Effects of baicalin on ferroptosis of mouse fibroblasts under high glucose treatment and its mechanism
-
摘要:
目的 探讨黄芩苷对高糖处理的小鼠成纤维细胞（Fb）铁死亡的作用及其机制,为糖尿病创面治疗提供依据。 方法 该研究为实验研究。取小鼠Fb,分为常规培养的对照组、用终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖处理的高糖组及分别用终物质的量浓度5、10 μmol/L的黄芩苷预处理后再同高糖组处理的低黄芩苷组、高黄芩苷组。培养48 h后,采用细胞计数试剂盒-8检测细胞存活率,用荧光探针法检测细胞活性氧水平,使用比色法检测细胞中丙二醛、谷胱甘肽、亚铁离子水平,采用蛋白质印迹法检测细胞中溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的蛋白表达水平及细胞质、细胞核中核转录因子红系2相关因子2（Nrf2）的蛋白表达水平。另取小鼠Fb,分为同前处理的对照组、高糖组、高黄芩苷组及用终物质的量浓度均为10 μmol/L 的黄芩苷和Nrf2抑制剂ML385预处理后再同高糖组处理的高黄芩苷+ML385组,培养48 h后,同前检测细胞中SLC7A11、GPX4的蛋白表达水平及细胞质、细胞核中Nrf2的蛋白表达水平。除谷胱甘肽、亚铁离子水平检测样本数为4外,其余指标检测样本数均为3。 结果 培养48 h后,对照组、高糖组、低黄芩苷组、高黄芩苷组细胞存活率分别为（100.0±10.7）%、（70.0±5.0）%、（80.9±3.2）%、（91.4±1.9）%。与对照组比较,高糖组细胞存活率和细胞谷胱甘肽水平、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平以及细胞核Nrf2蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）,细胞活性氧、丙二醛、亚铁离子水平及细胞质Nrf2蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。与高糖组比较,低黄芩苷组和高黄芩苷组细胞存活率和细胞谷胱甘肽水平、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平以及细胞核Nrf2蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）,低黄芩苷组和高黄芩苷组细胞活性氧水平、亚铁离子水平和细胞质Nrf2蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）,高黄芩苷组细胞丙二醛水平显著降低（P<0.05）。与低黄芩苷组比较,高黄芩苷组细胞存活率和细胞谷胱甘肽水平、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平及细胞核Nrf2蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）,细胞活性氧水平和细胞丙二醛、亚铁离子水平及细胞质Nrf2蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。培养48 h后,与对照组比较,高糖组细胞核Nrf2蛋白表达水平及细胞SLC7A11、GPX4蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）,细胞质Nrf2蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与高糖组比较,高黄芩苷组细胞质Nrf2蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,细胞核Nrf2蛋白表达水平及细胞SLC7A11、GPX4蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）；与高黄芩苷组比较,高黄芩苷+ML385组细胞质Nrf2蛋白表达水平显著升高（P<0.05）,细胞核Nrf2蛋白表达水平及细胞SLC7A11、GPX4蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。 结论 黄芩苷通过激活Nrf2信号通路,上调高糖处理的Fb的SLC7A11/GPX4轴相关蛋白的表达,抑制细胞发生铁死亡,从而提高细胞存活率。 Abstract:Objective To investigate the effects of baicalin on ferroptosis of mouse fibroblasts (Fbs) under high glucose treatment and its mechanism, and to provide a basis for the treatment of diabetic wounds. Methods The study was an experimental study. Mouse Fbs were collected and divided into control group with conventional culture, high glucose group treated with glucose at final molarity of 30.0 mmol/L, and low baicalin group and high baicalin group pretreated with baicalin at final molarties of 5 and 10 μmol/L respectively and then treated as that in high glucose group. After 48 h of culture, the cell survival rate was detected by the cell counting kit-8, the reactive oxygen species level in cells was detected by the fluorescent probe method, the levels of malondialdehyde, glutathione, and ferrous ion in cells were detected by colorimetry, and the protein expression levels of solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11) and glutathione peroxidase 4 (GPX4) in cells and nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) in cytoplasm and nucleus were detected by Western blotting. Another batch of mouse Fbs were collected and divided into control group, high glucose group, high baicalin group, and high baicalin+ML385 group. The cells in the first three groups were treated as before, the cells in the last group were pretreated with baicalin and ML385 of Nrf2 