Influence and mechanism of extracellular vesicles derived from human adipose-derived mesenchymal stem cells on pyroptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by high glucose
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摘要:
目的 探讨人脂肪间充质干细胞（hADMSC）来源细胞外囊泡（EV）,即hADMSC-EV对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）焦亡的影响及其机制,为改善糖尿病创面中血管功能提供依据。 方法 该研究为实验研究。收集2023年6—9月于南昌大学第一附属医院妇产科完成正常阴道分娩的5名25~40岁产妇的脐带,分离HUVEC并成功鉴定；取同期于该院整形外科行腹部抽脂术的6名25~35岁健康女性的脂肪组织,分离hADMSC后提取hADMSC-EV并成功鉴定。将用含物质的量浓度为33 mmol/L葡萄糖的内皮细胞培养基培养的第4代HUVEC,分为加入磷酸盐缓冲液（PBS）培养的PBS组、加入hADMSC-EV培养的EV组、加入磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路抑制剂LY294002和hADMSC-EV培养的EV+LY294002组,采用蛋白质印迹法检测细胞培养48 h后PI3K/Akt信号通路相关蛋白PI3K、Akt和焦亡相关蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶1（caspase-1）、消皮素D、白细胞介素1β（IL-1β）、IL-18的蛋白表达；采用细胞计数试剂盒-8检测细胞培养0（即刻）、12、24、36、48、60、72 h增殖水平；培养48 h后,行细胞划痕试验并计算划痕后12、24 h的细胞迁移率,行细胞Transwell试验并计算细胞24 h迁移数量,行细胞成管实验并测算细胞成管总长度与分支节点数。样本数均为3。 结果 培养48 h后,EV组细胞中PI3K和Akt的蛋白表达均明显高于PBS组（P<0.05）,EV+LY294002组细胞中PI3K和Akt的蛋白表达均明显低于EV组（P<0.05）。培养48 h后,EV组细胞中NLRP3、caspase-1、消皮素D、IL-1β、IL-18的蛋白表达分别为0.54±0.08、0.96±0.11、0.525±0.061、1.216±0.039、1.317±0.023,均明显低于PBS组的2.32±0.11、1.86±0.07、1.256±0.113、2.589±0.084、2.042±0.132（P<0.05）；EV+LY294002组细胞中NLRP3、caspase-1、消皮素D、IL-1β、IL-18的蛋白表达分别为1.16±0.05、1.37±0.06、0.962±0.028、1.834±0.017、1.803±0.065,均明显高于EV组（P<0.05）。培养12、24、36、48、60、72 h,EV组细胞增殖水平均明显高于PBS组（P<0.05）,EV+LY294002组细胞增殖水平均明显低于EV组（P<0.05）。培养48 h后,EV组细胞划痕后12、24 h迁移率均明显高于PBS组（P<0.05）,EV+LY294002组细胞划痕后12、24 h迁移率均明显低于EV组（P<0.05）；EV组细胞24 h迁移数量明显多于PBS组（P<0.05）,EV+LY294002组细胞24 h迁移数量明显少于EV组（P<0.05）。培养48 h后,与PBS组比较,EV组细胞成管总长度明显延长（P<0.05）且分支节点数明显增多（P<0.05）；与EV组比较,EV+LY294002组细胞成管总长度明显缩短（P<0.05）且分支节点数明显减少（P<0.05）。 结论 hADMSC-EV可通过PI3K/Akt信号通路抑制高糖诱导的HUVEC焦亡相关蛋白的表达,并改善细胞增殖、迁移和血管形成能力。 Abstract:Objective To investigate the influence and mechanism of extracellular vesicles (EVs) derived from human adipose-derived mesenchymal stem cells (hADMSCs), i.e. hADMSC-EVs on pyroptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by high glucose, with the aim of providing evidence for improving vascular function in diabetic wounds. Methods This study was an experimental research. The umbilical cords from 5 women aged 25 to 40 years were collected who had normal vaginal delivery at the Department of Obstetrics and Gynecology of the First Affiliated Hospital of Nanchang University from June to September in 2023, and HUVECs were isolated and successfully identified. Adipose tissue was obtained from 6 healthy women aged 25 to 35 years who underwent abdomen liposuction at the Department of Plastic Surgery of the above-mentioned hospital in the same period. After hADMSCs were isolated, hADMSC-EVs were extracted and successfully identified. The fourth passage of HUVECs were cultured in endothelial cell medium containing glucose in a molarity of 33 mmol/L and divided into phosphate buffered solution (PBS) group cultured with PBS, EV group cultured with hADMSC-EVs, and EV+LY294002 group cultured with hADMSC-EVs and the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) signaling pathway inhibitor LY294002. Western blotting was used to detect the expressions of PI3K/Akt signaling pathway-related proteins PI3K and Akt, and pyroptosis-related proteins nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3), cysteinyl aspartate specific protease-1 (caspase-1), gasdermin D, interleukin-1β (IL-1β), and IL-18 of cells after 48 hours of culture. A cell counting kit-8 was used to test the proliferation levels of cells at 0 (immediately), 12, 24, 36, 