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(1)证实动态对比增强磁共振成像能精准地评估兔肢体高压电烧伤后早期骨骼肌微循环灌注变化。

(2)证实兔肢体高压电烧伤后骨骼肌组织K^trans值和K_ep值变化基本一致,均呈先升高后降低的趋势,且均在伤后24.0 h达到峰值。

(3)证实电烧伤兔伤后0.5~72.0 h骨骼肌组织K^trans值和K_ep值均与微血管密度呈显著正相关。

Highlights:

(1)It was confirmed that dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging could accurately assess the changes in microcirculatory perfusion of skeletal muscle tissue in rabbit limbs in the early stage after high-voltage electric burns.

(2)It was confirmed that the changes in K^trans and K_ep values of skeletal muscle tissue in rabbit limbs were basically consistent after high-voltage electric burns, showing a trend of increasing first and then decreasing, with both reached the peak value at 24.0 h post injury.

(3)It was confirmed that the K^trans and K_ep values of skeletal muscle tissue in rabbits with electric burns were significantly positively correlated with microvascular density at 0.5 to 72.0 h post injury.

微循环障碍是肢体高压电烧伤后骨骼肌进行性损伤的重要因素之一^[1]。研究表明,肢体高压电烧伤后骨骼肌毛细血管网及内皮细胞功能紊乱、微血管屏障损伤、毛细血管通透性增高、进行性血栓形成等改变可加重肢体损伤,引起骨骼肌进行性坏死^{[2, 3]}。肢体高压电烧伤后骨骼肌进行性坏死会加重患者感染风险和心肾功能负担,准确评估肌肉活性、早期准确清创（避免过度清创或多次手术清创）是治疗高压电烧伤的关键^{[4, 5, 6]}。无创定量评估微血管通透性及微结构变化对于了解高压电烧伤患者骨骼肌损伤的病理生理机制及其疗效评估都有着重要意义。目前临床缺乏无创定量评估高压电烧伤肢体微循环的检查方法^[7]。

动态对比增强磁共振成像（dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging,DCE-MRI）能无创监测器官终末血流灌注变化,其常用参数容量转移常数K^trans值及速率常数K_ep值可定量反映骨骼肌组织微血管通透性及血流灌注^[8]。研究表明,DCE-MRI可用于评估正常骨骼肌微循环灌注情况^[9],也可用于监测由栓塞或糖尿病等引起的骨骼肌微循环灌注不足等问题^{[10, 11]},也是诊断早期骨骼肌失神经损伤的敏感方法^[12]。本研究旨在探讨DCE-MRI的定量参数用于监测兔肢体高压电烧伤后早期骨骼肌微循环灌注变化的可行性。

1.   材料与方法

本实验研究经武汉市第三医院动物伦理委员会审查通过,批号：武三医实伦SY2022-052。

1.1   动物及主要试剂与仪器来源

32只健康清洁级6~8个月龄雄性大耳白兔,空腹体重2.3~2.7 kg,由湖北逸挚诚生物科技有限公司提供,许可证号：SCXK（鄂）2021-0020。40 g/L多聚甲醛购自厦门安永博科技有限公司,HE染液购自武汉百仟度生物科技有限公司,牛血清白蛋白购自丹麦DAKO公司,兔源性CD31多克隆抗体购自英国Abcam公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体购自美国SeraCare公司,二氨基联苯胺试剂盒购自江苏世泰实验器材有限公司。614-B3Ⅱ型高压电击设备及电极片购自苏州电工仪器厂,Discovery MR750 Plus型3.0 T超导磁共振成像仪和钆双胺购自美国通用电气医疗集团,JJ-12J型脱水机和JB-P5型包埋机购自武汉俊杰电子有限公司,RM2016病理切片机购自上海徕卡仪器有限公司,NIKON ECLIPSE CI型光学显微镜和NIKON DS-U3型成像系统购自日本尼康公司。

