理学情况
伤后12 d，于观察创面愈合情况后每组取6只小鼠麻醉后断颈处死并取背部创面及距创缘0.5 cm内的皮肤组织常规制作切片后行HE染色，于倒置相差显微镜20倍放大倍数下观察创面新生组织结构。
1.8 统计学处理
采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 hUCMSC-sEV的鉴定
提取的hUCMSC-sEV呈杯状结构；hUCMSC-sEV表达CD9、CD63和TSG101，几乎不表达钙联蛋白。hUCMSC不表达CD9、CD63和TSG101，表达钙联蛋白。综上，hUCMSC-sEV鉴定成功。见 图1。
2.2 细胞迁移情况
2.2.1 细胞划痕试验
划痕后6、12、24 h，hUCMSC-sEV组HEK、HDF、HUVEC的迁移率均明显高于空白对照组（ P<0.05）。见 图2、 表1。
注：HEK为人表皮角质形成细胞，HDF为人真皮成纤维细胞，HUVEC为人脐静脉内皮细胞，hUCMSC-sEV为人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡；空白对照组细胞仅常规培养，hUCMSC-sEV组细胞培养液中另加入hUCMSC-sEV表1 2组HEK、HDF、HUVEC划痕后各时间点迁移率比较（%，组别 样本数 HEK HDF HUVEC 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 空白对照组 3 0.9 14.0 58.1 9.3 19.5 47.8 7.2 10.1 39.1 hUCMSC-sEV组 3 51.4 88.2 95.7 19.8 35.4 62.2 15.1 38.9 56.7 t值 25.94 20.98 20.04 3.18 5.68 4.28 4.32 19.33 4.00 P值 <0.001 <0.001 <0.001 0.033 0.004 0.013 0.012 <0.001 0.016 注：HEK为人表皮角质形成细胞，HDF为人真皮成纤维细胞，HUVEC为人脐静脉内皮细胞，hUCMSC-sEV为人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡；空白对照组细胞仅常规培养，hUCMSC-sEV组细胞培养液中另加入hUCMSC-sEV；HEK、HDF、HUVEC处理因素主效应， F值分别为1 387.01、40.65、66.89， P值分别为<0.001、0.003、0.001；时间因素主效应， F值分别为381.30、209.70、200.13， P值均<0.001；两者交互作用， F值分别为51.20、0.93、5.90， P值分别为<0.001、0.430、0.027 2.2.2 细胞Transwell试验
培养12 h，hUCMSC-sEV组HEK、HDF及HUVEC迁移数量分别为（550±23）、（235
注：HEK为人表皮角质形成细胞，HDF为人真皮成纤维细胞，HUVEC为人脐静脉内皮细胞，hUCMSC-sEV为人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡；空白对照组细胞仅常规培养，hUCMSC-sEV组细胞培养液中另加入hUCMSC-sEV；细胞结晶紫阳性染色为紫色2.3 细胞增殖情况
培养24 h，hUCMSC-sEV组HEK、HDF及HUVEC增殖细胞比例分别为（48.7
注：HEK为人表皮角质形成细胞，HDF为人真皮成纤维细胞，HUVEC为人脐静脉内皮细胞，hUCMSC-sEV为人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡，EdU为5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷；空白对照组细胞仅常规培养，hUCMSC-sEV组细胞培养液中另加入hUCMSC-sEV；各图中右上小图为EdU阳性染色（绿色）图，右下小图为Hoechst 33342阳性染色（蓝色）图，各图中左侧大图为右侧2张小图的叠加图像，绿色+蓝色双荧光染色的细胞为增殖细胞2.4 GelMA水凝胶的表征
2.4.1 GelMA水凝胶的形貌
2种GelMA水凝胶内部呈疏松多孔的海绵状结构，凝胶成分均匀光滑。其中在放大后的hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶微观结构图像中可见负载在水凝胶中的hUCMSC-sEV，这些sEV呈团块状分散在水凝胶的孔隙和骨架中。见 图5。
2.4.2 hUCMSC-sEV在hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶中的分布
单纯GelMA水凝胶中未见hUCMSC-sEV，hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶中可见hUCMSC-sEV均匀分布。见 图6。
2.4.3 hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶中hUCMSC-sEV的释放
hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶浸泡2 d后hUCMSC-sEV累积释放率曲线趋于平缓，浸泡12 d时hUCMSC-sEV累积释放率为（59.2
2.5 hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响
2.5.1 创面愈合情况
