Effect and mechanism of Andrias davidianus skin mucopolysaccharides on full-thickness skin defect wound healing in diabetic mice
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摘要:
目的 探讨大鲵皮肤黏液多糖（以下简称大鲵黏多糖）对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的作用及其机制。 方法 该研究为实验研究。自制多糖含量为（70.0±0.3）%的大鲵黏多糖；采用细胞计数试剂盒-8检测人脐静脉内皮细胞（HUVEC）活力显示,大鲵黏多糖的最佳作用浓度为0.05 mg/mL。取HUVEC,按照随机数字表法（分组方法下同）分为空白对照组、血管内皮生长因子（VEGF）组、大鲵黏多糖组,分别添加常规培养基和含50 ng/mL VEGF、0.05 mg/mL大鲵黏多糖的培养基后置于低氧（氧气的体积分数为5%）和正常氧环境下培养。培养12 h后,观测HUVEC的成管长度。取人单核细胞白血病细胞,用佛波酯诱导分化为M0型巨噬细胞后分为空白对照组、内毒素/脂多糖（LPS）组、大鲵黏多糖组,分别采用常规培养基、含LPS培养基序贯常规培养基、含LPS培养基序贯含0.05 mg/mL的大鲵黏多糖培养基进行培养。培养48 h后,采用免疫荧光法检测细胞中CD86和CD206蛋白的表达（以相对荧光强度表示,下同）情况,采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中精氨酸酶-1（Arg1）和CD206的mRNA表达情况。取18只8~10周龄雄性C57小鼠,采用链脲佐菌素联合高糖高脂饲料成功构建糖尿病模型,在其背部制作全层皮肤缺损创面并分为空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵黏多糖组,每组6只,分别应用生理盐水、藻酸盐敷料和大鲵黏多糖处理创面。伤后3、7、10、14 d,观测小鼠创面愈合情况并计算创面愈合率。伤后7 d,采用免疫荧光法观测小鼠创面组织中CD31及CD206蛋白的表达情况。伤后14 d,采用苏木精-伊红染色观测小鼠创面肉芽组织厚度。所有实验的样本数为3。 结果 在正常氧环境下培养12 h后,与空白对照组相比,VEGF组和大鲵黏多糖组HUVEC的成管长度均显著增长（q值分别为10.08、16.91,P<0.05）。在低氧环境下培养12 h后,与空白对照组相比,VEGF组和大鲵黏多糖组HUVEC的成管长度均显著增长（q值分别为11.61、16.91,P<0.05）；与VEGF组相比,大鲵黏多糖组HUVEC的成管长度显著增长（q=5.30,P<0.05）。培养48 h后,大鲵黏多糖组M0型巨噬细胞中CD206蛋白的相对荧光强度为31.90±1.76,显著高于空白对照组的1.00±0.25和LPS组的2.21±0.42（q值分别为50.75、48.75,P值均<0.05）；CD86蛋白的相对荧光强度为5.82±0.63,显著低于LPS组的53.73±4.61（q=30.90,P<0.05）。培养48 h后,大鲵黏多糖组M0型巨噬细胞中Arg1和CD206的mRNA表达量均显著高于空白对照组（q值分别为35.02、13.09,P<0.05）以及LPS组（q值分别为32.24和11.24,P<0.05）。伤后3 d,空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵黏多糖组小鼠创面愈合率两两比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。与空白对照组相比,藻酸盐敷料组小鼠伤后10、14 d创面愈合率均显著升高（q值分别为11.76、12.50,P<0.05）,大鲵黏多糖组小鼠伤后7、10、14 d创面愈合率均显著升高（q值分别为5.84、15.90、14.96,P<0.05）。与藻酸盐敷料组比较,大鲵黏多糖组小鼠伤后7、10 d创面愈合率均显著升高（q值分别为4.77、4.14,P<0.05）。伤后7 d,藻酸盐敷料组和大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD31蛋白的相对荧光强度均显著强于空白对照组（q值分别为7.63、16.85,P<0.05）,大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD31蛋白的相对荧光强度显著强于藻酸盐敷料组（q=9.22,P<0.05）。伤后7 d,藻酸盐敷料组和大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD206蛋白的相对荧光强度均显著强于空白对照组（q值分别为8.76、29.36,P<0.05）,大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD206蛋白的相对荧光强度显著强于藻酸盐敷料组（q=20.61,P<0.05）。伤后14 d,与空白对照组和藻酸盐敷料组相比,大鲵黏多糖组小鼠创面肉芽组织更厚。 结论 大鲵黏多糖可通过提高HUVEC成管能力以及诱导巨噬细胞向M2型极化,显著增强新生血管生成能力和优化免疫微环境,从而加速糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合。 Abstract:Objective To explore the effect and mechanism of Andrias davidianus skin mucopolysaccharides (ASMP) on full-thickness skin defect wound healing in diabetic mice. Methods This study was an experimental study. The ASMP with polysaccharide content of (70.0±0.3)% was prepared; the proliferation activity of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was detected by cell counting kit-8, showing that the optimal concentration of ASMP was 0.05 mg/mL. The HUVECs were taken and divided into blank control group, vascular endothelial growth factor (VEGF) group, and ASMP group according to the random number table method (the same grouping method below), which were cultured with conventional medium and the media containing 50 ng/mL VEGF and 0.05 mg/mL ASMP, respectively, and then cultured under hypoxic (with volume fraction of oxygen being 5%) and normal-oxygen conditions for 12 hours, and the length of tube formation was observed. Human monocytic leukemia cells were induced with phorbol ester to differentiate into M0 macrophages. These cells were then divided into blank control group, lipopolysaccharide (LPS) group, and ASMP group, which were cultured respectively using conventional medium, LPS-containing medium followed by conventional medium, and LPS-containing medium followed by 0.05 mg/mL ASMP-containing medium. After 48 hours of culture, the expressions of CD86 and CD206 proteins (expressed as relative fluorescence intensity, the same below) were measured by immunofluorescence, and the mRNA expression levels of arginase-1 (Arg1) and CD206 were detected by real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. Eighteen male C57 mice aged 8-10 weeks were used, and diabetic model was successfully established using streptozotocin combined with a high-fat and high-sugar diet. Full-thickness skin defect wounds were created on the backs of the mice, and the