inhibitor at final molarties of 10 μmol/L and then treated as that in high glucose group. After 48 h of culture, the protein expression levels of SLC7A11 and GPX4 in cells and the protein expression level of Nrf2 in cytoplasm and nucleus were detected as before. Except that the sample number in detecting SLC7A11 and GPX4 was 4, the sample number in detecting other indexes was 3. Results After 48 h of culture, the cell survival rates in control group, high glucose group, low baicalin group, and high baicalin group were (100.0±10.7)%, (70.0±5.0)%, (80.9±3.2)%, and (91.4±1.9)%, respectively. Compared with those in control group, the cell survival rate, the glutathione level, and SLC7A11 and GPX4 protein expression levels in cells, and nuclear Nrf2 protein expression level were significantly decreased in high glucose group (P<0.05), and the levels of reactive oxygen species, malondialdehyde, and ferrous ion in cells, and cytoplasmic Nrf2 protein expression level were significantly increased in high glucose group (P<0.05). Compared with those in high glucose group, the cell survival rate, glutathione level, SLC7A11 and GPX4 protein expression levels in cells, and nuclear Nrf2 protein expression level in low baicalin group and high baicalin group were significantly increased (P<0.05), the reactive oxygen species and ferrous ion levels in cells, and cytoplasmic Nrf2 protein expression level in low baicalin group and high baicalin group were significantly decreased (P<0.05), and the malondialdehyde level in cells in high baicalin group was significantly decreased (P<0.05). Compared with those in low baicalin group, the cell survival rate, glutathione level, SLC7A11 and GPX4 protein expression levels in cells, and nuclear Nrf2 protein expression level in high baicalin group were significantly increased (P<0.05), and the reactive oxygen species, malondialdehyde, and ferrous ion levels in cells, and cytoplasmic Nrf2 protein expression level in high baicalin group were significantly decreased (P<0.05). After 48 h of culture, compared with those in control group, the nuclear Nrf2 protein expression level and SLC7A11 and GPX4 protein expression levels in cells were significantly decreased (P<0.05), and the cytoplasmic Nrf2 protein expression level was significantly increased in high glucose group (P<0.05); compared with those in high glucose group, the cytoplasmic Nrf2 protein expression level was significantly decreased (P<0.05), and the nuclear Nrf2 protein expression level and SLC7A11 and GPX4 protein expression levels in cells were significantly increased in high baicalin group (P<0.05); compared with those in high baicalin group, the cytoplasmic Nrf2 protein expression level was significantly increased (P<0.05), and the nuclear Nrf2 protein expression level and SLC7A11 and GPX4 protein expression levels in cells were significantly decreased in high baicalin+ML385 group (P<0.05). Conclusions Baicalin can inhibit the occurrence of ferroptosis in cells by activating the Nrf2 signaling pathway and up-regulating the expressions of proteins related to SLC7A11/GPX4 axis in Fbs in high glucose treatment, thus increasing the cell survival rate. -
(1)通过体外模拟创面高糖微环境,成功诱导成纤维细胞（Fb）发生铁死亡。
(2)证实黄芩苷能激活高糖处理的Fb中核转录因子红系2相关因子2发生核位移,进而上调溶质载体家族7成员11/谷胱甘肽过氧化物酶4轴相关蛋白的表达和提高高糖处理的细胞抗铁死亡作用。
Highlights:
(1)Fibroblasts (Fbs) were successfully induced to undergo ferroptosis by mimicking the high glucose microenvironment of wounds in vitro.
(2)It was confirmed that baicalin could promote the nuclear displacement of the nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 in Fbs under high glucose treatment, which in turn up-regulated the expressions of proteins related to solute carrier family 7 member 11/glutathione peroxidase 4 axis and improved the anti-ferroptosis effect of cells under high glucose treatment.
糖尿病是一种慢性代谢性疾病,全世界约有4.15亿人患有糖尿病[1]。糖尿病能引起创面不愈合和溃烂,严重情况下还会导致截肢[2, 3, 4, 5]。糖尿病患者由于体内糖代谢能力下降,血糖水平高,而高血糖是糖尿病患者创面区域血管生成受阻和创面愈合延迟的主要原因[6, 7]。
铁死亡是一种独特的细胞程序性死亡方式,不同于细胞凋亡和坏死,其特征是细胞内铁超载,并通过芬顿反应促进铁依赖性脂质过氧化物积累[8, 9]。越来越多的研究表明,铁死亡参与糖尿病创面延迟愈合的病理进程。高血糖通过诱导线粒体上调活性氧水平和激活脂质过氧化；同时伴随着铁代谢途径紊乱,诱导游离铁水平升高,进一步导致铁死亡和氧化应激,促进细胞功能障碍和死亡,从而抑制血管生成和创面愈合[10]。
黄芩苷是从中药黄芩中提取出的一种黄酮类化合物,具有显著的抗氧化、抗菌、调节炎症和抗铁死亡等生物学作用[11, 12, 13]。Fb是参与创面愈合过程的主要修复细胞[14]。本研究拟用高糖处理小鼠Fb制备铁死亡细胞模型,用于模拟糖尿病创面铁死亡病灶,并探究黄芩苷对高糖条件下小鼠Fb 铁死亡的调控作用及其潜在的机制,为黄芩苷及其相关制剂的开发并应用于糖尿病创面的治疗提供实验依据和理论基础。
1. 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂与仪器来源
小鼠Fb（L-929细胞）和DMEM培养基购于武汉普诺赛生命科技有限公司。葡萄糖、细胞计数试剂盒-8、2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针、谷胱甘肽检测试剂盒、丙二醛检测试剂盒、亚铁离子检测试剂盒、蛋白裂解液、蛋白浓度检测试剂盒、蛋白上样缓冲液均购于北京索莱宝科技有限公司,小鼠源性溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11,SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）、核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）、GAPDH、组蛋白H3单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体及二氧化碳细胞培养箱、Multiskan FC型酶标仪均购于美国Thermo Fisher Scientific公司,Nrf2抑制剂ML385购于上海阿拉丁生化科技有限公司,细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。LSM 880NLO型双光子激光共聚焦荧光显微镜购于德国卡尔蔡司公司,Tanon 5200系列全自动化学发光仪购于上海天能生命科学有限公司。
1.2 黄芩苷对高糖处理的细胞的影响
1.2.1 细胞分组及处理
将小鼠Fb以每孔1×105个接种于6孔板中,待细胞生长达50%融合时,将细胞分成对照组、高糖组、低黄芩苷组、高黄芩苷组。对照组细胞用含终物质的量浓度5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养（即常规培养）,高糖组细胞用含终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养[15],低黄芩苷组、高黄芩苷组细胞分别加入终物质的量浓度5、10 μmol/L黄芩苷预处理24 h后同高糖组细胞处理[16]。将各组细胞置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳的细胞培养箱中培养48 h后,用于后续实验。
1.2.2 细胞存活率检测
取4组细胞,以每孔1×104个接种于96孔板中,每孔加入10 μL 细胞计数试剂盒-8溶液,测定在波长450 nm处的吸光度值,以此反映细胞存活情况。以对照组其中1个样本中细胞存活率为100%,计算其他3组细胞存活率。该实验样本数为3。
1.2.3 铁死亡相关指标的水平检测
取4组细胞,使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针检测活性氧水平,于激光共聚焦荧光显微镜100倍放大倍数下观察活性氧水平（绿色荧光）,用Image J 1.8.0图像分析软件（美国国立卫生研究院）分析荧光强度（样本数为3）。参照相应试剂盒说明书,采用比色法于酶标仪中观测细胞中丙二醛（样本数为3）及谷胱甘肽（样本数为4）、亚铁离子（样本数为4）水平。以对照组其中1个样本中亚铁离子水平为100%,计算其他3组亚铁离子水平。
1.2.4 抗铁死亡相关蛋白表达水平检测
提取4组细胞总蛋白,采用蛋白质印迹法检测SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平。提取4组细胞的细胞质和细胞核蛋白,采用蛋白质印迹法检测细胞质和细胞核中Nrf2蛋白表达水平。其中加入的一抗为小鼠源性SLC7A11、GPX4、Nrf2、GAPDH、组蛋白H3单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000）,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体（稀释比为1∶10 000）。采用化学发光仪对目的蛋白显影,用Image J 1.8.0图像分析软件分析蛋白条带灰度值。检测细胞核中Nrf2蛋白水平,以组蛋白H3为内参照；其余蛋白检测以GAPDH为内参照,计算目的蛋白的相对表达水平。该实验样本数为3。
1.3 抑制Nrf2核位移后黄芩苷对高糖处理的细胞的影响
另取小鼠Fb,分成对照组、高糖组、高黄芩苷组、高黄芩苷+ML385组,前3组细胞同1.2.1中相同组别细胞进行处理。高黄芩苷+ML385组细胞用终物质的量浓度均为10 μmol/L 的黄芩苷和 ML385[17]预处理24 h后,同高糖组细胞处理,同1.2.4检测4组细胞中SLC7A11、GPX4蛋白表达水平及细胞质、细胞核中Nrf2蛋白表达水平。该实验样本数为3。
1.4 统计学处理
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,计量资料数据均符合正态分布,以
2. 结果
2.1 细胞存活率
培养48 h后,对照组、高糖组、低黄芩苷组、高黄芩苷组细胞存活率分别为（100.0±10.7）%、（70.0±5.0）%、（80.9±3.2）%、（91.4±1.9）%,组间总体比较,差异有统计学意义（F=49.70,P<0.001）。与对照组比较,高糖组细胞存活率显著降低（P<0.001）；与高糖组比较,低黄芩苷组和高黄芩苷组细胞存活率均显著升高（P值分别为0.009、<0.001）；与低黄芩苷组比较,高黄芩苷组细胞存活率显著升高（P=0.001）。
