二甲双胍对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及纤维化蛋白表达的影响及其机制

谢文博; 胡晓龙; 魏双; 石继红

doi:10.3760/cma.j.cn501225-20231220-00259

二甲双胍对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及纤维化蛋白表达的影响及其机制

doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20231220-00259

1.
南昌大学江西医学院临床医学系,南昌　　330006
2.
空军军医大学第一附属医院烧伤与皮肤外科,全军烧伤中心,西安　　710032

基金项目:

国家自然科学基金面上项目 82172209

详细信息

通讯作者:
石继红,Email：biojhshi@126.com

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出版历程
- 收稿日期: 2023-12-20

Effects and mechanism of metformin on the proliferation and expression of fibrotic proteins of human hypertrophic scar fibroblasts

1.
Clinical Medicine Department of Jiangxi Medical College, Nanchang University, Nanchang 330006, China
2.
Department of Burns and Cutaneous Surgery, Burn Center of PLA, the First Affiliated Hospital of Air Force Medical University, Xi'an 710032, China

Funds:

General Program of National Natural Science Foundation of China 82172209

More Information

Corresponding author: Shi Jihong, Email: biojhshi@126.com

摘要

摘要: 目的探讨二甲双胍对人增生性瘢痕（HS）成纤维细胞（Fb）增殖及纤维化蛋白表达的影响及其机制。方法该研究为实验研究。收集2021年6月—2022年6月于空军军医大学第一附属医院烧伤与皮肤外科行HS切除术的5例HS患者（男3例、女2例,年龄21~36岁）的HS组织,分离、培养Fb并取第5~7代Fb进行实验。取Fb,分别在其培养基中加入磷酸盐缓冲液（PBS）或终物质的量浓度为5、10、20、40 mmol/L的二甲双胍培养,培养48 h,采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞增殖活性并计算细胞增殖抑制率,采用羟脯氨酸测定试剂盒检测细胞培养上清液中羟脯氨酸含量,采用蛋白质印迹法检测细胞中蛋白激酶B（Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的磷酸化水平并计算磷酸化Akt（p-Akt）与Akt比值、磷酸化mTOR（p-mTOR）与mTOR比值；培养24 h,采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的mRNA表达。另取Fb分为对照组（常规培养）和LY294002组、二甲双胍组、LY294002+二甲双胍组,后3组细胞培养基中分别加入LY294002、二甲双胍、LY294002+二甲双胍培养,LY294002与二甲双胍的终物质的量浓度分别为20 μmol/L、10 mmol/L,于培养0（即刻）、24、48 h采用CCK-8检测细胞增殖活性,培养48 h采用蛋白质印迹法检测细胞中Akt、mTOR的磷酸化水平并计算p-Akt与Akt比值、p-mTOR与mTOR比值。细胞增殖抑制率实验样本数为4,其余实验样本数为3。结果培养48 h,与经PBS处理比较,经5、10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞的增殖抑制率均显著升高（t值分别为10.69、14.20、19.73、52.54,P<0.05）,经10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞培养上清液中羟脯氨酸含量均显著降低（t值分别为8.06、7.86、10.25,P<0.05）,经10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞中p-Akt与Akt比值及经20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞中p-mTOR与mTOR比值均显著降低（t值分别为2.82、4.28、9.88及5.66、9.08,P<0.05）；培养24 h,与经PBS处理比较,经5、10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞中Ⅰ型胶原及α-SMA的mRNA表达及经10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞中Ⅲ型胶原的mRNA表达均显著降低（t值分别为4.35、8.53、9.57、14.77与4.14、5.58、7.89、9.37及5.18、6.85、9.15,P<0.05）。培养24、48 h,LY294002组（t值分别为6.30、13.60）、二甲双胍组（t值分别为6.47、10.69）细胞增殖活性均较对照组显著下降（P<0.05）。培养48 h,LY294002组、二甲双胍组细胞中p-Akt与Akt比值分别为0.554±0.027、0.681±0.029,均显著低于对照组的1.053±0.193（t值分别为4.45、3.31,P<0.05）；LY294002+二甲双胍组细胞中p-Akt与Akt比值为0.387±0.023,显著低于二甲双胍组（t=5.95,P<0.05）。培养48 h,LY294002组细胞中p-mTOR与mTOR比值显著低于对照组（t=4.01,P<0.05）,LY294002+二甲双胍组细胞中p-mTOR与mTOR比值显著低于二甲双胍组（t=6.05,P<0.05）。结论二甲双胍可以通过磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/mTOR信号通路抑制人HS中Fb增殖及Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA等纤维化蛋白的表达。
- 二甲双胍 /
- 瘢痕 /
- 成纤维细胞 /
- 细胞增殖 /
- 胶原Ⅰ型 /
- 胶原Ⅲ型 /
- 增生性瘢痕 /
- 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路
Abstract: Objective To investigate the effects and mechanism of metformin on the proliferation and expression of fibrotic proteins of human hypertrophic scar (HS) fibroblasts (Fbs). Methods The study was an experimental study. From June 2021 to June 2022, 5 patients with HS were admitted to the Department of Burns and Cutaneous Surgery of the First Affiliated Hospital of Air Force Medical University, including 3 males and 2 females, aged from 21 to 36 years. HS tissue was collected, Fbs were isolated and cultured, and Fbs of passage 5 to 7 were used for experiment. Fbs were taken and cultured in their respective media supplemented with phosphate buffered solution (PBS) or metformin at final molarities of 5, 10, 20, and 40 mmol/L for 48 hours. The cell proliferation activity was detected using the cell counting kit-8 (CCK-8), and the proliferation inhibition rate of cells was calculated. The content of hydroxyproline in the cell culture supernatant was measured using a hydroxyproline assay kit. The phosphorylation levels of protein kinase B (Akt) and mammalian target of rapamycin (mTOR) in the cells were detected by Western blotting, and