48, 60, and 72 hours of culture. After 48 hours of culture, the cell scratch test was performed and the cell migration rates at 12 and 24 hours after scratching were calculated; the cell Transwell assay was conducted and the number of cells migrating in 24 hours was calculated; the cell tube formation experiment was performed, and the total length of tube formation and the number of branch nodes were measured and counted. The sample size was 3. Results After 48 hours of culture, the protein expressions of PI3K and Akt of cells in EV group were significantly higher than those in PBS group (P<0.05), and the protein expressions of PI3K and Akt of cells in EV+LY294002 group were significantly lower than those in EV group (P<0.05). After 48 hours of culture, the protein expressions of NLRP3, caspase-1, gasdermin D, IL-1β, and IL-18 of cells in EV group were 0.54±0.08, 0.96±0.11, 0.525±0.061, 1.216±0.039, and 1.317±0.023, respectively, which were significantly lower than 2.32±0.11, 1.86±0.07, 1.256±0.113, 2.589±0.084, and 2.042±0.132 in PBS group (P<0.05); the protein expressions of NLRP3, caspase-1, gasdermin D, IL-1β, and IL-18 of cells in EV+LY294002 group were 1.16±0.05, 1.37±0.06, 0.962±0.028, 1.834±0.017, and 1.803±0.065, respectively, which were significantly higher than those in EV group (P<0.05). At 12, 24, 36, 48, 60, and 72 hours of culture, the proliferation levels of cells in EV group were significantly higher than those in PBS group (P<0.05), and the proliferation levels of cells in EV+LY294002 group were significantly lower than those in EV group (P<0.05). After 48 hours of culture, the cell migration rates at 12 and 24 hours after scratching in EV group were significantly higher than those in PBS group (P<0.05), and the cell migration rates at 12 and 24 hours after scratching in EV+LY294002 group were significantly lower than those in EV group (P<0.05); the number of cells migrating in 24 hours in EV group was significantly greater than that in PBS group (P<0.05), and the number of cells migrating in 24 hours in EV+LY294002 group was significantly less than that in EV group (P<0.05). After 48 hours of culture, compared with those in PBS group, the total length of tube formation of cells in EV group was significantly prolonged (P<0.05), and the number of branch nodes was significantly increased (P<0.05); compared with those in EV group, the total length of tube formation in EV+LY294002 group was significantly shortened (P<0.05), and the number of branch nodes was significantly decreased (P<0.05). Conclusions hADMSC-EVs can inhibit the expression of pyroptosis-related proteins in HUVECs induced by high glucose through the PI3K/Akt signaling pathway and improve the proliferation, migration, and angiogenesis capabilities of HUVECs. -
(1)揭示在高糖状态下人脐静脉内皮细胞（HUVEC）发生焦亡,并证实人脂肪间充质干细胞来源细胞外囊泡（hADMSC-EV）能够抑制高糖诱导的HUVEC焦亡。
(2)证实hADMSC-EV可通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路抑制高糖诱导的HUVEC焦亡相关蛋白的表达,并改善细胞增殖、迁移和血管形成能力。
Highlights:
(1)It was revealed that human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) underwent pyroptosis under high glucose conditions and confirmed that extracellular vesicles derived from human adipose-derived mesenchymal stem cells (hADMSC-EVs) could inhibit HUVECs pyroptosis induced by high glucose.
(2)It was confirmed that hADMSC-EVs could inhibit the expression of pyroptosis-related proteins in HUVECs induced by high glucose through the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway and improve the proliferation, migration, and angiogenesis capabilities of cells.