mice were divided into blank control group, alginate dressing group, and ASMP group (with 6 mice in each group), which were treated with physiological saline, alginate dressing, and ASMP, respectively. Wound healing was observed on post injury day (PID) 3, 7, 10, and 14, and the wound healing rates of mice were calculated. On PID 7, the expressions of CD31 and CD206 proteins in the wound tissue of mice were observed by immunofluorescence. On PID 14, the thickness of granulation tissue in wounds of mice was observed by hematoxylin-eosin staining. The sample size for all experiments was 3. Results After 12 hours of culture in normal-oxygen condition, compared with that in blank control group, the tube formation length of HUVECs in VEGF and ASMP groups was significantly increased (with q values of 10.08 and 16.91, respectively, P<0.05). After 12 hours of culture in hypoxic condition, compared with that in blank control group, the tube formation length of HUVECs in VEGF and ASMP groups was significantly increased (with q values of 11.61 and 16.91, respectively, P<0.05); compared with that in VEGF group, the tube formation length of HUVECs in ASMP group was significantly increased (q=5.30, P<0.05). After 48 hours of culture, the relative fluorescence intensity of CD206 protein in M0 macrophages in ASMP group was 31.90±1.76, significantly higher than 1.00±0.25 in blank control group and 2.21±0.42 in LPS group (with q values of 50.75 and 48.75, respectively, both P values <0.05); the relative fluorescence intensity of CD86 protein was 5.82±0.63, significantly lower than 53.73±4.61 in LPS group (q=30.90, P<0.05). After 48 hours of culture, the mRNA expressions of Arg1 and CD206 in M0 macrophages in ASMP group were significantly higher than those in blank control group (with q values of 35.02 and 13.09, respectively, P<0.05) and LPS group (with q values of 32.24 and 11.24, respectively, P<0.05). On PID 3, there was no statistically significant difference in intercomparison in the wound healing rate of mice among the blank control, alginate dressing, and ASMP groups (P>0.05). Compared with those in blank control group, the wound healing rates of mice in alginate dressing group on PID 10 and 14 were significantly increased (with q values of 11.76 and 12.50, respectively, P<0.05), and the wound healing rates of mice in ASMP group on PID 7, 10, and 14 were significantly increased (with q values of 5.84, 15.90, and 14.96, respectively, P<0.05); compared with those in alginate dressing group, the wound healing rates of mice in ASMP group on PID 7 and 10 were significantly increased (with q values of 4.77 and 4.14, respectively, P<0.05). On PID 7, the relative fluorescence intensity of CD31 protein in wound tissue of mice in alginate dressing and ASMP groups was significantly stronger than that in blank control group (with q values of 7.63 and 16.85, respectively, P<0.05); the relative fluorescence intensity of CD31 protein in wound tissue of mice in ASMP group was significantly stronger than that in alginate dressing group (q=9.22, P<0.05). On PID 7, the relative fluorescence intensity of CD206 protein in wound tissue of mice in alginate dressing and ASMP groups was significantly stronger than that in blank control group (with q values of 8.76 and 29.36, respectively, P<0.05), and the relative fluorescence intensity of CD206 protein in wound tissue of mice in ASMP group was significantly stronger than that in alginate dressing group (q=20.61, P<0.05). On PID 14, the wound granulation tissue of mice in ASMP group was thicker compared with that in blank control group and alginate dressing group. Conclusions ASMP can significantly enhance the ability of new blood vessel formation and optimize the immune microenvironment by promoting HUVEC tube formation as well as inducing macrophages to polarize toward the M2 type, thereby accelerating full-thickness skin defect wound healing in diabetic mice. -
(1)提取大鲵皮肤黏液多糖,并验证了其在糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面中的促修复作用。
(2)揭示了大鲵皮肤黏液多糖可通过诱导M2型巨噬细胞极化和提高人脐静脉内皮细胞增殖、成管能力,优化糖尿病创面微环境,从而促进血管生成和组织再生的作用机制。
Highlights:
(1)Andrias davidianus skin mucopolysaccharide was extracted, and its promoting effect in repairing the full-thickness skin defect wounds in diabetic mice was verified.