the ratios of phosphorylated Akt (p-Akt) to Akt and phosphorylated mTOR (p-mTOR) to mTOR were calculated. After 24 hours of culture, the mRNA expressions of type Ⅰ collagen, type Ⅲ collagen, and α-smooth muscle actin (α-SMA) in the cells were detected by real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. Another batch of Fbs were divided into control group (with conventional culture), LY294002 group, metformin group, and LY294002+metformin group. LY294002, metformin, and LY294002+metformin were added to the culture media of the last three groups, respectively, with the final molarities of LY294002 and metformin being 20 μmol/L and 10 mmol/L, respectively. CCK-8 was used to detect the cell proliferation activity at 0 (immediately), 24, and 48 hours of culture. After 48 hours of culture, Western blotting was used to detect the phosphorylation levels of Akt and mTOR in the cells, and the ratios of p-Akt to Akt and p-mTOR to mTOR were calculated. The sample size for the cell proliferation inhibition rate experiment was 4, and the sample size for the other experiments was 3. Results After 48 hours of culture, compared with the cells treated with PBS, the proliferation inhibition rates of the cells treated with 5, 10, 20, and 40 mmol/L metformin were significantly increased (with t values of 10.69, 14.20, 19.73, and 52.54, respectively, P<0.05), the content of hydroxyproline in the culture supernatants of the cells treated with 10, 20, and 40 mmol/L metformin was significantly decreased (with t values of 8.06, 7.86, and 10.25, respectively, P<0.05), and the ratios of p-Akt to Akt in the cells treated with 10, 20, and 40 mmol/L metformin and the ratios of p-mTOR to mTOR in the cells treated with 20 and 40 mmol/L metformin were significantly decreased (with t values of 2.82, 4.28, 9.88, 5.66, and 9.08, respectively, P<0.05). After 24 hours of culture, compared with those treated with PBS, the mRNA expressions of type Ⅰ collagen and α-SMA in the cells treated with 5, 10, 20, and 40 mmol/L metformin and the mRNA expressions of type Ⅲ collagen in the cells treated with 10, 20, and 40 mmol/L metformin were significantly decreased (with t values of 4.35, 8.53, 9.57, 14.77, 4.14, 5.58, 7.89, 9.37, 5.18, 6.85, and 9.15, respectively, P<0.05). At 24 and 48 hours of culture, the proliferation activities of the cells in LY294002 group (with t values of 6.30 and 13.60, respectively) and metformin group (with t values of 6.47 and 10.69, respectively) were significantly lower than those in control group (P<0.05). After 48 hours of culture, the ratios of p-Akt to Akt in the cells of LY294002 group and metformin group were 0.554±0.027 and 0.681±0.029, respectively, which were significantly lower than 1.053±0.193 in control group (with t values of 4.45 and 3.31, respectively, P<0.05). The ratio of p-Akt to Akt in the cells of LY294002+metformin group was 0.387±0.023, which was significantly lower than that in metformin group (t=5.95, P<0.05). After 48 hours of culture, the ratio of p-mTOR to mTOR in the cells of LY294002 group was significantly lower than that in control group (t=4.01, P<0.05), and the ratio of p-mTOR to mTOR in the cells of LY294002+metformin group was significantly lower than that in metformin group (t=6.05, P<0.05). Conclusions Metformin can inhibit the proliferation and expression of fibrotic proteins type Ⅰ collagen, type Ⅲ collagen, and α-SMA of human HS Fbs through phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mTOR signaling pathway.
- Metformin /
- Cicatrix /
- Fibroblasts /
- Cell proliferation /
- Collagen type Ⅰ /
- Collagen type Ⅲ /
- Hypertrophic scar /
- Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin signaling pathway
谢文博：酝酿和设计实验、撰写论文；胡晓龙：分析、解释数据,修改论文,技术支持,统计分析；魏双：采集数据、整理数据；石继红：总体审阅、经费支持

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(1)通过研究二甲双胍对人增生性瘢痕成纤维细胞（Fb）的增殖及纤维化蛋白表达的影响,证实二甲双胍具有潜在的拮抗瘢痕纤维化功能。

(2)证实二甲双胍可抑制增生性瘢痕Fb中蛋白激酶B（Akt）的活性,经磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制增生性瘢痕Fb的增殖及纤维化蛋白的表达。

Highlights:

(1)The effects of metformin on the proliferation and expression of fibrotic proteins of human hypertrophic scar fibroblasts (Fbs) were examined, confirming that metformin had a potential function to antagonize scar fibrosis.