糖尿病创面具有修复难度大、迁延不愈等特点,对患者健康造成严重威胁[1],目前的治疗效果尚不令人满意[2]。近期研究表明,间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）旁分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicle,EV）不仅具有与MSC相似的促进组织再生的能力,而且因其独特的临床优势而备受关注[3]。EV通过传递其内含的可溶性物质,参与细胞间通讯,在促进血管生成和加速创面愈合方面发挥重要作用[4, 5]。与其他类型的MSC相比,人脂肪MSC（human adipose-derived mesenchymal stem cell,hADMSC）因具有易于获得和来源丰富等优势而备受关注[6]。
细胞焦亡被认为是一种程序性细胞死亡方式。在细胞焦亡经典通路中,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）分子受到胞内信号分子刺激,与胱天蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific protease-1,caspase-1）前体和凋亡相关斑点样蛋白组装形成NLRP3炎症小体,并激活caspase-1[7],激活的caspase-1将消皮素D切割成N端和C端,并促进IL-1β前体和IL-18前体形成成熟体,随后细胞因子通过细胞膜上消皮素D的N端构建的孔道释放[8, 9],引起相关炎症反应。近期研究表明,糖尿病状态下内皮细胞发生焦亡,这很可能是导致血管功能障碍的重要原因[10, 11]。前期研究表明,hADMSC来源EV（extracellular vesicle derived from human adipose-derived mesenchymal stem cell,hADMSC-EV）可通过促进内皮细胞增殖、迁移和血管形成来加速糖尿病小鼠创面愈合[12]。本研究旨在探究hADMSC-EV在高糖条件下对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）焦亡的影响,并分析其对HUVEC的增殖、迁移和血管形成能力的作用及其机制,为hADMSC-EV在糖尿病创面的临床应用提供理论参考。
1. 资料与方法
本实验研究经南昌大学第一附属医院（下称本单位）医学伦理委员会审核批准,批号：（2023）CDYFYYLK（02-007）。实验步骤严格遵守国际生物医学研究指导原则和相关规定,脐带、脂肪组织标本采集经标本供者知情同意。
1.1 主要材料来源
脐带取自5名于本单位妇产科完成正常阴道分娩的25~40岁产妇,脂肪组织取自6名于本单位整形外科行腹部抽脂术的25~35岁健康女性。前述11名女性传染病检查确定均无甲肝、乙肝、梅毒、获得性免疫缺陷综合征等传染性疾病,就诊时间为2023年6—9月。
内皮细胞培养基购自美国ScienCell公司,最低必需培养基-α购自美国Thermo Fisher Scientific公司。胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、Ⅱ型胶原蛋白酶购自美国Gibco公司。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信号通路抑制剂LY294002购自美国MCE公司,细胞计数试剂盒-8购自日本东京都公司,2孔细胞划痕插件购自德国IBIDI公司,Transwell小室及其划痕插件、基质胶购自美国Corning公司,兔抗人caspase-1、IL-18多克隆抗体购自美国Proteintech公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体购自成都正能生物技术有限责任公司,成骨、成脂诱导分化培养基购自赛业（广州）生物科技有限公司,兔抗人CD31、凋亡连接基因2相互作用蛋白X（apoptosis-linked gene 2 interacting protein-X,Alix）、PI3K、Akt、NLRP3、消皮素D、IL-1β、β肌动蛋白、CD9、CD63单克隆抗体及Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体购自英国Abcam公司,藻红蛋白标记的CD73、CD34、人类白细胞抗原DR（human leukocyte antigen DR,HLA-DR）、IgG1、IgG2a单克隆抗体及异硫氰酸荧光素标记的CD44、CD45、CD90、CD105、IgG1、IgG2b单克隆抗体购自美国BD公司。CTR6000型倒置相差荧光显微镜购自德国Leica公司,BX53型倒置相差显微镜购自日本Olympus公司,NovoCyte D3000型流式细胞仪购自美国Agilent Technologies公司,ChemiDoc型凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。
1.2 HUVEC的分离培养与鉴定
获取约15 cm长脐带,用PBS冲洗至液体澄清,血管钳夹闭脐带一端,抽取20 mL消化液（1 g/L Ⅱ型胶原蛋白酶1 mL+PBS 9 mL+2.5 g/L 胰蛋白酶10 mL）注入脐静脉,夹闭注射端,放入37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中孵育,每5分钟按揉脐带1次。30 min后将消化液挤出并用内皮细胞培养基冲洗脐静脉,将消化液和冲洗液转移至离心管中,于37 ℃条件下以半径为10 cm、1 500 r/min离心5 min。弃去上清液,用内皮细胞培养基重新悬浮细胞并移入培养瓶中,置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中培养。每2天更换1次内皮细胞培养基,于细胞生长至80%融合时进行传代（后续使用第4代细胞）。取生长至80%融合的HUVEC,按50%密度铺入盖有载玻片的12孔板中,待细胞贴壁后,采用免疫荧光法观测细胞中CD31蛋白表达。一抗为兔抗人CD31单克隆抗体（稀释比为1∶30）,二抗为Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶200）,用4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色细胞核（阳性染色为蓝色）。采用倒置相差荧光显微镜于400倍放大倍数下观察细胞形态及细胞中CD31（阳性染色为绿色）的蛋白表达。