2.2 铁死亡相关指标的水平
培养48 h后,与对照组比较,高糖组细胞活性氧水平显著升高（P<0.001）；与高糖组比较,低黄芩苷组和高黄芩苷组细胞活性氧水平均显著降低（P<0.001）；与低黄芩苷组比较,高黄芩苷组细胞活性氧水平显著降低（P<0.001）。见图1、2A。
图 1 4组小鼠成纤维细胞培养48 h后的活性氧水平 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯×100。1A、1B、1C、1D.分别为对照组、高糖组、低黄芩苷组、高黄芩苷组,图1B活性氧水平明显高于图1A、1C、1D,图1C活性氧水平明显高于图1D注：对照组行常规培养,高糖组用终物质的量浓度30.0 mmol/L的葡萄糖处理,低黄芩苷组、高黄芩苷组分别用终物质的量浓度5、10 μmol/L的黄芩苷预处理后再同高糖组处理；绿色荧光表示活性氧
图 2 4组小鼠成纤维细胞培养48 h后的铁死亡相关指标的水平（
注：横坐标中1、2、3、4分别表示行常规培养的对照组,用终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖处理的高糖组及分别用终物质的量浓度5、10 μmol/L的黄芩苷预处理后再同高糖组处理的低黄芩苷组、高黄芩苷组；4组细胞活性氧、谷胱甘肽、丙二醛、亚铁离子水平总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为171.20、187.60、19.55、76.14,P<0.001）；与对照组比较,aP<0.05；与高糖组比较,bP<0.05；与低黄芩苷组比较,cP<0.05培养48 h后,与对照组比较,高糖组细胞谷胱甘肽水平显著降低（P<0.001）,丙二醛、亚铁离子水平均显著升高（P<0.001）。与高糖组比较,低黄芩苷组和高黄芩苷组细胞谷胱甘肽水平均显著升高（P<0.001）、亚铁离子水平均显著降低（P<0.001）,高黄芩苷组细胞丙二醛水平显著降低（P<0.001）。与低黄芩苷组比较,高黄芩苷组细胞谷胱甘肽水平显著升高（P<0.001）,丙二醛、亚铁离子水平均显著降低（P值分别为0.006、<0.001）。见图2B、2C、2D。
2.3 SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平
培养48 h后,与对照组比较,高糖组细胞SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均显著降低（P<0.001）；与高糖组比较,低黄芩苷组、高黄芩苷组细胞SLC7A11（P<0.001）和GPX4（P值分别为0.035、<0.001）蛋白表达水平均显著升高；与低黄芩苷组比较,高黄芩苷组细胞SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均显著升高（P值分别为0.004、0.038）。见图3。
图 3 蛋白质印迹法检测的4组小鼠成纤维细胞培养48 h后SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平。3A.条带图；3B.条图（样本数为3,
注：图3A条带上方和图3B横坐标1、2、3、4分别表示行常规培养的对照组,用终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖处理的高糖组及分别用终物质的量浓度5、10 μmol/L的黄芩苷预处理后再同高糖组处理的低黄芩苷组、高黄芩苷组；SLC7A11为溶质载体家族7成员11,GPX4为谷胱甘肽过氧化物酶4,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；4组细胞SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为88.77、49.32,P<0.001）；与对照组比较,aP<0.05；与高糖组比较,bP<0.05；与低黄芩苷组比较,cP<0.052.4 Nrf2的蛋白表达水平
培养48 h后,与对照组比较,高糖组细胞质Nrf2蛋白表达水平显著升高（P<0.001）,细胞核Nrf2蛋白表达水平显著降低（P<0.001）；与高糖组比较,低黄芩苷组、高黄芩苷组细胞质Nrf2蛋白表达水平均显著降低（P<0.001）,细胞核Nrf2蛋白表达水平均显著升高（P<0.001）；与低黄芩苷组比较,高黄芩苷组细胞质Nrf2蛋白表达水平显著降低（P=0.004）,细胞核Nrf2蛋白表达水平显著升高（P=0.003）。见图4。
图 4 蛋白质印迹法检测的4组小鼠成纤维细胞培养48 h后细胞质和细胞核Nrf2的蛋白表达水平。4A.细胞质蛋白表达条带图；4B.细胞核蛋白表达条带图；4C.细胞质蛋白表达条图（样本数为3,2.5 黄芩苷通过影响Nrf2核位移对高糖处理的细胞的影响
培养48 h后,与对照组比较,高糖组细胞质Nrf2蛋白表达水平显著升高（P<0.001）,细胞核Nrf2蛋白表达水平显著降低（P<0.001）；与高糖组比较,高黄芩苷组细胞质Nrf2蛋白表达水平显著降低（P<0.001）,细胞核Nrf2蛋白表达水平显著升高（P<0.001）；与高黄芩苷组比较,高黄芩苷+ML385组细胞质Nrf2蛋白表达水平显著升高（P<0.001）,细胞核Nrf2蛋白表达水平显著降低（P<0.001）。见图5。
图 5 蛋白质印迹法检测的4组小鼠成纤维细胞培养48 h后细胞质和细胞核Nrf2的蛋白表达水平。5A.细胞质蛋白表达条带图；5B.细胞核蛋白表达条带图；5C.细胞质蛋白表达条图（样本数为3,培养48 h后,与对照组比较,高糖组细胞SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均显著降低（P值分别为<0.001、0.006）；与高糖组比较,高黄芩苷组细胞SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均显著升高（P<0.001）；与高黄芩苷组比较,高黄芩苷+ML385组细胞SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均显著降低（P<0.001）。见图6。
图 6 蛋白质印迹法检测的4组小鼠成纤维细胞培养48 h后SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平。6A.条带图；6B.条图（样本数为3,3. 讨论
糖尿病创面具有发病率高、愈合缓慢、修复困难等特征,会严重影响患者的生活质量[1,18, 19, 20, 21]。糖尿病患者的高血糖会导致创面组织中活性氧过量生成[22, 23],脂质过氧化物堆积,而脂质过氧化的激活是细胞铁死亡的主要特征。研究表明,铁死亡与糖尿病创面的发生发展有密切联系[24, 25, 26]。有研究显示,给予大鼠糖尿病创面铁死亡抑制剂能够显著促进创面愈合[6]；另有研究者进一步证实,糖尿病大鼠创面组织中铁死亡相关指标明显上调,局部应用铁死亡抑制剂可加速糖尿病创面愈合[24]。橙皮素通过激活沉默信息调节因子2相关酶类3有效抑制血管内皮细胞和创面中铁死亡,促进糖尿病大鼠创面愈合[27]。上述研究结果表明,抑制铁死亡和减少脂质过氧化是促进糖尿病创面愈合的有效方案。
活性氧在诱导细胞氧化损伤中发挥重要作用。亚铁离子能够与过氧化氢在细胞内微酸性条件下经芬顿反应生成羟基自由基,过量的羟基自由基能促使磷脂等发生氧化,形成脂质过氧化物,包括丙二醛等[28, 29]。而发生脂质过氧化和铁死亡的细胞的细胞膜被破坏,胞内亚铁离子水平进一步升高,铁离子代谢紊乱,加剧铁死亡,导致细胞存活率降低[30, 31]。因此,活性氧、丙二醛和亚铁离子水平升高是铁死亡的主要表现。SLC7A11/GPX4轴是铁死亡的关键通路,参与胞内谷胱甘肽合成、活性氧和丙二醛抑制,是铁死亡治疗的潜在靶点。SLC7A11为胱氨酸/谷氨酸逆向转运载体中的重链部分,能够促进细胞摄取胱氨酸和胞内的胱氨酸被还原成半胱氨酸,进一步形成谷胱甘肽。GPX4能够将谷胱甘肽氧化为氧化型谷胱甘肽,并将有毒的磷脂过氧化物还原为无毒的脂质醇类,减少铁依赖性脂质活性氧的生成,从而减轻细胞损伤。