(2)It was confirmed that metformin could inhibit the activity of protein kinase B (Akt) in hypertrophic scar Fbs, and suppress the proliferation and expression of fibrotic proteins of hypertrophic scar Fbs through the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin signaling pathway.

增生性瘢痕（hypertrophic scar,HS）是在创伤愈合过程中形成的一种严重皮肤纤维化疾病^[1]。HS的临床特征包括局部增厚、表面红色凸起、硬度高、局部瘙痒和疼痛^[2],其Fb过度增殖、过多转化、ECM过度沉积^[3]。目前临床上有多种针对HS的治疗方案,但因HS发病机制尚不明确,治疗效果有限^{[4, 5]}。因此,阐明HS形成机制,探索新的HS靶向治疗药物极为重要。

二甲双胍（metformin）是临床上广泛应用的2型糖尿病经典治疗药物,能够抑制肝脏糖异生和增强骨骼肌葡萄糖摄取^{[6, 7]},还具有强大的抗炎、抗肿瘤功能^{[8, 9, 10]}。近期研究阐明,二甲双胍通过促进小鼠肌Fb失活和凋亡来减轻小鼠肝、肾纤维化^{[11, 12, 13, 14]},通过抑制TGF-β₁/Smad3信号通路减轻小鼠心脏纤维化^{[15, 16, 17]}。此外,二甲双胍还能够抑制TGF-β₁刺激的大鼠Fb和大鼠瘢痕疙瘩Fb的ECM表达^{[18, 19]},但鲜见将二甲双胍用于治疗HS的研究。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）信号通路广泛参与细胞增殖、代谢及分泌等过程^{[20, 21]}。该通路介导Fb中TGF-β₁诱导的α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达和肌Fb分化,在创面愈合过程中起重要作用^{[22, 23, 24]}。PI3K/Akt可以激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）,与HS中的炎症、血管生成和ECM沉积等病理特征密切相关^{[25, 26, 27]}。因此,PI3K/Akt通路是改善瘢痕增生的潜在靶点,但是目前尚鲜见有关二甲双胍与PI3K/Akt/mTOR信号通路在HS治疗中的作用的报道。该研究探讨二甲双胍对HS形成的影响及其相关机制,拟为HS的防治及药物筛选提供新的靶点。

1. 材料与方法

本实验研究经空军军医大学第一附属医院伦理委员会批准（批号：20213138）,所有患者或患者家属均签署研究知情同意书。

1.1 组织样本来源

HS组织取自5例于2021年6月─2022年6月在空军军医大学第一附属医院烧伤与皮肤外科接受HS切除术的21~36岁HS患者（男3例、女2例）,均为创面愈合3个月以上仍持续增生的瘢痕组织。HS位于左上肢者2例、右上肢者1例、右下肢者2例,HS外观发红、充血、质硬、高出皮肤表面2 mm以上、局部伴瘙痒或疼痛等不适症状。患者均无其他系统性疾病,术前均未接受任何药物注射、放射治疗或外科治疗,符合实验要求标准。

1.2 主要试剂与仪器来源

Akt活性抑制剂LY294002购自美国MedChemExpress公司,二甲双胍（1 mol/L）购自西安灏洋生物技术有限公司,DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和链霉素均购自美国Gibco公司,羟脯氨酸测定试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司,兔抗人β肌动蛋白多克隆抗体、兔抗人Akt多克隆抗体、兔抗人磷酸化Akt（phosphorylated protein kinase B,p-Akt）多克隆抗体、兔抗人mTOR多克隆抗体及兔抗人磷酸化mTOR（phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR）多克隆抗体购自英国Cell Signaling Technology公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体购于北京博奥森生物技术有限公司,蛋白浓度测定试剂盒、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）购自上海碧云天生物科技有限公司,RIPA细胞裂解液购自北京索莱宝生物科技有限公司,TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司,反转录试剂盒、扩增荧光染料试剂盒购自日本Takara公司。

Steri-Cycle 371型二氧化碳培养箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司,Evos FL Auto 2型荧光显微镜购自美国Invitrogen公司,Mini型蛋白电泳系统、ChemiDOC型凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司,Infinite M200 Pro型全波长多功能酶标仪购自瑞士TECAN公司。

1.3 细胞培养

将获取的HS组织块上的表皮层、脂肪层剪去,保留真皮层,将真皮层组织剪碎成直径约0.5 mm样本。将样本种植于底面积为25 cm²的培养瓶中,倒置6 h待样本贴附于瓶壁后,加入少量含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（双抗浓度下同）的DMEM培养基（以下简称完全培养基）,置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中培养（以下简称常规培养）,当培养基颜色变黄时更换培养基。接种的样本爬出细胞铺满培养瓶时,消化收集细胞并传代继续培养,并对培养出的Fb行细胞及分子生物学方法鉴定。取鉴定成功后培养的第5~7代HSFb进行后续实验。