1.3 hADMSC的分离培养与鉴定
取脂肪组织,参照文献[13],按照常规步骤剪碎、消化、过滤、离心后用最低必需培养基-α重新悬浮细胞,接种至培养瓶中常规培养。每2天更换1次最低必需培养基-α,待细胞生长至80%融合时进行传代。取生长至90%融合的hADMSC,行消化、离心、重新悬浮,将细胞浓度调整为2×106个/mL并加入藻红蛋白标记的CD34、CD73、HLA-DR单克隆抗体及异硫氰酸荧光素标记的CD44、CD45、CD90、CD105单克隆抗体,同型对照异硫氰酸荧光素标记的IgG1、IgG2b单克隆抗体及藻红蛋白标记的IgG1、IgG2a单克隆抗体（稀释比均为1∶10）,4 ℃避光孵育30 min后采用流式细胞仪检测细胞CD105、CD90、CD73、CD44、CD45、CD34、HLA-DR表达。另取第4代生长至70%和100%融合的hADMSC,分别经成骨、成脂诱导分化培养基干预30 d后分别用茜素红和油红O染色,在倒置相差显微镜100倍放大倍数下评估成骨（阳性染色为暗红色）和成脂（阳性染色为红色）分化潜力。
1.4 hADMSC-EV的提取与鉴定
使用无血清最低必需培养基-α培养生长至80%融合的hADMSC 48 h后,收集上清液,采用超高速离心法[14]提取hADMSC-EV,采用PBS重新悬浮沉淀后于-80 ℃冻存。取适量hADMSC-EV,分别于纳米颗粒跟踪分析仪和透射电子显微镜（100 000倍放大倍数）下测量粒径和观察形态。取适量hADMSC-EV,用蛋白质印迹法检测CD9、CD63、Alix蛋白表达,一抗为兔抗人CD9、CD63、Alix单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000）,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶5 000）,增强化学发光法显影,采用凝胶成像系统获取条带。
1.5 hADMSC-EV对经高糖处理HUVEC的影响
1.5.1 细胞中PI3K/Akt信号通路和焦亡相关蛋白的蛋白表达检测
使用500 g/L葡萄糖注射液将内皮细胞培养基中葡萄糖终物质的量浓度调整到33 mmol/L,制成高糖内皮细胞培养基。用高糖内皮细胞培养基培养HUVEC并将其分为PBS组、EV组、EV+LY294002组,分别于高糖内皮细胞培养基中加入PBS、终质量浓度为100 µg/mL的hADMSC-EV、终质量浓度为100 µg/mL的hADMSC-EV+终物质的量浓度为25 μmol/L的LY294002培养,加入液体总体积相同。
培养48 h后,提取每组1×106个细胞的总蛋白,采用蛋白质印迹法检测细胞中NLRP3、caspase-1、消皮素D、IL-1β、IL-18、PI3K、Akt的蛋白表达。一抗为兔抗人caspase-1、IL-18多克隆抗体与兔抗人PI3K、Akt、NLRP3、消皮素D、IL-1β、β肌动蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000）,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶5 000）。同1.4获取条带后,以β肌动蛋白为内参照,采用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）计算目的蛋白与内参照蛋白的灰度值比值,以此表示蛋白表达水平。该实验样本数为3（实验样本数下同）。
1.5.2 细胞增殖水平检测
将细胞浓度调整为2×104个/mL后同1.5.1进行分组处理,于培养0（即刻）、12、24、36、48、60、72 h,根据细胞计数试剂盒-8说明书操作,采用酶标仪检测各组细胞在波长450 nm处吸光度值,以此表示细胞增殖水平。
1.5.3 细胞迁移水平检测
1.5.3 .1 细胞划痕试验检测细胞水平迁移情况
将细胞浓度调整为2.5×104个/mL后同1.5.1进行分组处理,培养48 h后,将各组细胞接种于2孔细胞划痕插件内,待细胞贴壁后拔出划痕插件。分别在拔出划痕插件后（即划痕后）0（即刻）、12、24 h于倒置相差显微镜50倍放大倍数下观察划痕情况并拍照,使用ImageJ软件测量划痕面积并计算划痕后12、24 h的细胞迁移率,细胞迁移率=（划痕后0 h划痕面积-各时间点划痕面积）÷划痕后0 h划痕面积×100%。
1.5.3 .2 细胞Transwell试验检测细胞垂直迁移情况
将细胞浓度调整为4×104个/mL后同1.5.1进行分组处理,培养48 h后,取各组细胞悬液200 μL接种于Transwell小室上室,向Transwell培养板下室中加入各组细胞培养物600 μL。培养24 h后于1 g/L结晶紫溶液中染色,在倒置相差显微镜200倍放大倍数下观察细胞迁移（阳性染色为紫色）情况,每组取3个视野,统计迁移至下室的细胞数,结果取均值。
1.5.4 细胞成管情况检测
将细胞浓度调整为2×104个/mL后同1.5.1进行分组处理,培养48 h后,取各组100 μL细胞悬液接种在预先加入基质胶的96孔板中,在37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中培养4 h,于倒置相差显微镜100倍放大倍数下观察血管形成情况。使用ImageJ软件测算每孔任意5个视野中所有毛细血管的分支点总数和总长度,即成管总长度与分支节点数。
1.6 统计学处理
采用SPSS 27.0统计软件进行分析。计量资料数据均符合正态分布,以
2. 结果
2.1 HUVEC的形态及细胞中CD31表达
第4代HUVEC呈燕麦状且细胞中可见CD31表达。见图1。
图 1 第4代人脐静脉内皮细胞形态及细胞中CD31表达情况 Alexa Fluor 488-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×400。1A.细胞核（蓝色）染色情况；1B.细胞质中可见CD31阳性（绿色）表达；1C.1A与1B叠加图像,细胞呈燕麦状2.2 hADMSC的标记蛋白表达与成骨成脂分化