1.2   兔肢体高压电烧伤模型的建立

将32只兔适应性饲养1周,禁食水8 h后,采用随机数字表法将兔分为电烧伤组（20只）、对照组（12只）。对所有兔按照1.3 mL/kg经耳缘静脉注射30 g/L戊巴比妥钠溶液进行麻醉。麻醉后仰卧位固定,剃除右后肢及臀部兔毛。将大小为0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的小电极片置于右小腿踝上约1 cm的内侧腓肠肌处皮肤上,将大小3.0 cm×3.0 cm×0.1 cm的大电极片置于同侧腹股沟区股内侧肌处皮肤上,2个电极片均为方形铜片,间距约10 cm,用绝缘胶带分别固定、封闭2个电极片。连接自制高压电击设备,调节变压装置,将电压设定为2 kV。电烧伤组兔右下肢正常通电0.1 s制备电烧伤模型,对照组兔切断电源后进行相同操作致假伤。由2位具有8年影像诊断经验的主治医师观察判断电烧伤组兔电极处烧伤深度,深Ⅱ度及以上烧伤视为造模成功^[13]。32只兔均成功造模。

1.3   磁共振成像检查

伤后0.5、24.0、48.0、72.0 h,每个时间点取5只电烧伤组兔及3只对照组兔,对肢体进行磁共振扫描。同前麻醉兔后将其固定于磁共振成像仪,选用12通道软线圈,以兔膝关节为中心行膝关节轴位快速自旋回波T₁加权成像、轴位快速自旋回波T₂加权成像及DCE-MRI扫描。轴位快速自旋回波T₁加权成像扫描参数：重复时间414 ms,回波时间120 ms,扫描层厚3.0 mm,视野16 cm×16 cm,矩阵320×288,激励次数1.00次,扫描时间77 s。轴位快速自旋回波T₂加权成像扫描参数：重复时间2 200 ms,回波时间 120 ms,扫描层厚3.0 mm,视野16 cm×16 cm,矩阵320×288,激励次数1.00次,扫描时间90 s。DCE-MRI扫描采用肝脏容积加速采集成像（liver acquisition with volume acceleration,LAVA）序列,首先行多翻转角LAVA序列扫描,扫描参数：重复时间5.6 ms,回波时间2.0 ms,扫描层厚3.0 mm,视野20 cm×20 cm,矩阵260×192,翻转角为9°及12°,每个多翻转角序列扫描1个时相,每个时相约10 s。随后行动态增强LAVA序列扫描,除翻转角为10°外,其余参数与多翻转角LAVA序列扫描相同,连续无间隔扫描45个时相,扫描持续时间为449 s。在扫描3个时相之后经兔耳缘静脉团注0.5 mmol/mL钆双胺,注射剂量为0.2 mmol/kg,注射速度为1.0 mL/s,随后用相同速度注射生理盐水1.0 mL冲管。

1.4   DCE-MRI定量灌注参数测定

将DCE-MRI原始数据导入Omni-Kinetics软件（美国GE Healthcare公司）进行分析。首先对45期增强LAVA序列图像进行三维非刚性运动校正,以降低运动伪影；然后导入2个翻转角（9°和12°）LAVA序列图像,用于纵向弛豫时间的计算；再将校正后的45期增强LAVA序列图像导入。选择左后肢股内侧肌群（股薄肌、内收肌）的血流动力学模型作为相对参考模型,拟合该侧肢体正常肌肉的对比剂时间-浓度曲线作为右后肢损伤肌肉（股薄肌、内收肌）的动脉输入函数。对比常规扫描图像,在损伤区域中点,避开气体及坏死、出血区,手动勾画面积30~50 mm²的圆形感兴趣区,采用merge功能自动计算出容量转移常数K^trans值、速率常数K_ep值。重复测量3次,结果取均值。电烧伤组样本数为5,对照组样本数为3（下同）。

1.5   组织病理学检查

1.5.1   标本采集及切片制备

完成DCE-MRI检查后,采用耳缘静脉空气栓塞法处死兔,迅速取电烧伤组兔伤后0.5、24.0、48.0、72.0 h及对照组兔伤后0.5 h的骨骼肌（股薄肌、内收肌）组织,将肌肉置于40 g/L多聚甲醛中固定,常温保存备用。取固定24 h以上的骨骼肌组织标本,于脱水机内进行梯度乙醇脱水、浸蜡、包埋,垂直肌纤维走行制作厚4 μm的石蜡切片。

1.5.2   HE染色

取切片,行HE染色。在光学显微镜200倍放大倍数下观察骨骼肌组织损伤情况并拍片,采用Image Pro-plus 6.0软件（美国国立卫生研究院）对图像进行分析。