1.4 二甲双胍对HSFb的影响

1.4.1 细胞增殖抑制率分析

取HSFb并将其浓度调整为1×10⁵个/mL,以每孔100 μL接种于96孔板中,用完全培养基常规培养至细胞生长达50%~60%融合时,常规进行同步化处理,分别在含体积分数2%胎牛血清及青霉素和链霉素的DMEM培养基中加入PBS或终物质的量浓度为5、10、20、40 mmol/L的二甲双胍培养。培养48 h,每孔加入20 μL CCK-8溶液,37 ℃继续孵育2 h,用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值,以此表示细胞增殖活性。计算细胞增殖抑制率,细胞增殖抑制率（%）=（1-二甲双胍或PBS处理后细胞吸光度值÷PBS处理后细胞吸光度值）×100%。本实验样本数为4。

1.4.2 细胞培养上清液中羟脯氨酸含量测定

取HSFb并将其浓度调整为5×10⁵个/mL,以每孔1 mL接种于6孔板中,同1.4.1进行同步化及加入PBS与二甲双胍处理。培养48 h,取经PBS或各种终物质的量浓度二甲双胍处理细胞培养上清液,常规绘制标准曲线、测定总蛋白含量、行酶消化法处理后,按照羟脯氨酸测定试剂盒说明书加入相应试剂,检测细胞培养上清液中羟脯氨酸含量。本实验样本数为3。

1.4.3 细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA的mRNA表达检测

取HSFb,同1.4.2调整细胞浓度、接种、同步化、加入PBS与二甲双胍处理。培养24 h,取经PBS或各种终物质的量浓度二甲双胍处理细胞,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR法检测细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA的mRNA表达。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。Ⅰ型胶原的上游引物为5'-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3',下游引物为5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3',产物大小为140 bp；Ⅲ型胶原的上游引物为5'-GGAGCTGGCTACTTCTCGC-3',下游引物为5'-GGGAACATCCTCCTTCAACAG-3',产物大小为78 bp；α-SMA的上游引物为5'-AAAAGACAGCTACGTGGGTGA-3',下游引物为5'-GCCATGTTCTATCGGGTACTTC-3',产物大小为76 bp；GAPDH的上游引物为5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3',下游引物为5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3',产物大小为197 bp。以GAPDH为内参照,基于Δ循环阈值对Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA的mRNA表达进行定量。本实验样本数为3。

1.4.4 细胞中Akt与mTOR的磷酸化水平检测

取HSFb,同1.4.2调整细胞浓度、接种、同步化、加入PBS与二甲双胍处理。培养48 h,取经PBS或各种终物质的量浓度二甲双胍处理细胞,提取细胞总蛋白,采用蛋白质印迹法检测细胞中Akt与mTOR的磷酸化水平。一抗为兔抗人β肌动蛋白多克隆抗体、兔抗人Akt多克隆抗体、兔抗人p-Akt多克隆抗体、兔抗人mTOR多克隆抗体及兔抗人p-mTOR多克隆抗体（稀释比均为1∶1 000）,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（稀释比为1∶3 000）。增强化学发光显影后用凝胶成像系统获取图像,采用ImageJ图像分析系统（美国国立卫生研究院）测定各蛋白条带灰度值,以β肌动蛋白为内参照,计算Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR蛋白相对表达量,在此基础上计算p-Akt与Akt比值、p-mTOR与mTOR比值,以此表示Akt与mTOR的磷酸化水平。本实验样本数为3。

1.5 抑制Akt活性后二甲双胍对HSFb的影响

1.5.1 细胞增殖活性检测

取HSFb同1.4.1调整细胞浓度、接种、同步化。将细胞分为对照组（常规培养）和LY294002组、二甲双胍组、LY294002+二甲双胍组,其中在LY294002组与二甲双胍组细胞培养基中分别加入终物质的量浓度为20 μmol/L的LY294002、终物质的量浓度为10 mmol/L的二甲双胍,在LY294002+二甲双胍组细胞培养基中加入终物质的量浓度为20 μmol/L的LY294002预处理30 min后再加入终物质的量浓度为10 mmol/L的二甲双胍培养。培养0（即刻）、24、48 h,同1.4.1采用CCK-8检测各组细胞增殖活性。本实验样本数为3。

1.5.2 细胞中Akt与mTOR的磷酸化水平检测

取HSFb,同1.4.4调整细胞浓度、接种、同步化,同1.5.1分组处理。培养48 h,同1.4.4采用蛋白质印迹法检测细胞中Akt、mTOR的磷酸化水平,以p-Akt与Akt比值、p-mTOR与mTOR比值表示。本实验样本数为3。

1.6 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布,以x¯±s表示。多组间多个时间点总体比较采用析因设计方差分析,单个时间点组间或多种处理方法间总体比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 二甲双胍对HSFb的影响

2.1.1 细胞增殖抑制率

培养48 h,经PBS及5、10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞的增殖抑制率分别为0、（21.5±5.0）%、（57.5±3.5）%、（71.5±5.0）%和（75.0±1.4）%,总体比较,差异有统计学意义（F=144.80,P<0.001）。与经PBS处理比较,经5、10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞的增殖抑制率均显著升高（t值分别为10.69、14.20、19.73、52.54,P<0.001）。

2.1.2 细胞培养上清液中羟脯氨酸含量

培养48 h,经PBS及5、10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞培养上清液中羟脯氨酸含量分别为（5.67±0.34）、（4.73±0.41）、（3.13±0.29）、（2.67±0.42）、（2.03±0.37）mmol/L,总体比较,差异有统计学意义（F=33.52,P<0.001）。经PBS处理与经5 mmol/L二甲双胍处理细胞培养上清液中羟脯氨酸含量比较,差异无统计学意义（t=2.48,P=0.069）；与经PBS处理比较,经10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞培养上清液中羟脯氨酸含量均显著降低（t值分别为8.06、7.86、10.25,P<0.001）。