本研究选用高糖培养基模拟糖尿病创面病理微环境,检测高糖处理的Fb的存活率及铁死亡特征指标。结果显示,高糖处理的细胞存活率降低,细胞谷胱甘肽水平、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均显著降低,活性氧、丙二醛和亚铁离子水平均显著升高,表明高糖微环境能抑制细胞的SLC7A11/GPX4轴,进而降低胞内抗氧化能力,导致脂质活性氧调节异常及细胞存活率降低。这表明高糖可能是糖尿病创面发生铁死亡的诱因,可能与高糖微环境抑制SLC7A11/GPX4轴有关。
因黄芩苷结构式中的酚羟基,黄芩苷能终止自由基链式反应[32],发挥优秀的抗氧化功能。此外,黄芩苷还能调节小鼠机体氧化还原平衡[33]。多项研究表明,黄芩苷能够诱导细胞的Nrf2发生核位移[34, 35, 36]。Nrf2通路为机体内源性抗氧化途径,能够促进多种抗氧化相关基因转录,提高细胞抗氧化性能,发挥对细胞的保护作用[36]。因此,Nrf2通路的激活与黄芩苷发挥抗氧化活性密切相关[37]。黄芩苷可以通过激活Nrf2介导的抗氧化信号通路减轻多种疾病[37, 38],如糖尿病导致的肾病[39, 40, 41, 42]和主动脉血管内皮细胞损伤[43]、脂多糖诱导的血脑屏障破坏[44]及乙醇诱导的肝脏炎症[38,45]等的氧化应激和炎症。此外,黄芩苷能够上调多种活性细胞因子的表达、促进血管生成、抑制炎症细胞浸润,从而促进糖尿病大鼠创面愈合[46]。尽管黄芩苷对糖尿病创面等多种糖尿病并发症表现出良好的治疗作用,但黄芩苷是否能够改善糖尿病创面的Fb功能障碍及其潜在的生物学机制目前仍不清楚。
为了验证黄芩苷是否能够改善高糖处理诱导的Fb铁死亡,本研究选用不同浓度的黄芩苷对Fb进行预处理,然后进行高糖处理,检测细胞存活率和铁死亡相关特征指标的水平。结果显示,黄芩苷能显著改善高糖处理后细胞的存活率,提高细胞谷胱甘肽水平,逆转SLC7A11和GPX4代谢紊乱,降低胞内活性氧、丙二醛和亚铁离子水平。这表明黄芩苷具有改善高糖微环境诱导的细胞铁死亡的作用,这可能与黄芩苷改善SLC7A11/GPX4轴有关。SLC7A11和GPX4是受Nrf2调控的铁死亡相关通路的主要靶蛋白,激活后的Nrf2从Kelch样ECH关联蛋白1-Nrf2复合物解离并进入细胞核,参与SLC7A11和GPX4的转录和翻译,促进谷胱甘肽形成和脂质过氧化物清除,提高细胞的抗氧化和抗铁死亡能力。在细胞生理状态下,内部氧化还原处于平衡状态,生成的少量脂质过氧化物能够被Nrf2所调控的SLC7A11/GPX4抗氧化通路快速清除,维持细胞健康。因此,本研究还检测了黄芩苷对高糖处理的细胞Nrf2信号通路的激活作用,在采用蛋白质印迹法检测相关蛋白表达时采用GAPDH、组蛋白H3这2个内参照证明细胞质或细胞核Nrf2提取成功,排除了非目标来源的Nrf2的干扰。结果显示,随着黄芩苷浓度提高,越来越多的Nrf2从Kelch样ECH关联蛋白1-Nrf2复合物中解离并进入细胞核,提示黄芩苷能使高糖处理的细胞Nrf2发生核位移,这可能与黄芩苷介导SLC7A11/GPX4轴上调,改善细胞铁死亡有关。
为了进一步验证黄芩苷是否经Nrf2信号通路发挥对SLC7A11/GPX4轴的调控和抗高糖处理的细胞铁死亡的作用,本研究选用Nrf2抑制剂ML385和高浓度黄芩苷同时预处理Fb,检测细胞SLC7A11/GPX4轴的变化。结果显示,黄芩苷处理能够上调高糖处理后细胞Nrf2信号通路,进而影响SLC7A11和GPX4蛋白表达水平而抑制细胞铁死亡的发生；而高黄芩苷和Nrf2抑制剂ML385同时处理的细胞发生少量Nrf2核位移,且SLC7A11和GPX4水平降低,说明ML385通过抑制Nrf2信号通路激活,抑制黄芩苷对高糖处理的细胞SLC7A11和GPX4的调节能力。上述结果提示黄芩苷通过激活Nrf2信号通路,改善细胞SLC7A11/GPX4轴。
综上,本研究通过体外模拟创面高糖微环境,成功诱导Fb发生铁死亡；证实黄芩苷可以通过激活Nrf2信号通路,上调高糖处理的Fb的SLC7A11/GPX4轴相关蛋白的表达,抑制细胞发生铁死亡,从而提高细胞存活率。这表明黄芩苷是治疗糖尿病足创面的潜在药物。创面愈合是一个复杂的过程,创面中的Fb与KC、血管内皮细胞、免疫细胞等进行相互作用。而创面中上皮细胞、表皮干细胞、间充质细胞在高糖环境下出现铁死亡的过程以及黄芩苷抑制相关细胞铁死亡的作用有待进一步研究。
龚政：实施研究、起草文章；张筱薇、李笑眉、殷志敏：实施研究、采集数据；白丽民、汪佳希、韩雨佳：分析/解释数据；徐双依、俞璐：统计分析、技术支持；徐刚：研究指导、论文修改、经费支持所有作者声明不存在利益冲突 -
参考文献
(46) [1] LiS,LiY,WuZ,et al.Diabetic ferroptosis plays an important role in triggering on inflammation in diabetic wound[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2021,321(4):E509-E520.DOI: 10.1152/ajpendo.00042.2021. [2] YangR,ZhouS,HuangJ,et al.The role of Q10 engineering mesenchymal stem cell-derived exosomes in inhibiting ferroptosis for diabetic wound healing[J/OL].Burns Trauma,2024,12:tkae054[2025-01-25]. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39600692/. DOI: 10.1093/burnst/tkae054. [3] LiuL,LiuD.Bioengineered mesenchymal stem cell-derived exosomes: emerging strategies for diabetic wound healing[J/OL].Burns Trauma,2024,12:tkae030[2025-01-25].https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39015252/. DOI: 10.1093/burnst/tkae030. [4] DingX,YangC,LiY,et al.Reshaped commensal wound microbiome via topical application of Calvatia gigantea extract contributes to faster diabetic wound healing[J/OL].Burns Trauma,2024,12:tkae037[2025-01-25]. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224840/. DOI: 10.1093/burnst/tkae037. [5] 林崴仪,戈成旺,唐枭伟,等.阿克曼嗜黏液菌外膜蛋白1100促进糖尿病大鼠创面愈合[J].