(2)It was revealed that the Andrias davidianus skin mucopolysaccharide could promote angiogenesis and tissue regeneration by inducing the polarization of M2 macrophages, enhancing the proliferation and tube formation ability of human umbilical vein endothelial cells, and optimizing the microenvironment of diabetic wounds.
糖尿病创面是全球范围内的重大健康问题,复杂的病理机制导致其治疗难度大,严重影响患者生活质量,并显著增加医疗负担[1, 2]。实现该类创面的快速愈合和功能性皮肤再生是缩短住院时间和减少并发症发生的重要途径[3]。但目前的治疗效果有限,亟须开发新型高效材料或方法[4, 5]。血管生成是创面愈合的关键因素,其中内皮细胞为血管生成的直接效应细胞。血管内皮细胞可通过增殖、迁移和成管等参与新生血管的形成,直接影响营养和氧气的供给,从而决定创面的修复质量[6, 7]。此外,巨噬细胞在创面修复中起关键的调控作用,其表型的动态分化过程对创面的炎症消退、血管生成及组织再生至关重要[8, 9]。M2型巨噬细胞的促修复特性,主要通过分泌抗炎因子和上调内皮细胞活性来实现,这使其成为调控创面免疫微环境的重要靶点[10, 11]。近年来,许多天然高分子,如天然多糖、蛋白质和脂类,因具有多种生物活性逐渐成为研究热点[12, 13]。尤其是天然多糖,如透明质酸、壳聚糖因具有优异的生物相容性和生物活性,在促进血管生成、维持湿润环境、加速组织再生等方面表现出显著优势[14, 15, 16],已在创面修复领域得到广泛应用。
大鲵皮肤黏液是一种富含多糖的天然物质,具有良好的生物黏附性和免疫调节潜能。本团队前期研究显示,大鲵皮肤黏液可通过促进血管生成,加速大鼠创面修复,并提高修复质量[17]。然而,其具体作用机制尚需要深入研究；同时,该黏液在糖尿病创面修复中的应用也鲜见报道。因此,本研究提取并表征了大鲵皮肤黏液多糖（以下简称大鲵黏多糖）,旨在系统探讨其在糖尿病创面愈合中的作用机制,为糖尿病创面的治疗提供新的理论依据。
1. 材料与方法
本实验研究遵循陆军军医大学动物实验伦理委员会和国家有关实验动物管理和使用的规定。
1.1 动物、细胞及主要试剂与仪器来源
20只健康无特殊病原体级8~10周龄雄性C57小鼠购自陆军军医大学实验动物中心,许可证号：SCXK（军）2017-0024。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）株、人单核细胞白血病细胞购自美国菌种保藏中心。
中国大鲵皮肤黏液购于张家界鲵最珍贵生物科技有限公司。透析膜购自北京索莱宝科技有限公司,细胞计数试剂盒-8购自重庆葆光生物技术有限公司,佛波酯、链脲佐菌素、LPS购自美国Sigma公司,Matrigel基质胶购自美国Corning公司,人VEGF购自美国Peprotech公司,兔源性CD206多克隆抗体、兔源性CD31多克隆抗体、Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG抗体购自美国Abcam公司,兔源性CD86多克隆抗体购自美国eBioscience公司,Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体购自美国CST公司,细胞RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司,银离子藻酸盐敷料购自丹麦康乐保公司,实时荧光定量RT-PCR引物由北京六合华大基因公司设计、合成,去基因组DNA反转录试剂盒、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）、高糖高脂饲料购自美国Research Diet公司。
M2e型多波长酶标仪购自美国Molecular Devices公司,LSM780型激光扫描共聚焦显微镜购自德国Zeiss公司,CFX Connect型实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司,数字切片扫描仪购自宁波江丰生物信息技术有限公司。
1.2 大鲵黏多糖的制备与表征