2.1.3 细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA的mRNA表达及Akt、mTOR的磷酸化水平

培养24 h,与经PBS处理比较,经5、10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞中Ⅰ型胶原及α-SMA的mRNA表达及经10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞中Ⅲ型胶原的mRNA表达均显著降低（P<0.05）。见表1。

Table 1. 人增生性瘢痕成纤维细胞经加入PBS或各种终物质的量浓度二甲双胍培养24 h后细胞中纤维化蛋白的mRNA表达比较（x¯±s）

处理因素	样本数	Ⅰ型胶原	Ⅲ型胶原	α-平滑肌肌动蛋白
PBS	3	0.98±0.07	1.01±0.09	1.003±0.078
5 mmol/L二甲双胍	3	0.76±0.05	0.82±0.05	0.750±0.020
10 mmol/L二甲双胍	3	0.56±0.05	0.59±0.07	0.627±0.046
20 mmol/L二甲双胍	3	0.46±0.07	0.46±0.07	0.457±0.054
40 mmol/L二甲双胍	3	0.32±0.04	0.39±0.03	0.427±0.032
F值		64.26	30.58	41.72
P值		<0.001	<0.001	<0.001
t₁值		4.35	2.57	4.14
P₁值		0.012	0.062	0.014
t₂值		8.53	5.18	5.58
P₂值		0.001	0.007	0.005
t₃值		9.57	6.85	7.89
P₃值		0.001	0.002	0.001
t₄值		14.77	9.15	9.37
P₄值		0.010	0.001	0.001
注：F值、P值为加入磷酸盐缓冲液（PBS）或各种终物质的量浓度二甲双胍培养后各指标总体比较所得；t₁值与P₁值、t₂值与P₂值、t₃值与P₃值、t₄值与P₄值分别为加入5、10、20、40 mmol/L二甲双胍培养与加入PBS培养后各指标比较所得

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培养48 h,与经PBS处理比较,经10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞中p-Akt与Akt比值及经20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞中p-mTOR与mTOR比值均显著降低（P<0.05）。见图1、表2。

图 1 蛋白质印迹法检测的人增生性瘢痕成纤维细胞经加入PBS或各种终物质的量浓度二甲双胍培养48 h后Akt与mTOR磷酸化水平

注：Akt为蛋白激酶B,p‑Akt为磷酸化Akt,mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,p‑mTOR为磷酸化mTOR,PBS为磷酸盐缓冲液；条带上方1、2、3、4、5分别指示经PBS或5、10、20、40 mmol/L二甲双胍处理细胞

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Table 2. 人增生性瘢痕成纤维细胞经加入PBS或各种终物质的量浓度二甲双胍培养48 h后Akt与mTOR磷酸化水平比较（x¯±s）

处理因素	样本数	p-Akt与Akt比值	p-mTOR与mTOR比值
PBS	3	1.101±0.101	0.875±0.087
5 mmol/L二甲双胍	3	1.064±0.065	0.843±0.052
10 mmol/L二甲双胍	3	0.915±0.053	0.806±0.058
20 mmol/L二甲双胍	3	0.799±0.069	0.584±0.018
40 mmol/L二甲双胍	3	0.509±0.025	0.396±0.028
F值		37.68	42.81
P值		<0.001	<0.001
t₁值		0.53	0.54
P₁值		0.623	0.617
t₂值		2.82	1.13
P₂值		0.048	0.321
t₃值		4.28	5.66
P₃值		0.013	0.005
t₄值		9.88	9.08
P₄值		<0.001	<0.001
注：Akt为蛋白激酶B,mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,p-Akt为磷酸化Akt,p-mTOR为磷酸化mTOR；Akt、mTOR磷酸化水平分别以p-Akt与Akt比值、p-mTOR与mTOR比值表示；F值、P值为加入磷酸盐缓冲液（PBS）或各种终物质的量浓度二甲双胍培养后各指标总体比较所得；t₁值与P₁值、t₂值与P₂值、t₃值与P₃值、t₄值与P₄值分别为加入5、10、20、40 mmol/L二甲双胍培养与加入PBS培养后各指标比较所得

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2.2 抑制Akt活性后二甲双胍对HSFb的影响

2.2.1 细胞增殖活性

培养24、48 h,LY294002组、二甲双胍组细胞增殖活性均较对照组显著下降（P<0.05）；LY294002+二甲双胍组与二甲双胍组细胞增殖活性比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