1.5.3   免疫组织化学检测

取切片,行免疫组织化学检测,一抗为兔源性CD31多克隆抗体（稀释比为1∶1 000）,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶500）,行二氨基联苯胺显色及苏木精复染,同1.5.2于光学显微镜下观察微血管情况（阳性染色为棕色,任何与邻近血管及其他结缔组织分离的棕黄色内皮细胞团可作为单根微血管）及软件分析。选取每张切片4个独立的相同面积区域,统计微血管数目,并计算微血管密度（microvascular density,MVD）。MVD=区域内微血管数÷区域面积。

1.6   统计学处理

采用SPSS 27.0统计软件进行数据分析。所有计量资料数据均符合正态分布,以x¯±s表示。组间总体比较行析因设计方差分析,组间两两比较行独立样本t检验。采用Pearson相关分析评估电烧伤组兔伤后0.5~72.0 h骨骼肌组织K^trans值、K_ep值与MVD的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   DCE-MRI定量灌注参数

电烧伤组兔骨骼肌组织K^trans值和K_ep值均在伤后0.5~72.0 h呈先升高后降低的趋势,且在伤后24.0 h达到峰值。电烧伤组兔伤后0.5、24.0、48.0、72.0 h骨骼肌组织K^trans值及伤后0.5、24.0、48.0 h骨骼肌组织K_ep值均明显高于对照组（P<0.05）。见图1、表1。

图  1  2组兔伤后24.0 h右下肢骨骼肌组织DCE-MRI检测情况。1A、1B、1C.分别为对照组增强快速自旋回波T₁加权成像及K^trans值、K_ep值图像；1D、1E、1F.分别为电烧伤组增强快速自旋回波T₁加权成像及K^trans值、K_ep值图像,图1E中K^trans值和图1F中K_ep值分别高于图1B、1C

注：电烧伤组兔右下肢致高压电烧伤,对照组兔右下肢致假伤；DCE-MRI为动态对比增强磁共振成像；1A和1D中红色区域为感兴趣区；1B、1C和1E、1F右侧的色柱为比色卡,可根据颜色大致判断灌注参数大小,越接近红色代表灌注参数越大

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Table  1.  2组兔伤后各时间点右下肢骨骼肌组织DCE-MRI定量灌注参数比较(min^-1,x¯±s)

组别与指标	样本数	0.5 h	24.0 h	48.0 h	72.0 h
电烧伤组	5
Ktrans值		5.779±0.558	8.255±0.861	4.869±0.233	2.937±0.122
Kep值		2.226±0.602	3.994±0.922	1.882±0.519	0.315±0.083
对照组	3
Ktrans值		0.518±0.054	0.595±0.050	0.595±0.033	0.633±0.029
Kep值		0.272±0.114	0.245±0.038	0.296±0.013	0.327±0.187
t1值		-15.77	-14.91	-40.35	-40.25
P1值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
t2值		-5.39	-6.82	-6.83	0.13
P2值		0.002	<0.001	0.002	0.903
注：电烧伤组兔右下肢致高压电烧伤,对照组兔右下肢致假伤；DCE-MRI为动态对比增强磁共振成像；Ktrans值、Kep值处理因素主效应,F值分别为949.69、98.30,P值均<0.001；时间因素主效应,F值分别为47.95、16.15,P值均<0.001；两者交互作用,F值分别为49.55、17.69,P值均<0.001；t1值、P1值及t2值、P2值分别为2组间各时间点Ktrans值、Kep值比较所得

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2.2   骨骼肌组织损伤情况

与对照组相比,电烧伤组兔伤后0.5~72.0 h骨骼肌组织中肌细胞间距增宽,伴广泛肌纤维断裂、溶解,胞质见空泡形成,肌纤维周围炎症细胞浸润,可见出血,血管内可见淤血。随着伤后时间的延长,电烧伤组兔骨骼肌纤维变性、坏死范围扩大,骨骼肌纤维周围炎症细胞数量增多。见图 2。

图  2  对照组兔伤后 0.5 h及电烧伤组兔伤后各时间点右下肢骨骼肌组织损伤情况 苏木精-伊红×200。2A.对照组伤后0.5 h,骨骼肌细胞结构完整、排列紧密；2B、2C、2D、2E.分别为电烧伤组伤后0.5、24.0、48.0、72.0 h,随着伤后时间的延长,骨骼肌纤维变性、坏死范围扩大,骨骼肌纤维周围炎症细胞数量增多