用清水冲洗大鲵皮肤去除蜕皮,轻抓其背部促使皮肤分泌白色黏液[17]（由所购公司完成）。将黏液冷冻干燥,再用无水乙醇萃取12 h进行脱脂处理,并在50 ℃条件下烘干。将前述烘干后的70 g粉末溶于20 g/L的碱性蛋白酶去离子水中,在60 ℃、pH值8.5~9.0的条件下搅拌36 h。其间用6 mol/L氢氧化钠溶液维持pH值[18]。冷却至室温,用6 mol/L 氯化氢调整pH值至7.0。以3 000×g离心30 min,取上清液并缓慢加入50 g/L苄索氯铵溶液,至无沉淀生成。收集沉淀,用饱和氯化钠溶液溶解,随后用无水乙醇沉淀。收集沉淀,溶解于去离子水中,用透析膜在去离子水中透析72 h,每隔12 h更换透析液。将透析后的溶液冷冻干燥,获得白色大鲵黏多糖粉末。记录该粉末的制取过程及其物理特性。取大鲵黏多糖粉末,按文献[19]采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。样本数为3。
1.3 大鲵黏多糖对HUVEC增殖和成管的影响
1.3.1 大鲵黏多糖对细胞活力的影响
取大鲵黏多糖粉末,溶解于DMEM培养液中,配制4 mg/mL的大鲵黏多糖母液。用含体积分数10%胎牛血清及常规浓度青霉素/链霉素的DMEM培养液（以下简称DMEM完全培养基）将前述样品稀释成0（不含）、0.01、0.05、0.10 mg/mL的大鲵黏多糖培养液,备用。取HUVEC,用DMEM完全培养基将细胞浓度调整至1×10⁵个/mL并接种于96孔板中,每孔100 µL,每组设3个重复孔。待细胞贴壁后,弃去原培养基,添加不同浓度的大鲵黏多糖培养液。常规培养22 h后,根据细胞计数试剂盒-8说明书,采用紫外分光光度计检测细胞在波长450 nm处的吸光度值,反映细胞活力。其中,将用0 mg/mL的大鲵黏多糖培养液培养的HUVEC的活力值设为100%。
1.3.2 大鲵黏多糖对HUVEC成管的影响
参照文献[20]评估HUVEC的血管生成能力。取HUVEC,用不含血清的DMEM培养液调整细胞浓度至2×10⁵个/mL并接种于预先涂有Matrigel基质胶的24孔板中,每孔300 µL。待细胞贴壁后将其按照随机数字表法（分组方法下同）分为空白对照组、VEGF组、大鲵黏多糖组,分别加入DMEM完全培养基和含50 ng/mL VEGF、0.05 mg/mL大鲵黏多糖的DMEM完全培养基置于低氧（氧气的体积分数为5%）和正常氧环境下培养。培养12 h后,在倒置荧光显微镜40倍放大倍数下观察HUVEC的成管情况,并使用ImageJ图像分析软件（美国国立卫生研究院）对成管长度进行量化分析。样本数为3。
1.4 大鲵黏多糖对巨噬细胞极化的影响
1.4.1 细胞诱导分化及分组处理
取人单核细胞白血病细胞,离心后用含体积分数10%胎牛血清和100 ng/mL佛波酯的RPMI-1640培养基进行悬浮。然后按照每孔5×105个细胞接种至6孔板中常规培养48 h,细胞被诱导分化为M0型巨噬细胞。将该细胞分为空白对照组、LPS组、大鲵黏多糖组,其中对空白对照组细胞仅采用含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（以下简称1640完全培养基）进行培养；对大鲵黏多糖组、LPS组细胞先用含200 ng/mL LPS的1640完全培养基培养24 h,然后分别用含0.05 mg/mL大鲵黏多糖的1640完全培养基和单纯1640完全培养基继续培养24 h。即分组培养48 h后,进行后续相关检测。
1.4.2 细胞中CD86和CD206蛋白的表达情况检测
取1.4.1中3组M0型巨噬细胞,常规进行免疫荧光染色,其中一抗为兔源性CD86多克隆抗体（稀释比为1∶50）、兔源性CD206多克隆抗体（稀释比为1∶1 000）,二抗分别为Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG抗体和Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体（稀释比均为1∶1 000）。用DAPI染细胞核后,在激光扫描共聚焦显微镜600倍放大倍数下观察CD86（阳性染色为红色）和CD206（阳性染色为绿色）的蛋白表达（以相对荧光强度表示,下同）情况。采用ImageJ图像分析软件对荧光强度进行定量分析[21],将空白对照组的结果设定为1,其余2组的蛋白表达量以其与空白对照组的比值表示。样本数为3。
1.4.3 细胞中精氨酸酶-1（arginase-1,Arg1）和CD206的mRNA表达情况检测