Table 3. 4组人增生性瘢痕成纤维细胞培养各时间点增殖活性比较（x¯±s）

组别	样本数	0 h（即刻）	24 h	48 h
对照组	3	0.350±0.021	0.907±0.071	1.377±0.051
LY294002组	3	0.347±0.031	0.557±0.065	0.807±0.051
二甲双胍组	3	0.361±0.040	0.621±0.029	0.763±0.085
LY294002+二甲双胍组	3	0.372±0.013	0.760±0.086	0.811±0.020
t₁值		0.16	6.30	13.60
P₁值		0.882	0.003	<0.001
t₂值		0.39	6.47	10.69
P₂值		0.718	0.003	<0.001
t₃值		1.59	1.57	0.96
P₃值		0.190	0.192	0.393
注：对照组细胞常规培养,后3组细胞培养基中分别加入LY294002、二甲双胍、LY294002+二甲双胍培养,LY294002与二甲双胍的终物质的量浓度分别为20 μmol/L、10 mmol/L；处理因素主效应,F=411.00,P<0.001；时间因素主效应,F=78.10,P<0.001；两者交互作用,F=25.79,P<0.001；t₁值与P₁值、t₂值与P₂值分别为LY294002组、二甲双胍组与对照组各时间点比较所得,t₃值与P₃值为LY294002+二甲双胍组与二甲双胍组各时间点比较所得

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2.2.2 细胞中Akt与mTOR磷酸化水平

培养48 h,LY294002组、二甲双胍组细胞中p-Akt与Akt比值及LY294002组细胞中p-mTOR与mTOR比值均显著低于对照组（P<0.05）,LY294002+二甲双胍组细胞中p-Akt与Akt比值与p-mTOR与mTOR比值均显著低于二甲双胍组（P<0.05）。见图2、表4。

图 2 蛋白质印迹法检测的4组人增生性瘢痕成纤维细胞培养48 h细胞中Akt和mTOR磷酸化水平（x¯±s

）

注：Akt为蛋白激酶B,p-Akt为磷酸化Akt,mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,p-mTOR为磷酸化mTOR；条带上方1、2、3、4分别指示细胞常规培养的对照组和细胞培养基中加入LY294002、二甲双胍、LY294002+二甲双胍培养的LY294002组、二甲双胍组、LY294002+二甲双胍组,LY294002与二甲双胍的终物质的量浓度分别为20 μmol/L、10 mmol/L

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Table 4. 4组人增生性瘢痕成纤维细胞培养48 h细胞中Akt和mTOR磷酸化水平比较（x¯±s）

组别	样本数	p-Akt与Akt比值	p-mTOR与mTOR比值
对照组	3	1.053±0.193	0.958±0.181
LY294002组	3	0.554±0.027	0.531±0.025
二甲双胍组	3	0.681±0.029	0.787±0.057
LY294002+二甲双胍组	3	0.387±0.023	0.321±0.089
F值		24.57	25.32
P值		<0.001	<0.001
t₁值		4.45	4.01
P₁值		0.011	0.016
t₂值		3.31	1.55
P₂值		0.030	0.195
t₃值		5.95	6.05
P₃值		0.004	0.004
注：Akt为蛋白激酶B,mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,p-Akt为磷酸化Akt,p-mTOR为磷酸化mTOR；Akt、mTOR磷酸化水平分别以p-Akt与Akt比值、p-mTOR与mTOR比值表示；对照组细胞常规培养,后3组细胞培养基中分别加入LY294002、二甲双胍、LY294002+二甲双胍培养,LY294002与二甲双胍的终物质的量浓度分别为20 μmol/L、10 mmol/L；F值、P值为4组间各指标总体比较所得；t₁值与P₁值、t₂值与P₂值分别为LY294002组、二甲双胍组与对照组各指标比较所得,t₃值与P₃值为LY294002+二甲双胍组与二甲双胍组各指标比较所得

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3. 讨论

HS是创伤愈合过程中常见的并发症,给患者带来巨大的痛苦^[28]。目前,治疗HS的方法包括手术切除、激光治疗、压力衣治疗和使用抗瘢痕药物,这些方法通常有局限性,效果不太理想^{[29, 30]}。

二甲双胍作为糖尿病的经典治疗药物,不仅在降糖方面表现出色,还具备抗炎、抗氧化等多种生物活性^{[8, 9, 10]}。目前有关二甲双胍对于皮肤真皮组织中胶原蛋白、羟脯氨酸合成及对瘢痕形成的作用尚未明确。人皮肤蛋白质中胶原蛋白是构成瘢痕组织中胶原纤维的主要成分,而胶原蛋白含羟脯氨酸的量最多。本研究显示二甲双胍能够使HSFb培养上清液中羟脯氨酸含量明显降低,且羟脯氨酸含量随二甲双胍浓度的升高而降低,在实验剂量范围内具有一定的浓度依赖性。细胞增殖实验结果显示,二甲双胍能够显著抑制HSFb的增殖。与经PBS处理相比,经各终物质的量浓度二甲双胍处理的细胞增殖抑制率明显升高,表明细胞增殖活性受到抑制；且在实验剂量范围内,随着二甲双胍浓度的升高,细胞增殖抑制率逐渐升高,呈现出明显的剂量依赖性。进一步分析显示,二甲双胍能够抑制HSFb中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA的mRNA表达,且在实验剂量范围内,这些检测分子mRNA的表达水平随着二甲双胍浓度的升高具有降低的趋势。这一结果与二甲双胍在肝、肾、心肌纤维化中作用的研究结果^{[11, 12, 13, 14]}基本一致,表明二甲双胍可能具有抗皮肤瘢痕纤维化的能力。该结果可以直接反映出二甲双胍具有抑制HSFb合成分泌ECM胶原蛋白的功能,提示二甲双胍或许可作为治疗瘢痕纤维化的药物。而且,已有研究结果表明,二甲双胍可通过抑制TGF-β₁刺激的Fb和瘢痕疙瘩Fb的ECM的表达,进一步抑制纤维化过程^[13]。然而,二甲双胍是否可用于治疗肝纤维化,以及其潜在的抗肝纤维化形成机制,仍需进一步研究以明确。