组织工程与重建外科杂志,2023,19(4):358-365.DOI: 10.3969/j.issn.1673-0364.2023.04.005. [6] GaoSQ,ChangC,LiJJ,et al.Co-delivery of deferoxamine and hydroxysafflor yellow A to accelerate diabetic wound healing via enhanced angiogenesis[J].Drug Deliv,2018,25(1):1779-1789.DOI: 10.1080/10717544.2018.1513608. [7] 屠卓隆,林才. 姜黄素对糖尿病创面的促愈合作用及其机制研究进展[J]. 中华烧伤杂志,2021,37(4):391-394. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200224-00089. [8] HuSC,LanCE.High-glucose environment disturbs the physiologic functions of keratinocytes: focusing on diabetic wound healing[J].J Dermatol Sci,2016,84(2):121-127.DOI: 10.1016/j.jdermsci.2016.07.008. [9] 李媛媛,姚小玲,曲彦洁,等.中药通过干预铁死亡治疗帕金森病的机制研究进展[J].内科理论与实践,2024,19(5):351-356.DOI: 10.16138/j.1673-6087.2024.05.13. [10] JiangX,StockwellBR,ConradM.Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2021,22(4):266-282.DOI: 10.1038/s41580-020-00324-8. [11] BaiC,LiT,SunQ,et al.Protective effect of baicalin against severe burn-induced remote acute lung injury in rats[J].Mol Med Rep,2018,17(2):2689-2694.DOI: 10.3892/mmr.2017.8120. [12] ZhangHJ,LuoJZ,LanCL,et al.Baicalin protects against hepatocyte injury caused by aflatoxin B1 via the TP53-related ferroptosis pathway[J].Ecotoxicol Environ Saf,2024,281:116661.DOI: 10.1016/j.ecoenv.2024.116661. [13] ZhaoS,HuangM,YanL,et al.Exosomes derived from baicalin-pretreated mesenchymal stem cells alleviate hepatocyte ferroptosis after acute liver injury via the Keap1-NRF2 pathway[J].Oxid Med Cell Longev,2022,2022:8287227.DOI: 10.1155/2022/8287227. [14] ZhangX,HuangJ,ZhaoJ,et al.Exosome-mimetic vesicles derived from fibroblasts carrying matrine for wound healing[J/OL].Burns Trauma,2024,12:tkae015[2025-01-25]. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38752203/. DOI: 10.1093/burnst/tkae015. [15] ZhuY,RuanCX,WangJ,et al.High glucose inhibits the survival of HRMCs and its mechanism[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2022,26(16):5683-5688.DOI: 10.26355/eurrev_202208_29502. [16] 黄伟琨,徐秋艳,周婷.黄芩苷抑制脂多糖促巨噬细胞氧化应激损伤作用的研究[J].国际口腔医学杂志,2022,42(5):521-528.DOI: 10.7518/gjkq.2022080. [17] LiuX,MaY,LuoL,et al.Dihydroquercetin suppresses cigarette smoke induced ferroptosis in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease by activating Nrf2-mediated pathway[J].Phytomedicine,2022,96:153894.DOI: 10.1016/j.phymed.2021.153894. [18] 母义明,臧丽.干细胞——糖尿病治疗的新选择[J].解放军医学杂志,2015,40(7):515-518.DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.01. [19] 曹望北,高长有. 多功能水凝胶敷料治疗糖尿病致慢性创面的研究进展[J]. 中华烧伤杂志,2021,37(11):1090-1098.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20210715-00249. [20] 王一希,陈俊杰,岑瑛,等. 脂肪间充质干细胞外泌体促进糖尿病创面愈合的研究进展[J]. 中华烧伤与创面修复杂志,2022,38(5):491-495. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20210218-00057. [21] 彭源,卢毅飞,邓君,等. 氧化铜纳米酶对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面修复的作用及其机制[J]. 中华烧伤杂志,2020,36(12):1139-1148. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200929-00426. [22] WangQ,ZhuG,CaoX,et al.Blocking AGE-RAGE signaling improved functional disorders of macrophages in diabetic wound[J].J Diabetes Res,2017,2017:1428537.DOI: 10.1155/2017/1428537. [23] BanerjeeA,SinghP,SheikhPA,et al.Simultaneous regulation of AGE/RAGE signaling and MMP-9 expression by an immunomodulating hydrogel accelerates healing in diabetic wounds[J].Biomater Adv,2024,163:213937.DOI: 10.1016/j.bioadv.2024.213937. [24] 张玉 基于铁死亡通路探讨Ferrostatin-1对高糖环境下溃疡创面的修复作用及机制研究 天津 天津医科大学 2020 张玉. 基于铁死亡通路探讨Ferrostatin-1对高糖环境下溃疡创面的修复作用及机制研究[D]. 天津:天津医科大学,2020.