第4代hADMSC高表达MSC标记蛋白CD105、CD90、CD73、CD44（阳性率分别为97.50%、93.30%、96.60%、96.60%）,低表达造血干细胞标记蛋白CD45、CD34以及组织相容性蛋白HLA-DR（阳性率分别为1.67%、1.53%、2.56%）；成脂、成骨诱导培养30 d后,分别可见细胞内有大小不一的脂滴、大量钙结节沉积,见图2。
图 2 第4代人脂肪间充质干细胞培养30 d后成脂与成骨分化情况。2A.细胞中可见大量钙结节（暗红色）形成 茜素红×100；2B.细胞中可见大小不一的脂滴（红色）形成 油红O×1002.3 hADMSC-EV的形态与粒径及标记蛋白表达
hADMSC-EV呈大小不等的圆盘形态,粒径主要分布在100~150 nm（峰值粒径为131.4 nm）,表达囊泡特异性标记蛋白CD9、CD63、Alix,见图3。
图 3 hADMSC-EV的形态与粒径及标记蛋白表达情况。3A.hADMSC-EV的形态为圆盘状,大小不等 透射电子显微镜×100 000；3B.hADMSC-EV粒径主要分布在100~150 nm；3C.蛋白质印迹法检测显示hADMSC-EV表达囊泡特异性标记蛋白CD9、CD63、Alix注：hADMSC-EV为人脂肪间充质干细胞来源细胞外囊泡,Alix为凋亡连接基因2相互作用蛋白X；图3B为横坐标经过lg处理后生成的图2.4 hADMSC-EV对经高糖处理HUVEC的影响
2.4.1 细胞中PI3K/Akt信号通路和焦亡相关蛋白的蛋白表达
培养48 h后,EV组细胞中PI3K和Akt的蛋白表达均明显高于PBS组（P<0.05）,NLRP3、caspase-1、消皮素D、IL-1β、IL-18的蛋白表达均明显低于PBS组（P<0.05）；EV+LY294002组细胞中PI3K和Akt的蛋白表达均明显低于EV组（P<0.05）,NLRP3、caspase-1、消皮素D、IL-1β、IL-18的蛋白表达均明显高于EV组（P<0.05）。见表1和图4。
Table 1. 3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后PI3K/Akt信号通路和焦亡相关蛋白的蛋白表达比较（组别 样本数 PI3K Akt NLRP3 caspase-1 消皮素D IL-1β IL-18 PBS组 3 0.64±0.08 0.875±0.101 2.32±0.11 1.86±0.07 1.256±0.113 2.589±0.084 2.042±0.132 EV组 3 1.20±0.06 1.910±0.026 0.54±0.08 0.96±0.11 0.525±0.061 1.216±0.039 1.317±0.023 EV+LY294002组 3 0.05±0.04 1.676±0.043 1.16±0.05 1.37±0.06 0.962±0.028 1.834±0.017 1.803±0.065 F值 93.49 206.88 356.59 90.97 70.08 55.47 478.26 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 P1值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 P2值 <0.001 0.014 <0.001 0.002 0.001 0.001 <0.001 注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养；PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶,Akt为蛋白激酶B,NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3,caspase-1为胱天蛋白酶1,IL为白细胞介素；F值、P值为组间各指标总体比较所得,P1值为EV组与PBS组各指标比较所得,P2值为EV+LY294002组与EV组各指标比较所得 
图 4 蛋白质印迹法检测的3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后PI3K/Akt信号通路和焦亡相关蛋白的蛋白表达注：NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3,PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶,Akt为蛋白激酶B,caspase-1为胱天蛋白酶1,IL为白细胞介素；条带上方1、2、3分别指示在高糖培养条件下分别加入磷酸盐缓冲液（PBS）、人脂肪间充质干细胞来源细胞外囊泡（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养细胞的PBS组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组2.4.2 细胞增殖水平
培养12、24、36、48、60、72 h,EV组细胞增殖水平均明显高于PBS组（P<0.05）,EV+LY294002组细胞增殖水平均明显低于EV组（P<0.05）。见表2。
Table 2. 3组人脐静脉内皮细胞培养各时间点增殖水平比较（组别 样本数 0 h（即刻） 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h PBS组 3 0.086±0.021 0.137±0.019 0.218±0.026 0.325±0.024 0.431±0.036 0.547±0.032 0.647±0.039 EV组 3 0.088±0.030 0.374±0.028 0.480±0.030 0.599±0.059 0.761±0.033 0.892±0.042 1.002±0.032 EV+LY294002组 3 0.088±0.032 0.195±0.026 0.286±0.027 0.397±0.034 0.519±0.035 0.644±0.025 0.751±0.023 P1值 0.070 <0.001 <0.001 0.002 <0.001 <0.001 <0.001 P2值 0.290 0.001 0.001 0.007 <0.001 <0.001 <0.001 注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养；处理因素主效应,F=406.06,P<0.001；时间因素主效应,F=634.43,P<0.001；两者交互作用,F=12.79,P<0.001；P1值为EV组与PBS组各时间点比较所得,P2值为EV+LY294002组与EV组各时间点比较所得 2.4.3 细胞迁移水平