取1.4.1中3组M0型巨噬细胞,常规提取总RNA。然后用实时荧光定量RT-PCR法检测细胞中Arg1和CD206的mRNA表达。CD206上游引物：5'-GGGTTGCTATCACTCTCTATGC-3'、下游引物：5'-TTTCTTGTCTGTTGCCGTAGTT-3',产物大小为126 bp；Arg1上游引物：5'-CCCTGGGGAACACTACATTTTG-3'、下游引物：5'-GCCAATTCCTAGTCCTGTCCACTT-3',产物大小为79 bp；核糖体蛋白L13A上游引物：5'-GCCCTACGACAAGAAAAAGCG-3'、下游引物：5'-TACTTCCAGCCAACCTCGTGA-3',产物大小为117 bp。以核糖体蛋白L13A为内参照,基于Δ循环阈值定量分析Arg1和CD206的mRNA相对表达。将空白对照组的结果设定为1,其余2组的mRNA表达量以其与空白对照组的比值表示。样本数为3。
1.5 大鲵黏多糖对糖尿病小鼠创面愈合的影响
1.5.1 动物建模及分组
取20只C57小鼠,根据文献[22]采用链脲佐菌素联合高糖高脂饲料构建糖尿病模型小鼠。当小鼠血糖浓度连续2周≥16.7 mmol/L时,认为建模成功。2只小鼠不符合糖尿病判定标准,不纳入后续研究。将18只糖尿病小鼠采用1 g/L戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉,然后在小鼠背部对称位置,使用直径为6 mm的无菌皮肤打孔器制作全层皮肤缺损创面。为防止创面自然闭合,使用内径为9 mm、外径为11 mm的橡胶夹板固定[23, 24]。将小鼠分为空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵黏多糖组,每组6只,分别应用20 mL生理盐水、20 mg藻酸盐敷料和20 mg大鲵黏多糖（质量浓度为0.05 mg/mL）处理创面。
1.5.2 小鼠创面愈合及血管生成与肉芽组织厚度等情况的检测
每组任意取3只小鼠,分别于伤后0（即刻）、3、7、10、14 d,用数码相机拍照并记录创面愈合情况,采用ImageJ图像分析软件测量3组小鼠创面愈合面积并计算伤后3、7、10、14 d创面愈合率。创面愈合率=（伤后0 d创面面积-伤后其他时间点创面面积）÷伤后0 d创面面积×100%。伤后14 d,于观察创面结束后处死小鼠,取创面组织,常规固定后制作厚度为5 μm的石蜡切片。常规行HE染色后,用数字切片扫描仪扫描,并在其配备的K-viewer图像分析软件上观察肉芽组织厚度[25]。
取每组剩余3只小鼠,于伤后7 d,采用免疫荧光法观测创面组织中新生血管特异性标志物CD31及M2型巨噬细胞表面标志物CD206蛋白的表达情况。其中一抗为兔源性CD31多克隆抗体（稀释比为1∶100）、兔源性CD206多克隆抗体（稀释比为1∶1 000）,二抗均为Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG抗体（稀释比为1∶1 000）。用DAPI染细胞核后,在激光扫描共聚焦显微镜200倍放大倍数下观察CD31和CD206蛋白（阳性染色均为红色）的荧光强度。将空白对照组的结果设定为1,其余2组的蛋白表达量以其与空白对照组的比值表示。样本数为3。
1.6 统计学处理
采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布,以
2. 结果
2.1 大鲵黏多糖的表征
冻干后的大鲵皮肤黏液呈黄色晶体状,去脂处理后形成白色粉末,再经透析后形成颜色微黄、具有良好水溶性和黏性的大鲵黏多糖。见图1。经测定,大鲵黏多糖的多糖含量为（70.0±0.3）%。
图 1 大鲵皮肤黏液多糖的制作过程。1A.物理刺激大鲵皮肤,产生黏液；1B.冻干后的大鲵皮肤黏液；1C.经去脂处理后的大鲵皮肤黏液,呈白色粉末状；1D.透析后的大鲵皮肤黏液多糖粉末颜色微黄2.2 大鲵黏多糖对HUVEC活力的影响
培养22 h后,用0、0.01、0.05、0.10 mg/mL大鲵黏多糖培养液培养的HUVEC活力分别为（100.0±4.1）%、（110.6±3.1）%、（119.8±2.6）%、（108.6±1.8）%,总体比较,差异有统计学意义（F=21.64,P<0.001）。即与0 mg/mL大鲵黏多糖相比,0.01、0.05、0.10 mg/mL大鲵黏多糖可显著促进HUVEC的增殖（t值分别为4.29、8.01、3.46,P值分别为0.007、<0.001、0.021）。
2.3 大鲵黏多糖对HUVEC成管的影响
在正常氧环境下培养12 h后,空白对照组、VEGF组和大鲵黏多糖组HUVEC的成管长度分别为（24.7±4.5）、（106.0±19.3）和（152.0±10.8）μm,组间总体比较,差异有统计学意义（F=73.32,P<0.001）。与空白对照组相比,VEGF组和大鲵黏多糖组HUVEC的成管长度均显著增长（q值分别为10.08、16.91,P<0.001）。与VEGF组相比,大鲵黏多糖组HUVEC的成管长度显著增长（q=6.11,P=0.012）。见图2A、2B、2C。