[25] 陈丽 富血小板血浆通过抑制铁死亡促进糖尿病溃疡修复 合肥 安徽医科大学 2023 陈丽. 富血小板血浆通过抑制铁死亡促进糖尿病溃疡修复[D]. 合肥:安徽医科大学,2023.
[26] 陆会平,党裔武,陈罡.铁死亡抑制蛋白1在人类疾病中的作用机制研究进展[J].解放军医学杂志,2021,46(7):731-736.DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2021.07.14. [27] YuX,LiuZ,YuY,et al.Hesperetin promotes diabetic wound healing by inhibiting ferroptosis through the activation of SIRT3[J].Phytother Res,2024,38(3):1478-1493.DOI: 10.1002/ptr.8121. [28] LiuJ,KangR,TangD.Signaling pathways and defense mechanisms of ferroptosis[J].FEBS J,2022,289(22):7038-7050.DOI: 10.1111/febs.16059. [29] RochetteL,DogonG,RigalE,et al.Lipid peroxidation and iron metabolism: two corner stones in the homeostasis control of ferroptosis[J].Int J Mol Sci,2022,24(1):449.DOI: 10.3390/ijms24010449. [30] HadianK,StockwellBR.SnapShot: ferroptosis[J].Cell,2020,181(5):1188-1188.e1.DOI: 10.1016/j.cell.2020.04.039. [31] StockwellBR,Friedmann AngeliJP,BayirH,et al.Ferroptosis: a regulated cell death nexus linking metabolism, redox biology, and disease[J].Cell,2017,171(2):273-285.DOI: 10.1016/j.cell.2017.09.021. [32] 曹盼,张樱山,魏学明,等.黄芩苷抗氧化作用机制研究进展[J].西部中医药,2021,34(2):134-137.DOI: 10.12174/j.issn.2096-9600.2021.02.36. [33] ShiL,HaoZ,ZhangS,et al.Baicalein and baicalin alleviate acetaminophen-induced liver injury by activating Nrf2 antioxidative pathway: the involvement of ERK1/2 and PKC[J].Biochem Pharmacol,2018,150:9-23.DOI: 10.1016/j.bcp.2018.01.026. [34] WenRJ,DongX,ZhuangHW,et al.Baicalin induces ferroptosis in osteosarcomas through a novel Nrf2/xCT/GPX4 regulatory axis[J].Phytomedicine,2023,116:154881.DOI: 10.1016/j.phymed.2023.154881. [35] YuH,ChenB,RenQ.Baicalin relieves hypoxia-aroused H9c2 cell apoptosis by activating Nrf2/HO-1-mediated HIF1α/BNIP3 pathway[J].Artif Cells Nanomed Biotechnol,2019,47(1):3657-3663.DOI: 10.1080/21691401.2019.1657879. [36] ShiH,QiaoF,LuW,et al.Baicalin improved hepatic injury of NASH by regulating NRF2/HO-1/NRLP3 pathway[J].Eur J Pharmacol,2022,934:175270.DOI: 10.1016/j.ejphar.2022.175270. [37] LiH,CongX,YuW,et al.Baicalin inhibits oxidative injures of mouse uterine tissue induced by acute heat stress through activating the Keap1/Nrf2 signaling pathway[J].Res Vet Sci,2022,152:717-725.DOI: 10.1016/j.rvsc.2022.10.005. [38] SunYK,ZhangYF,XieL,et al.Progress in the treatment of drug-induced liver injury with natural products[J].Pharmacol Res,2022,183:106361.DOI: 10.1016/j.phrs.2022.106361. [39] MaL,WuF,ShaoQ,et al.Baicalin alleviates oxidative stress and inflammation in diabetic nephropathy via Nrf2 and MAPK signaling pathway[J].Drug Des Devel Ther,2021,15:3207-3221.DOI: 10.2147/DDDT.S319260. [40] 胡佳,张海霞,苏婉露,等.间充质干细胞对2型糖尿病小鼠糖尿病肾病进展的影响及其机制[J].解放军医学杂志,2023,48(4):383-393.DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2023.04.0383. [41] 刘兴梅,沈燕,班晓霞,等.PTEN对糖尿病肾病肾间质纤维化的作用及其机制[J].解放军医学杂志,2022,47(5):435-441.DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2022.05.0435. [42] 毕礼明,王朝晖. 糖尿病肾病发病机制研究进展[J]. 