2.4.3 .1 细胞水平迁移情况
培养48 h后,EV组细胞划痕后12、24 h迁移率均明显高于PBS组（P<0.05）,EV+LY294002组细胞划痕后12、24 h迁移率均明显低于EV组（P<0.05）,见图5与表3。
图 5 3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后经划痕试验检测的划痕后各时间点水平迁移情况 倒置相差显微镜×50。5A、5B、5C.分别为PBS组细胞划痕后0（即刻）、12、24 h的划痕面积,逐渐缩小；5D、5E、5F.分别为EV组细胞划痕后0、12、24 h的划痕面积,图5D与图5A划痕面积相近,图5E、5F划痕面积分别明显小于图5B、5C；5G、5H、5I.分别为EV+LY294002组细胞划痕后0、12、24 h的划痕面积,图5G与图5D划痕面积相近,图5H、5I划痕面积分别明显大于图5E、5F注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养Table 3. 3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后经划痕试验检测的划痕后各时间点迁移率比较(%,组别 样本数 12 h 24 h PBS组 3 0.423±0.287 0.735±0.075 EV组 3 0.671±0.455 0.918±0.037 EV+LY294002组 3 0.532±0.024 0.820±0.019 F值 2 473.00 108.81 P值 <0.001 <0.001 P1值 0.001 0.019 P2值 0.009 0.015 注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养；处理因素主效应,F=31.89,P<0.001；时间因素主效应,F=1 459.44,P<0.001；两者交互作用,F=11.54,P<0.001；F值、P值为组间各时间点总体比较所得,P1值为EV组与PBS组各时间点比较所得,P2值为EV+LY294002组与EV组各时间点比较所得 2.4.3 .2 细胞垂直迁移情况
培养48 h后,PBS组、EV组、EV+LY294002组细胞24 h迁移数量分别为（382±128）、（902±117）、（567±87）个,组间总体比较,差异有统计学意义（F=27.65,P<0.001）。EV组细胞24 h迁移数量明显多于PBS组（P<0.001）,EV+LY294002组细胞24 h迁移数量明显少于EV组（P=0.001）。见图6。
图 6 3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后经Transwell试验检测的24 h垂直迁移情况 结晶紫×200。6A.PBS组细胞迁移数量一般；6B.EV组细胞迁移数量明显多于图6A；6C.EV+LY294002组细胞迁移数量明显少于图6B注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养2.4.4 细胞成管情况
培养48 h后,PBS组、EV组、EV+LY294002组细胞成管总长度分别为（4 282±773）、（9 488±1 035）、（6 679±1 638）μm,成管分支节点数分别为（51±5）、（106±10）、（82±6）个,组间总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为18.72、61.42,P<0.001）。与PBS组比较,EV组细胞成管总长度明显延长（P<0.001）且分支节点数明显增多（P<0.001）；与EV组比较,EV+LY294002组细胞成管总长度明显缩短（P=0.028）且分支节点数明显减少（P=0.004）。见图7。
图 7 3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后成管情况 倒置相差显微镜×100。7A.PBS组血管较少；7B.EV组成管分支节点数明显多于图7A,成管总长度明显长于图7A；7C.EV+LY294002组成管分支节点数明显少于图7B,成管总长度明显短于图7B注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养3. 讨论
糖尿病创面已成为全球范围内导致残疾和死亡的重大健康问题[15]。目前研究认为,糖尿病慢性创面主要是由慢性炎症、血管生成受损和再上皮化延迟所致[16],其中血管病变是其形成与发展的基础。高血糖环境可引起血管内皮细胞线粒体中活性氧水平升高,导致内皮细胞增殖、迁移、血管形成能力受损[17]；同时还会产生大量与活性氧相关的化合物甲基乙二醛,随之产生晚期糖基化终末产物受体识别晚期糖基化终末产物,通过降低VEGF受体2表达导致内皮细胞生成障碍[18]。另外糖尿病状态下四氢生物蝶呤在体内合成减少,引起内皮细胞NOS解偶联,加重内皮细胞氧化应激损伤[19]。这些因素最终导致内皮细胞数量减少和功能下降,结果使得内皮细胞的修复和正常功能的毛细血管的生成变得困难[20],从而导致糖尿病创面愈合过程受阻。