注：电烧伤组兔右下肢致高压电烧伤,对照组兔右下肢致假伤

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2.3   MVD

电烧伤组兔伤后0.5~72.0 h骨骼肌组织中肌细胞裂解、坏死逐渐增多,微血管数量逐渐减少。对照组兔伤后0.5 h及电烧伤组兔伤后0.5、24.0、48.0、72.0 h骨骼肌组织中MVD分别为（24.7±3.5）、（21.8±2.2）、（40.8±9.1）、（16.4±2.4）、（9.8±0.8）根/mm²。电烧伤组兔伤后24.0 h骨骼肌组织中MVD明显高于对照组伤后0.5 h（t=2.89,P=0.028）,伤后48.0、72.0 h骨骼肌组织中MVD均明显低于对照组伤后0.5 h（t值分别为4.01、9.52,P值分别为0.007、<0.001）；2组兔伤后0.5 h骨骼肌组织MVD比较,差异无统计学意义（t=1.46,P=0.195）。见图 3。

图  3  对照组兔伤后 0.5 h及电烧伤组兔伤后各时间点右下肢骨骼肌组织中微血管情况 辣根过氧化物酶-二氨基联苯胺×200。3A.对照组伤后0.5 h；3B、3C、3D、3E.分别为电烧伤组伤后0.5、24.0、48.0、72.0 h,图3C微血管数量多于图3B、3D、3E

注：电烧伤组兔右下肢致高压电烧伤,对照组兔右下肢致假伤；血管内皮细胞染色为棕色,细胞核染色为蓝色

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2.4   电烧伤组兔DCE-MRI灌注参数与MVD的相关性

电烧伤组兔伤后0.5~72.0 h骨骼肌组织中K^trans值及K_ep值均与MVD呈显著正相关（r值均为0.95,P值均<0.001）。

3.   讨论

目前已知的肢体高压电烧伤影像学检查各有优点和不足^{[14, 15, 16]},但均不能做到动态监测及定量评估。能检测骨骼肌微血管通透性的影像学技术众多,但大多不适用于肢体高压电烧伤后的检查。双光子激光扫描显微镜成像是一种荧光成像技术,可以对活体组织进行深度约1 mm的扫描成像,具有无创、分辨率高及能实时动态监测的优点,能在细胞或分子水平观察肌肉通透性,但其成像视野和深度均较小,只适合小范围、局部高分辨率成像,不能对大范围或者深部的肌肉组织进行检测^{[17, 18]}。超声造影是在常规超声检查的基础上,通过静脉注射超声造影剂,利用血液中造影剂气体微泡来增强组织内微血管的显影,能实时动态地观察正常组织和病变组织的血流灌注情况。超声造影适合快速、实时地评估局部血流和组织灌注情况,能无创、实时动态成像,但其分辨率及组织穿透能力有限,且成像结果高度依赖操作者技术,难以做到定量分析^{[19, 20, 21]}。正电子发射断层成像是一种功能性影像技术,通过检测体内放射性示踪剂的分布来显示组织代谢和功能信息,适合全身或大范围的组织代谢、血流灌注和血管通透性的定量分析。它能够提供肌肉代谢的动态信息,但空间分辨率较低、时间分辨率也不高,且涉及放射性示踪剂的使用,具有辐射暴露的风险,不适合重复检查^{[22, 23, 24]}。而DCE-MRI具有组织分辨率高、无创、无辐射、检查范围广、能定量评估的优点^{[25, 26, 27, 28]}。