图 2 正常氧环境和低氧环境下培养12 h后3组人脐静脉内皮细胞的成管情况 倒置荧光显微镜×40。2A、2B、2C.分别为正常氧环境下空白对照组、VEGF组、大鲵黏多糖组细胞的成管情况,图2B和图2C的成管长度显著长于图2A；2D、2E、2F.分别为低氧环境下空白对照组、VEGF组、大鲵黏多糖组细胞的成管情况,图2E和图2F的成管长度显著长于图2D,图2F的成管长度明显长于图2E注：空白对照组、血管内皮细胞生长因子（VEGF）组、大鲵皮肤黏液多糖（简称大鲵黏多糖）组细胞分别采用常规培养基和含50 ng/mL VEGF、0.05 mg/mL大鲵黏多糖的培养基进行培养在低氧环境下培养12 h后,空白对照组、VEGF组和大鲵黏多糖组HUVEC的成管长度分别为（12.7±3.5）、（39.7±5.7）和（52.0±2.0）μm,组间总体比较,差异有统计学意义（F=74.84,P<0.001）。与空白对照组相比,VEGF组和大鲵黏多糖组HUVEC的成管长度均显著增长（q值分别为11.61、16.91,P值分别为<0.001、0.022）；与VEGF组相比,大鲵黏多糖组HUVEC的成管长度显著增长（q=5.30,P=0.022）。见图2D、2E、2F。
2.4 大鲵黏多糖对巨噬细胞极化的影响
2.4.1 细胞中CD86和CD206蛋白表达
培养48 h后,空白对照组、LPS组、大鲵黏多糖组细胞中CD86和CD206蛋白的相对荧光强度分别为1.00±0.13、53.73±4.61、5.82±0.63和1.00±0.25、2.21±0.42、31.90±1.76,组间总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为353.40、826.10,P<0.001）。大鲵黏多糖组细胞中CD206蛋白的相对荧光强度显著高于空白对照组和LPS组（q值分别为50.75、48.75,P值均<0.001）,CD86蛋白的相对荧光强度显著低于LPS组（q=30.90,P<0.001）而与空白对照组相近（q=35.02,P=0.150）。见图3。
图 3 3组M0型人巨噬细胞培养48 h后表达CD86和CD206蛋白的情况 Alexa Fluor 594-Alexa Fluor 488-4′,6-二脒基-2-苯基吲哚×600。3A、3B、3C.分别为空白对照组、LPS组、大鲵黏多糖组表达CD86蛋白的情况,图3C的荧光强度显著弱于图3B；3D、3E、3F.分别为空白对照组、LPS组、大鲵黏多糖组表达CD206蛋白的情况,图3F的荧光强度显著强于图3D和图3E注：空白对照组、内毒素/脂多糖（LPS）组、大鲵皮肤黏液多糖（简称大鲵黏多糖）组分别采用常规培养基、含LPS培养基序贯常规培养基、含LPS培养基序贯含0.05 mg/mL的大鲵黏多糖培养基进行培养；CD86阳性染色为红色,CD206阳性染色为绿色,细胞核阳性染色为蓝色2.4.2 细胞中Arg1和CD206的mRNA表达
培养48 h后,空白对照组、LPS组、大鲵黏多糖组细胞中Arg1和CD206的mRNA表达量分别为1.00±0.06、1.14±0.10、2.72±0.12和1.00±0.09、1.41±0.13、3.15±0.28,组间总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为379.00、50.16,P值分别为<0.001、0.004）。大鲵黏多糖组细胞中Arg1和CD206的mRNA表达量均显著高于空白对照组（q值分别为35.02、13.09,P值分别为<0.001、0.005）及LPS组（q值分别为32.24和11.24,P值分别为<0.001、0.008）。
2.5 大鲵黏多糖对糖尿病小鼠创面愈合的影响
2.5.1 创面愈合情况
与空白对照组相比,藻酸盐敷料组小鼠伤后10、14 d创面愈合率均显著升高（P<0.05）,大鲵黏多糖组小鼠伤后7、10、14 d创面愈合率均显著升高（P<0.05）。与藻酸盐敷料组比较,大鲵黏多糖组小鼠伤后7、10 d创面愈合率均显著升高（P<0.05）。见图4、表1。