已有研究表明,通过移植MSC可以促进糖尿病创面愈合[21]。例如,通过移植脐带MSC[22, 23]和脂肪MSC[24, 25]可以加速血管生成,促进糖尿病创面愈合。然而,MSC的直接移植存在许多不可预测的危险因素,如潜在的致瘤性、免疫排斥反应和储存限制等[26]。MSC主要通过旁分泌机制发挥作用,以出芽的形式向外传递EV中脂质、蛋白质、RNA、转录因子和细胞因子受体作用于受体细胞,参与细胞间通讯[27]。MSC分泌的EV不仅具有与MSC相同的作用,而且由于其高稳定性、低免疫原性、非致瘤性和易于储存,在促进创面愈合过程中表现出巨大潜力[28, 29, 30, 31, 32]。研究表明,羊膜MSC、骨髓MSC和脐带MSC来源的EV,通过促进血管生成、调节细胞炎症反应、递送非编码RNA以及增强胶原沉积等多种机制,促进糖尿病创面的愈合[28, 29, 30]。越来越多的研究表明,hADMSC-EV在糖尿病创面愈合中起着至关重要的作用[31]。本研究团队在预实验中模拟糖尿病高血糖状态,建立高糖细胞模型,观察到高糖状态下HUVEC增殖、迁移和血管形成能力受到抑制；进一步采用hADMSC-EV作用于高糖处理的HUVEC,证实hADMSC-EV能够促进HUVEC增殖、迁移和血管形成。
细胞焦亡的特征是细胞肿胀、凋亡小体形成、细胞膜破裂和大量促炎因子的释放,可引起强烈的炎症反应[32]。糖尿病状态下,内皮细胞显示出较低的细胞活力和较高的caspase-1活性,可诱导内皮细胞发生焦亡[33]；高糖环境大量产生的晚期糖基化终末产物通过激活caspase-1裂解消皮素D诱导内皮细胞焦亡[34, 35]。本研究团队在预实验中观察到,高糖诱导HUVEC焦亡相关蛋白表达显著上调；进一步研究显示,hADMSC-EV可抑制高糖诱导的HUVEC焦亡相关蛋白的表达。
为了探讨hADMSC-EV抑制高糖诱导的HUVEC焦亡相关蛋白表达的机制,本研究团队利用蛋白质印迹法对PI3K和Akt蛋白表达情况进行检测。PI3K/Akt信号通路是一种细胞内信号转导途径[36],响应细胞外信号传递[37],促进代谢、增殖[38]、生长[39]和血管生成[40]。在预实验中,高糖培养条件下HUVEC的PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达受到抑制。进一步研究显示,hADMSC-EV能够上调HUVEC中PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达,并下调焦亡相关蛋白的表达。同时,hADMSC-EV还能改善HUVEC的增殖、迁移和血管形成能力。这些效应在应用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002后,显示出部分减弱的效果,表明hADMSC-EV部分通过PI3K/Akt信号通路抑制高糖诱导的HUVEC焦亡相关蛋白表达并促进其增殖、迁移和血管形成。
本研究尚存在以下局限性：（1）研究未能通过动物实验进行体内验证,这是研究的一个主要局限,因为体外实验结果并不总能完全预测体内情况。（2）模拟糖尿病微环境的高糖模型需要进一步改进,例如通过更精确地模拟体内高糖环境的复杂性,包括非酶糖化、氧化应激和炎症因子的作用,以更真实地反映糖尿病状态下的细胞反应。（3）对于hADMSC-EV中调控PI3K/Akt信号通路的生物成分,如特定mRNA或蛋白质,需要进一步探究,以明确它们在信号转导中的具体作用。
综上所述,本研究结果表明,hADMSC-EV可通过PI3K/Akt信号通路抑制高糖诱导的HUVEC焦亡相关蛋白的表达,并改善其增殖、迁移和血管形成能力。应用hADMSC-EV有望作为一种具有临床应用前景的促进糖尿病创面愈合的新治疗策略。
冯俊云、费潇：实验操作与论文撰写；方邵一涵、安静雯：数据整理；施彦：统计学分析；刘德伍：研究指导、论文修改、经费支持所有作者声明不存在利益冲突 -
参考文献
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图 1 第4代人脐静脉内皮细胞形态及细胞中CD31表达情况 Alexa Fluor 488-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×400。1A.细胞核（蓝色）染色情况；1B.细胞质中可见CD31阳性（绿色）表达；1C.1A与1B叠加图像,细胞呈燕麦状
图 2 第4代人脂肪间充质干细胞培养30 d后成脂与成骨分化情况。2A.细胞中可见大量钙结节（暗红色）形成 茜素红×100；2B.细胞中可见大小不一的脂滴（红色）形成 油红O×100
图 3 hADMSC-EV的形态与粒径及标记蛋白表达情况。3A.hADMSC-EV的形态为圆盘状,大小不等 透射电子显微镜×100 000；3B.hADMSC-EV粒径主要分布在100~150 nm；3C.蛋白质印迹法检测显示hADMSC-EV表达囊泡特异性标记蛋白CD9、CD63、Alix
注：hADMSC-EV为人脂肪间充质干细胞来源细胞外囊泡,Alix为凋亡连接基因2相互作用蛋白X；图3B为横坐标经过lg处理后生成的图
图 4 蛋白质印迹法检测的3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后PI3K/Akt信号通路和焦亡相关蛋白的蛋白表达
注：NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3,PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶,Akt为蛋白激酶B,caspase-1为胱天蛋白酶1,IL为白细胞介素；条带上方1、2、3分别指示在高糖培养条件下分别加入磷酸盐缓冲液（PBS）、人脂肪间充质干细胞来源细胞外囊泡（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养细胞的PBS组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组
图 5 3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后经划痕试验检测的划痕后各时间点水平迁移情况 倒置相差显微镜×50。5A、5B、5C.分别为PBS组细胞划痕后0（即刻）、12、24 h的划痕面积,逐渐缩小；5D、5E、5F.分别为EV组细胞划痕后0、12、24 h的划痕面积,图5D与图5A划痕面积相近,图5E、5F划痕面积分别明显小于图5B、5C；5G、5H、5I.分别为EV+LY294002组细胞划痕后0、12、24 h的划痕面积,图5G与图5D划痕面积相近,图5H、5I划痕面积分别明显大于图5E、5F