内科理论与实践,2023,18(3):201-205. DOI: 10.16138/j.1673-6087.2023.03.014. [43] ChenG,ChenX,NiuC,et al.Baicalin alleviates hyperglycemia-induced endothelial impairment 1 via Nrf2[J].J Endocrinol,2018:JOE-18-0457.R1.DOI: 10.1530/JOE-18-0457. [44] WangX,YuJY,SunY,et al.Baicalin protects LPS-induced blood-brain barrier damage and activates Nrf2-mediated antioxidant stress pathway[J].Int Immunopharmacol,2021,96:107725.DOI: 10.1016/j.intimp.2021.107725. [45] WangX,ChangX,ZhanH,et al.Curcumin and Baicalin ameliorate ethanol-induced liver oxidative damage via the Nrf2/HO-1 pathway[J].J Food Biochem,2020,44(10):e13425.DOI: 10.1111/jfbc.13425. [46] 施彦,易亮,张伟强,等.黄芩素对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制[J].中华烧伤与创面修复杂志,2024,40(11):1085-1094.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20231104-00179. -
图 1 4组小鼠成纤维细胞培养48 h后的活性氧水平 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯×100。1A、1B、1C、1D.分别为对照组、高糖组、低黄芩苷组、高黄芩苷组,图1B活性氧水平明显高于图1A、1C、1D,图1C活性氧水平明显高于图1D
注：对照组行常规培养,高糖组用终物质的量浓度30.0 mmol/L的葡萄糖处理,低黄芩苷组、高黄芩苷组分别用终物质的量浓度5、10 μmol/L的黄芩苷预处理后再同高糖组处理；绿色荧光表示活性氧
图 2 4组小鼠成纤维细胞培养48 h后的铁死亡相关指标的水平（
注：横坐标中1、2、3、4分别表示行常规培养的对照组,用终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖处理的高糖组及分别用终物质的量浓度5、10 μmol/L的黄芩苷预处理后再同高糖组处理的低黄芩苷组、高黄芩苷组；4组细胞活性氧、谷胱甘肽、丙二醛、亚铁离子水平总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为171.20、187.60、19.55、76.14,P<0.001）；与对照组比较,aP<0.05；与高糖组比较,bP<0.05；与低黄芩苷组比较,cP<0.05
图 3 蛋白质印迹法检测的4组小鼠成纤维细胞培养48 h后SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平。3A.条带图；3B.条图（样本数为3,
注：图3A条带上方和图3B横坐标1、2、3、4分别表示行常规培养的对照组,用终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖处理的高糖组及分别用终物质的量浓度5、10 μmol/L的黄芩苷预处理后再同高糖组处理的低黄芩苷组、高黄芩苷组；SLC7A11为溶质载体家族7成员11,GPX4为谷胱甘肽过氧化物酶4,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；4组细胞SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为88.77、49.32,P<0.001）；与对照组比较,aP<0.05；与高糖组比较,bP<0.05；与低黄芩苷组比较,cP<0.05
图 4 蛋白质印迹法检测的4组小鼠成纤维细胞培养48 h后细胞质和细胞核Nrf2的蛋白表达水平。4A.细胞质蛋白表达条带图；4B.细胞核蛋白表达条带图；4C.细胞质蛋白表达条图（样本数为3,
注：图4A、4B条带上方及图4C、4D横坐标1、2、3、4分别表示行常规培养的对照组,用终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖处理的高糖组及分别用终物质的量浓度5、10 μmol/L的黄芩苷预处理后再同高糖组处理的低黄芩苷组、高黄芩苷组；Nrf2为核转录因子红系2相关因子2,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；4组细胞的细胞质和细胞核Nrf2的蛋白表达水平总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为41.96、356.90,P<0.001）；与对照组比较,aP<0.05；与高糖组比较,bP<0.05；与低黄芩苷组比较,cP<0.05
图 5 蛋白质印迹法检测的4组小鼠成纤维细胞培养48 h后细胞质和细胞核Nrf2的蛋白表达水平。5A.细胞质蛋白表达条带图；5B.细胞核蛋白表达条带图；5C.细胞质蛋白表达条图（样本数为3,
注：图5A、5B条带上方及图5C、5D横坐标1、2、3、4分别表示行常规培养的对照组,用终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖处理的高糖组及分别用终物质的量浓度10 μmol/L黄芩苷、终物质的量浓度均为10 μmol/L的黄芩苷和ML385预处理后同高糖组处理的高黄芩苷组、高黄芩苷+ML385组；Nrf2为核转录因子红系2相关因子2,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；4组细胞的细胞质和细胞核Nrf2的蛋白表达水平总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为151.10、154.40,P<0.001）；与对照组比较,aP<0.05；与高糖组比较,bP<0.05；与高黄芩苷组比较,cP<0.05
图 6 蛋白质印迹法检测的4组小鼠成纤维细胞培养48 h后SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平。6A.条带图；6B.条图（样本数为3,
注：图6A条带上方及图6B横坐标1、2、3、4分别表示行常规培养的对照组,用终物质的量浓度30.0 mmol/L葡萄糖处理的高糖组及分别用终物质的量浓度为10 μmol/L黄芩苷、终物质的量浓度均为10 μmol/L的黄芩苷和ML385预处理后同高糖组处理的高黄芩苷组、高黄芩苷+ML385组；SLC7A11为溶质载体家族7成员11,GPX4为谷胱甘肽过氧化物酶4,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；4组细胞SLC7A11和GPX4的蛋白表达水平总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为68.02、43.06,P<0.001）；与对照组比较,aP<0.05；与高糖组比较,bP<0.05；与高黄芩苷组比较,cP<0.05
-
下载:
下载:
计量
- 文章访问数: 48
- HTML全文浏览量: 10
- PDF下载量: 1
- 被引次数: 0