目前普遍认为,创面愈合过程中Fb的异常增殖、迁移以及ECM的过度沉积可引起HS形成。本研究证实二甲双胍具有抑制HSFb增殖及羟脯氨酸合成,抑制纤维化蛋白基因表达的作用,说明二甲双胍具有潜在的拮抗瘢痕纤维化功能。既往研究报道,微小RNA-519d能够抑制HSFb中ECM相关基因的表达、增殖,诱导细胞凋亡,从而抑制人HS的形成^{[31, 32, 33]}。下调p75神经营养因子受体可抑制人HSFb的生长、迁移和ECM积累,作者认为该神经营养因子受体的沉默不仅降低了PI3K/Akt/mTOR信号通路分子表达,同时也增强了自噬蛋白的表达从而减轻人HS的形成^[34]。ECM成分过度沉积导致器官纤维化,而蛋白酶类可以抑制ECM蛋白的产生,从而能够抑制小鼠烧伤后HS的形成^{[35, 36, 37]}。由上可见,皮肤Fb的增殖、迁移以及ECM的合成分泌等生物活性与细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控密切相关^{[38, 39, 40]}。

为了进一步证实二甲双胍作用于Akt分子靶点来抑制HSFb的生物学作用,本课题组应用特异的Akt活性抑制剂LY294002阻断Akt磷酸化,检测了二甲双胍干预HSFb后,PI3K/Akt/mTOR信号通路关键靶分子Akt、mTOR活性（即磷酸化水平）的变化,结果表明二甲双胍能够明显抑制HSFb中Akt及mTOR的磷酸化水平,且抑制效果随着二甲双胍浓度的增加而增大。这些结果说明二甲双胍能够显著抑制Akt及其下游mTOR分子的磷酸化水平,提示二甲双胍或许通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制HSFb的增殖、ECM蛋白的合成和分泌。更加具有说服力的是,细胞增殖实验结果表明,LY294002与二甲双胍均可以有效抑制HSFb的增殖,而LY294002+二甲双胍共同处理对HSFb的增殖作用与单独使用二甲双胍相比未见有显著差异。表明二甲双胍与特异的Akt活性抑制剂LY294002具有相似的生物学效应,能够抑制HSFb中Akt的活性,证实二甲双胍通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节HSFb的生物功能。

综上所述,二甲双胍能够从基因水平抑制HSFb中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA的表达,致使HSFb的ECM胶原蛋白的合成及分泌减弱。二甲双胍能够特异性抑制Fb中Akt和mTOR的磷酸化水平,通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制HSFb的ECM胶原蛋白的表达和分泌,抑制HSFb的增殖,抑制皮肤组织瘢痕纤维化。可见,二甲双胍具有抑制Fb的增殖、迁移及ECM沉积的功能,因而抑制或缓解HS的发生。该研究结果为HS的临床防治提供了新的候选药物和治疗靶点。

谢文博：酝酿和设计实验、撰写论文；胡晓龙：分析、解释数据,修改论文,技术支持,统计分析；魏双：采集数据、整理数据；石继红：总体审阅、经费支持

所有作者声明不存在利益冲突

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图 1 蛋白质印迹法检测的人增生性瘢痕成纤维细胞经加入PBS或各种终物质的量浓度二甲双胍培养48 h后Akt与mTOR磷酸化水平

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图 2 蛋白质印迹法检测的4组人增生性瘢痕成纤维细胞培养48 h细胞中Akt和mTOR磷酸化水平（x¯±s）

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Table 1. 人增生性瘢痕成纤维细胞经加入PBS或各种终物质的量浓度二甲双胍培养24 h后细胞中纤维化蛋白的mRNA表达比较（x¯±s）

处理因素	样本数	Ⅰ型胶原	Ⅲ型胶原	α-平滑肌肌动蛋白
PBS	3	0.98±0.07	1.01±0.09	1.003±0.078
5 mmol/L二甲双胍	3	0.76±0.05	0.82±0.05	0.750±0.020
10 mmol/L二甲双胍	3	0.56±0.05	0.59±0.07	0.627±0.046
20 mmol/L二甲双胍	3	0.46±0.07	0.46±0.07	0.457±0.054
40 mmol/L二甲双胍	3	0.32±0.04	0.39±0.03	0.427±0.032
F值		64.26	30.58	41.72
P值		<0.001	<0.001	<0.001
t₁值		4.35	2.57	4.14
P₁值		0.012	0.062	0.014
t₂值		8.53	5.18	5.58
P₂值		0.001	0.007	0.005
t₃值		9.57	6.85	7.89
P₃值		0.001	0.002	0.001
t₄值		14.77	9.15	9.37
P₄值		0.010	0.001	0.001
注：F值、P值为加入磷酸盐缓冲液（PBS）或各种终物质的量浓度二甲双胍培养后各指标总体比较所得；t₁值与P₁值、t₂值与P₂值、t₃值与P₃值、t₄值与P₄值分别为加入5、10、20、40 mmol/L二甲双胍培养与加入PBS培养后各指标比较所得