注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养
图 6 3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后经Transwell试验检测的24 h垂直迁移情况 结晶紫×200。6A.PBS组细胞迁移数量一般；6B.EV组细胞迁移数量明显多于图6A；6C.EV+LY294002组细胞迁移数量明显少于图6B
注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养
图 7 3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后成管情况 倒置相差显微镜×100。7A.PBS组血管较少；7B.EV组成管分支节点数明显多于图7A,成管总长度明显长于图7A；7C.EV+LY294002组成管分支节点数明显少于图7B,成管总长度明显短于图7B
注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养
Table 1. 3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后PI3K/Akt信号通路和焦亡相关蛋白的蛋白表达比较（
组别 样本数 PI3K Akt NLRP3 caspase-1 消皮素D IL-1β IL-18 PBS组 3 0.64±0.08 0.875±0.101 2.32±0.11 1.86±0.07 1.256±0.113 2.589±0.084 2.042±0.132 EV组 3 1.20±0.06 1.910±0.026 0.54±0.08 0.96±0.11 0.525±0.061 1.216±0.039 1.317±0.023 EV+LY294002组 3 0.05±0.04 1.676±0.043 1.16±0.05 1.37±0.06 0.962±0.028 1.834±0.017 1.803±0.065 F值 93.49 206.88 356.59 90.97 70.08 55.47 478.26 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 P1值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 P2值 <0.001 0.014 <0.001 0.002 0.001 0.001 <0.001 注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养；PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶,Akt为蛋白激酶B,NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3,caspase-1为胱天蛋白酶1,IL为白细胞介素；F值、P值为组间各指标总体比较所得,P1值为EV组与PBS组各指标比较所得,P2值为EV+LY294002组与EV组各指标比较所得 
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Table 2. 3组人脐静脉内皮细胞培养各时间点增殖水平比较（
组别 样本数 0 h（即刻） 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h PBS组 3 0.086±0.021 0.137±0.019 0.218±0.026 0.325±0.024 0.431±0.036 0.547±0.032 0.647±0.039 EV组 3 0.088±0.030 0.374±0.028 0.480±0.030 0.599±0.059 0.761±0.033 0.892±0.042 1.002±0.032 EV+LY294002组 3 0.088±0.032 0.195±0.026 0.286±0.027 0.397±0.034 0.519±0.035 0.644±0.025 0.751±0.023 P1值 0.070 <0.001 <0.001 0.002 <0.001 <0.001 <0.001 P2值 0.290 0.001 0.001 0.007 <0.001 <0.001 <0.001 注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养；处理因素主效应,F=406.06,P<0.001；时间因素主效应,F=634.43,P<0.001；两者交互作用,F=12.79,P<0.001；P1值为EV组与PBS组各时间点比较所得,P2值为EV+LY294002组与EV组各时间点比较所得
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Table 3. 3组人脐静脉内皮细胞培养48 h后经划痕试验检测的划痕后各时间点迁移率比较(%,
组别 样本数 12 h 24 h PBS组 3 0.423±0.287 0.735±0.075 EV组 3 0.671±0.455 0.918±0.037 EV+LY294002组 3 0.532±0.024 0.820±0.019 F值 2 473.00 108.81 P值 <0.001 <0.001 P1值 0.001 0.019 P2值 0.009 0.015 注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、细胞外囊泡（EV）组、EV+LY294002组细胞于高糖培养条件下分别加入PBS、人脂肪间充质干细胞来源EV（hADMSC-EV）、LY294002+hADMSC-EV培养；处理因素主效应,F=31.89,P<0.001；时间因素主效应,F=1 459.44,P<0.001；两者交互作用,F=11.54,P<0.001；F值、P值为组间各时间点总体比较所得,P1值为EV组与PBS组各时间点比较所得,P2值为EV+LY294002组与EV组各时间点比较所得
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