DCE-MRI是通过静脉团注对比剂,运用快速自旋回波T₁加权成像行多期动态增强扫描,获取感兴趣区时间-信号强度曲线,再通过血流动力学模型分析,得到感兴趣区血流灌注及血管通透性的定量参数^[29]。容量转移常数K^trans值为单位时间内对比剂由血液渗透到组织间隙的转运系数,K^trans值主要和微循环血流量、毛细血管表面积、血管内皮通透性有关,K^trans值越大表示微血管灌注和通透性越大；速率常数K_ep值为单位时间对比剂由组织间隙渗透到血管的转运系数,与毛细血管通透性有关。K^trans值、K_ep值均可作为微循环灌注的指标^[8]。高压电流会导致肌肉、血管等组织的直接损伤,使微血管屏障受损、血管通透性增大及血管内皮细胞肿胀、破坏,导致血管狭窄、闭塞或断裂^[14,30]。高压电烧伤引起的骨骼肌等组织水肿会发展为骨筋膜室综合征,高压电烧伤导致的血管变性和血栓形成会进一步加剧组织的缺血性坏死,进而影响血流灌注^{[31, 32, 33]}。氧化应激反应及炎症反应等因素亦可影响物质通过内皮屏障时的跨细胞途径和细胞旁途径,导致微血管屏障受损^[34]。这些高压电烧伤早期出现的典型病理变化导致包括骨骼肌在内的多种组织微血管床灌注改变^[30]。而血流灌注的变化与组织进行性坏死、机体低血容量性休克和晚期多器官衰竭相关^[35]。

DCE-MRI检查技术已经被广泛应用于临床肿瘤^[36]、运动损伤^[37]、微循环障碍^[38]等疾病的组织血流灌注及血管通透性评估中。本研究将DCE-MRI用于评估兔肢体高压电烧伤后早期骨骼肌微循环变化,结果显示电烧伤组兔伤后0.5、24.0、48.0、72.0 h骨骼肌组织K^trans值及伤后0.5、24.0、48.0 h骨骼肌组织K_ep值均明显高于对照组,而伤后48.0、72.0 h骨骼肌组织中MVD均明显低于对照组伤后0.5 h。电烧伤组兔伤后0.5 h骨骼肌组织中MVD较对照组无明显改变,但此时K^trans值及K_ep值均明显升高,表明电烧伤组兔血管通透性增高,提示高压电烧伤后损伤及水肿的骨骼肌微血管屏障受损,这与Chi等^[34]研究结果相符。兔肢体高压电烧伤后骨骼肌组织K^trans值、K_ep值、MVD变化基本一致,均呈先升高后降低的趋势,且均在伤后24.0 h达到峰值。本研究团队推测这可能与电烧伤后血管进行性损伤和微血管血栓形成有关,与以往研究结果^[39]一致。电烧伤组兔伤后0.5 h骨骼肌组织K^trans值及K_ep值均低于组内伤后24.0 h,其原因可能是高压电刺激后短期内微血管发生强烈的痉挛收缩^[40],虽然高压电导致血管通透性增高,但伤后0.5 h时微血管直径明显小于其他时间点；另外,血管内皮细胞肿胀,导致血管闭塞,组织血流灌注量相对减少；而伤后24.0 h时已无电刺激,微血管恢复扩张状态,因此组织血流灌注量相对增加。由于CD31也在巨噬细胞及血小板上高表达,电刺激造成的血管内皮细胞损伤致血小板和单核细胞在管壁内聚集,考虑这是导致电烧伤组兔伤后24.0 h的MVD高于伤后0.5 h的影响因素。电烧伤组与对照组兔伤后72.0 h骨骼肌组织K_ep值无明显差异,可能是因为伤后72.0 h骨骼肌组织坏死范围基本固定^[41],骨骼肌损伤情况趋于稳定,损伤区域血流灌注情况接近正常骨骼肌。本研究结果显示,电烧伤组兔伤后0.5~72.0 h骨骼肌组织中K^trans值、K_ep值均与MVD呈显著正相关,说明DCE-MRI定量灌注参数K^trans值、K_ep值可有效反映高压电烧伤后早期骨骼肌组织微循环灌注变化情况。

综上所述,DCE-MRI定量灌注参数K^trans值及K_ep值可以有效反映肢体高压电烧伤后早期骨骼肌微循环灌注进行性变化情况,并能为高压电烧伤的早期治疗及疗效观察提供依据。本研究存在以下不足：（1）样本量小,仅分析高压电烧伤早期骨骼肌损伤情况。（2）仅对电烧伤兔微血管数量做了定量研究；而对微血管通透性只做了定性描述,缺乏对血管通透性的定量研究。（3）仅进行了高压电烧伤后骨骼肌血流灌注情况的动物实验,本研究团队后续将开展临床研究,以进一步验证DCE-MRI评估肢体高压电烧伤骨骼肌血流灌注变化的效果。