图 4 3组糖尿病小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合情况。4A、4B、4C.分别为空白对照组伤后7、10、14 d创面愈合情况,愈合速度缓慢；4D、4E、4F.分别为藻酸盐敷料组伤后7、10、14 d创面愈合情况,分别较图4A、4B、4C的创面面积小；4G、4H、4I.分别为大鲵黏多糖组伤后7、10、14 d创面愈合情况,分别较图4D、4E、4F的创面面积小,且愈合质量佳注：空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵皮肤黏液多糖（简称大鲵黏多糖）组小鼠创面分别用生理盐水、藻酸盐敷料和0.05 mg/mL大鲵黏多糖处理；橡胶夹板为参照物,其内径9 mm、外径11 mmTable 1. 3组糖尿病小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合率比较（%,组别 鼠数（只） 3 d 7 d 10 d 14 d 空白对照组 3 8.5±1.7 15.6±3.8 26.3±4.3 52.6±12.3 藻酸盐敷料组 3 7.3±6.9 18.8±2.9 61.9±1.6 90.4±7.6 大鲵黏多糖组 3 11.4±5.6 33.3±5.3 74.4±6.8 97.8±1.5 q1值 0.40 1.07 11.76 12.50 P1值 0.958 0.732 <0.001 <0.001 q2值 0.96 5.84 15.90 14.96 P2值 0.777 0.001 <0.001 <0.001 q3值 1.36 4.77 4.14 2.46 P3值 0.607 0.006 0.017 0.207 注：空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵皮肤黏液多糖（简称大鲵黏多糖）组小鼠创面分别用生理盐水、藻酸盐敷料和0.05 mg/mL大鲵黏多糖处理；处理因素主效应,F=73.43,P<0.001；时间因素主效应,F=365.60,P<0.001；两者交互作用,F=17.29,P<0.001；q1值、P1值及q2值、P2值分别为藻酸盐敷料组、大鲵黏多糖组与空白对照组各时间点比较所得,q3值、P3值为大鲵黏多糖组与藻酸盐敷料组各时间点比较所得 2.5.2 创面组织中血管生成情况
伤后7 d,空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD31蛋白的相对荧光强度分别为1.00±0.09、1.94±0.19和3.07±0.30,组间总体比较,差异有统计学意义（F=71.18,P<0.001）。与空白对照组相比,藻酸盐敷料组和大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD31蛋白的相对荧光强度均显著增强（q值分别为7.63、16.85,P值分别为0.004、<0.001）；大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD31蛋白的相对荧光强度显著强于藻酸盐敷料组（q=9.22,P=0.002）。见图5A、5B、5C。
图 5 3组糖尿病小鼠伤后7 d全层皮肤缺损创面组织中CD31、CD206蛋白的表达情况 Alexa Fluor 594-4′,6-二脒基-2-苯基吲哚×200。5A、5B、5C.分别为空白对照组、藻酸盐敷料组和大鲵黏多糖组创面组织中CD31表达情况,图5C的荧光强度显著强于图5A、5B；5D、5E、5F.分别为空白对照组、藻酸盐敷料组和大鲵黏多糖组创面组织中CD206蛋白表达情况,图5F的荧光强度显著强于图5D、5E注：空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵皮肤黏液多糖（简称大鲵黏多糖）组小鼠创面分别用生理盐水、藻酸盐敷料和大鲵黏多糖处理；CD31、CD206阳性染色均为红色,细胞核阳性染色为蓝色2.5.3 创面组织中的巨噬细胞表型
伤后7 d,空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD206蛋白的相对荧光强度分别为1.00±0.15、2.37±0.30和5.59±0.33,组间总体比较,差异有统计学意义（F=227.30,P<0.001）。与空白对照组相比,藻酸盐敷料组和大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD206蛋白的相对荧光强度均显著增强（q值分别为8.76、29.36,P值分别为0.002、<0.001）；大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD206蛋白的相对荧光强度显著强于藻酸盐敷料组（q=20.61,P<0.001）。见图5D、5E、5F。
2.5.4 创面肉芽组织厚度
伤后14 d,与空白对照组和藻酸盐敷料组相比,大鲵黏多糖组小鼠创面肉芽组织更厚。
3. 讨论