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Table 2. 人增生性瘢痕成纤维细胞经加入PBS或各种终物质的量浓度二甲双胍培养48 h后Akt与mTOR磷酸化水平比较（x¯±s）

处理因素	样本数	p-Akt与Akt比值	p-mTOR与mTOR比值
PBS	3	1.101±0.101	0.875±0.087
5 mmol/L二甲双胍	3	1.064±0.065	0.843±0.052
10 mmol/L二甲双胍	3	0.915±0.053	0.806±0.058
20 mmol/L二甲双胍	3	0.799±0.069	0.584±0.018
40 mmol/L二甲双胍	3	0.509±0.025	0.396±0.028
F值		37.68	42.81
P值		<0.001	<0.001
t₁值		0.53	0.54
P₁值		0.623	0.617
t₂值		2.82	1.13
P₂值		0.048	0.321
t₃值		4.28	5.66
P₃值		0.013	0.005
t₄值		9.88	9.08
P₄值		<0.001	<0.001
注：Akt为蛋白激酶B,mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,p-Akt为磷酸化Akt,p-mTOR为磷酸化mTOR；Akt、mTOR磷酸化水平分别以p-Akt与Akt比值、p-mTOR与mTOR比值表示；F值、P值为加入磷酸盐缓冲液（PBS）或各种终物质的量浓度二甲双胍培养后各指标总体比较所得；t₁值与P₁值、t₂值与P₂值、t₃值与P₃值、t₄值与P₄值分别为加入5、10、20、40 mmol/L二甲双胍培养与加入PBS培养后各指标比较所得

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Table 3. 4组人增生性瘢痕成纤维细胞培养各时间点增殖活性比较（x¯±s）

组别	样本数	0 h（即刻）	24 h	48 h
对照组	3	0.350±0.021	0.907±0.071	1.377±0.051
LY294002组	3	0.347±0.031	0.557±0.065	0.807±0.051
二甲双胍组	3	0.361±0.040	0.621±0.029	0.763±0.085
LY294002+二甲双胍组	3	0.372±0.013	0.760±0.086	0.811±0.020
t₁值		0.16	6.30	13.60
P₁值		0.882	0.003	<0.001
t₂值		0.39	6.47	10.69
P₂值		0.718	0.003	<0.001
t₃值		1.59	1.57	0.96
P₃值		0.190	0.192	0.393
注：对照组细胞常规培养,后3组细胞培养基中分别加入LY294002、二甲双胍、LY294002+二甲双胍培养,LY294002与二甲双胍的终物质的量浓度分别为20 μmol/L、10 mmol/L；处理因素主效应,F=411.00,P<0.001；时间因素主效应,F=78.10,P<0.001；两者交互作用,F=25.79,P<0.001；t₁值与P₁值、t₂值与P₂值分别为LY294002组、二甲双胍组与对照组各时间点比较所得,t₃值与P₃值为LY294002+二甲双胍组与二甲双胍组各时间点比较所得

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Table 4. 4组人增生性瘢痕成纤维细胞培养48 h细胞中Akt和mTOR磷酸化水平比较（x¯±s）

组别	样本数	p-Akt与Akt比值	p-mTOR与mTOR比值
对照组	3	1.053±0.193	0.958±0.181
LY294002组	3	0.554±0.027	0.531±0.025
二甲双胍组	3	0.681±0.029	0.787±0.057
LY294002+二甲双胍组	3	0.387±0.023	0.321±0.089
F值		24.57	25.32
P值		<0.001	<0.001
t₁值		4.45	4.01
P₁值		0.011	0.016
t₂值		3.31	1.55
P₂值		0.030	0.195
t₃值		5.95	6.05
P₃值		0.004	0.004
注：Akt为蛋白激酶B,mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,p-Akt为磷酸化Akt,p-mTOR为磷酸化mTOR；Akt、mTOR磷酸化水平分别以p-Akt与Akt比值、p-mTOR与mTOR比值表示；对照组细胞常规培养,后3组细胞培养基中分别加入LY294002、二甲双胍、LY294002+二甲双胍培养,LY294002与二甲双胍的终物质的量浓度分别为20 μmol/L、10 mmol/L；F值、P值为4组间各指标总体比较所得；t₁值与P₁值、t₂值与P₂值分别为LY294002组、二甲双胍组与对照组各指标比较所得,t₃值与P₃值为LY294002+二甲双胍组与二甲双胍组各指标比较所得

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1. 材料与方法
1.1 组织样本来源
1.2 主要试剂与仪器来源
1.3 细胞培养
1.4 二甲双胍对HSFb的影响
1.5 抑制Akt活性后二甲双胍对HSFb的影响
1.6 统计学处理
2. 结果
2.1 二甲双胍对HSFb的影响
2.2 抑制Akt活性后二甲双胍对HSFb的影响
3. 讨论

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二甲双胍对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖及纤维化蛋白表达的影响及其机制

doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20231220-00259

通讯作者: 石继红,Email：biojhshi@126.com

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