伤后0~12 d，4组小鼠创面均未见明显感染迹象，且随时间延长，创面均不断缩小。伤后12 d，hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠创面已完全愈合，其余3组小鼠均可见残余创面。伤后4、8、12 d，hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠创面愈合率均明显高于其余3组（ P<0.05），单纯GelMA水凝胶组、单纯hUCMSC-sEV组小鼠创面愈合率均明显高于PBS组（ P<0.05）；伤后8、12 d，单纯hUCMSC-sEV组创面愈合率均明显高于单纯GelMA水凝胶组（ P<0.05）。见 图8、 表2。
注：PBS为磷酸盐缓冲液，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶，hUCMSC-sEV为人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡；对PBS组、单纯hUCMSC-sEV组、单纯GelMA水凝胶组和hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠创面分别行PBS注射、hUCMSC-sEV悬液注射、单纯GelMA水凝胶覆盖、hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶覆盖；直尺刻度为1 mm表2 4组小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合率比较（%，组别 样本量 4 d 8 d 12 d PBS组 6 58.3±1.3 63.7±0.4 77.8±1.3 单纯GelMA水凝胶组 6 65.4±4.4 69.2±1.8 92.8±0.5 单纯hUCMSC-sEV组 6 67.8±0.9 75.7±0.4 97.2±0.6 负载hUCMSC-sEV的GelMA水凝胶组 6 80.2±2.6 97.9±0.6 100 F值 70.00 1 332.52 1 001.81 P值 <0.001 <0.001 <0.001 P 1值 <0.001 <0.001 <0.001 P 2值 <0.001 <0.001 <0.001 P 3值 <0.001 <0.001 <0.001 P 4值 0.076 <0.001 <0.001 P 5值 <0.001 <0.001 <0.001 P 6值 <0.001 <0.001 0.031 注：PBS为磷酸盐缓冲液，GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶，hUCMSC-sEV为人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡；对PBS组、单纯GelMA水凝胶组、单纯hUCMSC-sEV组和hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠创面分别行PBS注射、单纯GelMA水凝胶覆盖、hUCMSC-sEV悬液注射、hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶覆盖；处理因素主效应， F=461.49， P=0.001；时间因素主效应， F=1 714.92， P<0.001；两者交互作用， F=76.83， P=0.001； P 1值、 P 2值、 P 3值分别为单纯GelMA水凝胶组、单纯hUCMSC-sEV组、hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组与PBS组各时间点比较所得； P 4值、 P 5值分别为单纯hUCMSC-sEV组、hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组与单纯GelMA水凝胶组各时间点比较所得； P 6值为单纯hUCMSC-sEV组与hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组各时间点比较所得 2.5.2 创面组织病理学情况
伤后12 d，hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠创面上皮化程度最佳，真皮胶原排列松散有序，未见明显炎症细胞浸润；其余3组小鼠创面可见真皮胶原排列致密且存在不同程度的炎症细胞浸润。
3. 讨论
创面愈合是一个复杂的过程，局部感染、氧化应激、炎症反应和血管生成受损是导致创面愈合困难的因素 ［ 12］ 。MSC是目前再生医学研究的焦点之一，常被用于修复包括皮肤创面在内的各种类型的组织损伤 ［ 13, 14］ ，其旁分泌产生的纳米级囊泡被认为是其发挥修复功能的关键。
为探究hUCMSC-sEV对创面的全层修复效果，本研究通过对提取物形貌以及表面标志物进行测定后证实成功提取hUCMSC-sEV并进行体外实验，详尽探究了其对于HDF、HUVEC以及HEK的迁移与增殖的作用，结果显示hUCMSC-sEV在细胞水平和垂直迁移以及增殖方面均显示出了促进作用，与以往相关文献中MSC来源的sEV能够加速创面愈合的结论 ［ 15, 16, 17, 18］ 一致。然而，单纯的sEV难以在需修复的组织中持续缓慢释放，因此其促进创面愈合的作用在一定程度上受到限制。
水凝胶作为一种传统的生物材料，常作为封闭创面的普通敷料或作为支架材料被用于组织工程研究。本研究中制备的hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶可均匀负载hUCMSC-sEV并使其缓慢释放。研究表明，sEV的抗氧化能力随浓度的升高而提高，当sEV浓度达到100 μg/mL时，抗氧化效率约为50% ［ 19］ 。在本实验中，课题组测得在浸泡12 d时hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶中的hUCMSC-sEV累积释放率约为60%。为了保证创面处sEV浓度能够达到促进创面修复以及抗氧化的作用，本研究选择在水凝胶溶液中加入200 μg/mL的hUCMSC-sEV。
单纯GelMA水凝胶组与hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠创面愈合过程中炎症反应不明显，这是由于具有良好组织相容性的GelMA水凝胶能够覆盖并保护创面，减轻炎症程度。但单纯的GelMA水凝胶缺乏生物活性，故而单纯GelMA水凝胶组小鼠创面愈合速度慢于hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组和单纯hUCMSC-sEV组。hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠创面愈合速度最快，这进一步证明了水凝胶良好的生物相容性以及在水凝胶中载入sEV可以增强sEV的稳定性，并有助于sEV在所需部位的持续释放。
组织病理学结果显示，在伤后12 d，单纯GelMA水凝胶组和单纯hUCMSC-sEV组小鼠创面处仍有少量炎症细胞浸润，而hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶组小鼠创面处未见明显炎症细胞浸润。这表明在创伤初期，hUCMSC-sEV可以在一定程度上抑制创面炎症，但随着创面处免疫系统的激活以及小鼠的活动，单纯的hUCMSC-sEV很快被分解、失活，而hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶在小鼠创面上牢固附着、保护创面、缓释hUCMSC-sEV，最终起到持续抗炎、促进创面快速愈合的作用。
将水凝胶作为载体促进组织修复是近年来的研究热点。近期研究显示hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶可有效改善皮肤激光损伤小鼠的早期炎症反应，从而促进创面愈合，但该研究并未分析hUCMSC-sEV对皮肤创面愈合相关细胞的影响 ［ 20］ 。目前国内外对于负载sEV的GelMA水凝胶的研究大多仅关注sEV对皮肤或血管的某种细胞的作用。本研究团队拟在后续的研究中进一步完善hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶对糖尿病或大面积烧伤创面的作用及其机制的相关研究，完善Masson染色、免疫组织化学染色等实验结果。
综上，本研究成功构建了hUCMSC-sEV/GelMA水凝胶，以GelMA水凝胶作为支架，在创面处缓慢释放hUCMSC-sEV，延长了hUCMSC-sEV作用于创面的时间，促进了创面愈合相关的3种细胞的增殖与迁移，从而促进全层皮肤缺损创面愈合。本研究结果为皮肤创面的临床治疗提供了一定的理论依据，为进一步采用新型生物材料治疗临床创面提供了新思路。
张伟：手术操作、数据整理、论文撰写、论文修改、经费支持；张卫东、陈斓、栾夏刚、杨飞、李泽、刘峰：手术操作、数据整理、论文修改；王德运：手术操作、论文修改、研究指导、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 扩张腹股沟皮瓣联合扩张面部皮瓣移植整复例1患者火焰烧伤后面颈部瘢痕挛缩畸形。1A.烧伤后2个月，可见前胸有片状肉芽组织，下腹部供区创面已愈合；1B.双侧面部皮肤软组织扩张器（以下简称扩张器）置入后9个月，Ⅱ期行右侧面部皮瓣移植术前；1C、1D.分别为扩张面部皮瓣局部转移术后15个月，面颈部正位、左侧位观；1E、1F.分别为双侧下腹部扩张器置入术后12个月，腹部扩张器左侧位、正位观；1G.左侧扩张腹股沟皮瓣切取完成后即刻；1H.左侧扩张腹股沟皮瓣移植于右侧下颌部+颈部后，吲哚菁绿荧光显影显示皮瓣蒂部远端血流灌注良好；1I.左侧扩张腹股沟皮瓣移植修复右侧下颌部+颈部瘢痕切除松解后创面术后3个月，口角歪斜和下唇外翻均得到明显矫正；1J.右侧扩张腹股沟皮瓣移植于左侧下颌部+颈部瘢痕切除松解后创面即刻，吲哚菁绿荧光显影显示皮瓣蒂部远端血流灌注良好；1K、1L.分别为末次皮瓣移植术后7个月面颈部右、左侧面观，瘢痕挛缩畸形明显改善
2 右侧扩张脐旁皮瓣游离移植整复例2患者火焰烧伤后颈部瘢痕挛缩畸形。2A.右侧脐旁皮肤软组织扩张器注水扩张完成，扩张瘢痕皮肤未见破溃；2B、2C.分别为Ⅱ期术前颈前瘢痕切除范围设计和颈部瘢痕挛缩松解术后即刻；2D.Ⅱ期术中，切取扩张脐旁皮瓣，皮瓣携带3条腹壁下动脉穿支；2E.Ⅱ期术后2周，皮瓣完全成活；2F.Ⅱ期术后随访10个月，颈部畸形明显改善，颏颈角存在
3 左侧扩张胸三角皮瓣带蒂移植联合左侧扩张腹股沟皮瓣游离移植整复例3患者火焰烧伤后面颈部瘢痕挛缩畸形。3A.胸部皮肤软组织扩张器置入10个月，颈部后仰受限；3B.Ⅱ期术前，设计切取以颈横动脉锁骨上穿支为蒂的扩张胸三角皮瓣，面积为23 cm×10 cm；3C.扩张胸三角皮瓣切取完毕，吲哚菁绿荧光显影显示，蒂部远端（红色箭头）动脉灌注良好；3D.Ⅱ期术前，下腹部扩张11个月，设计左侧扩张腹股沟皮瓣，面积为21 cm×11 cm；3E.左侧扩张腹股沟皮瓣断蒂后即刻；3F.左侧扩张腹股沟皮瓣游离移植于下唇和颈颏部瘢痕切除松解后创面即刻；3G.扩张腹股沟皮瓣移植于面颈部，吻合血管完毕，吲哚菁绿荧光显影显示，蒂部远端（红色箭头）血运丰富；3H.末次扩张皮瓣移植术后随访6个月，唇外翻得到矫正，面颈部外观良好
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