糖尿病创面是糖尿病患者常见的并发症之一,其病理特征包括持续的炎症反应、血管生成障碍以及组织再生能力下降。这些特征与创面微环境中的免疫失衡和低氧状态密切相关[26, 27]。尤其是在糖尿病创面微环境中,巨噬细胞长期维持在M1型促炎状态,而M2型巨噬细胞的数量和功能显著受限,这导致该类创面持续处于炎症阶段,无法进入增殖和重建阶段[28]。此外,糖尿病相关的高糖和氧化应激环境会抑制HUVEC的增殖、迁移和成管功能,从而进一步阻碍血管生成[29, 30]。因此,靶向调节巨噬细胞表型和HUVEC活力成为糖尿病创面修复研究中的重要方向[31]。
HUVEC作为血管生成的核心效应细胞,在创面修复过程中发挥不可替代的作用[32, 33]。本研究显示,在低浓度范围（0.01~0.10 mg/mL）内,大鲵黏多糖能够显著促进HUVEC的增殖；此外,大鲵黏多糖组HUVEC无论是在正常氧还是低氧环境下,其成管长度均显著优于空白对照组,表明大鲵黏多糖促进HUVEC的成管能力不受氧体积分数的影响。大鲵黏多糖的这种特性,使得其可满足糖尿病难愈性创面微循环障碍的修复需求[34, 35]。在糖尿病创面中,M1型巨噬细胞的持续存在会加剧炎症反应,阻碍创面修复[36, 37]。而本研究显示,大鲵黏多糖具有调控巨噬细胞表型分化的作用。巨噬细胞在创面愈合中的动态表型分化,即从M1型向M2型极化是炎症消退和组织修复的关键过程[38, 39]。本研究通过佛波酯刺激人单核细胞白血病细胞诱导分化为M0型巨噬细胞,再用LPS处理诱导其分化为M1型巨噬细胞,随后用大鲵黏多糖刺激该巨噬细胞,结果显示该细胞的表面标志物CD86蛋白（M1型巨噬细胞标志物）表达明显低于未经大鲵黏多糖刺激的巨噬细胞,而CD206蛋白（M2型巨噬细胞标志物）表达明显高于未经大鲵黏多糖刺激的巨噬细胞,提示大鲵黏多糖在巨噬细胞极化中具有重要作用。此外,进一步通过实时荧光定量RT-PCR法检测显示,大鲵黏多糖能够显著诱导M2型巨噬细胞的极化,表现为该巨噬细胞的M2型标志物Arg1及CD206的mRNA表达较未经大鲵黏多糖刺激的巨噬细胞显著升高,说明大鲵黏多糖具有抗炎和促修复能力。这与已有研究报道的巨噬细胞在调控创面免疫微环境中起重要作用[37,40]一致。
本研究还构建了糖尿病模型小鼠并在其背部制作了全层皮肤缺损创面。结果显示,与空白对照组相比,藻酸盐敷料组与大鲵黏多糖组小鼠伤后3~14 d创面愈合速度更快。伤后7 d,大鲵黏多糖提高了创面组织中新生血管生成能力。进一步进行的免疫荧光染色显示,大鲵黏多糖组小鼠创面组织中CD31和CD206蛋白的表达均较空白对照组明显升高,提示大鲵黏多糖具有促血管生成与诱导巨噬细胞向M2型极化的作用。伤后14 d,大鲵黏多糖组小鼠创面肉芽组织较空白对照组和藻酸盐敷料组更厚。
值得一提的是,相比于以往针对天然多糖的研究,本研究强调了巨噬细胞与HUVEC之间的协同作用。大鲵黏多糖可介导M2型巨噬细胞极化和HUVEC成管,优化糖尿病小鼠创面的免疫微环境,增强创面的血管生成能力,从而进一步促进创面修复与组织再生。这提示,在未来的糖尿病创面治疗策略中,可综合考虑免疫调节与HUVEC活力的双重作用。尽管本研究揭示了大鲵黏多糖的多方面生物活性,但仍存在一些局限性：（1）大鲵黏多糖的具体活性成分及其在免疫调节与血管生成信号通路中的分子机制尚待进一步解析；（2）需要在更大规模和更复杂的动物模型中验证大鲵黏多糖的修复效果和安全性。
综上,本研究通过分离和纯化大鲵皮肤黏液中的生物相容性多糖成分,揭示了其在刺激M2型巨噬细胞极化和促进血管生成进而加速糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合中的重要作用。大鲵黏多糖作为一种天然来源的低毒性多糖,具有较大的临床应用潜力,有望为糖尿病创面治疗提供新途径。
苟伟茗：设计并实施研究、起草及修改文章；杨鹏、卢毅飞、张小容：实施研究,分析、解释数据；秦一鸣、李景园、黄勇：实施研究、采集数据；张庆、罗高兴：研究指导、论文修改、经费支持所有作者声明不存在利益冲突 -
参考文献
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图 1 大鲵皮肤黏液多糖的制作过程。1A.物理刺激大鲵皮肤,产生黏液；1B.冻干后的大鲵皮肤黏液；1C.经去脂处理后的大鲵皮肤黏液,呈白色粉末状；1D.透析后的大鲵皮肤黏液多糖粉末颜色微黄
图 2 正常氧环境和低氧环境下培养12 h后3组人脐静脉内皮细胞的成管情况 倒置荧光显微镜×40。2A、2B、2C.分别为正常氧环境下空白对照组、VEGF组、大鲵黏多糖组细胞的成管情况,图2B和图2C的成管长度显著长于图2A；2D、2E、2F.分别为低氧环境下空白对照组、VEGF组、大鲵黏多糖组细胞的成管情况,图2E和图2F的成管长度显著长于图2D,图2F的成管长度明显长于图2E
注：空白对照组、血管内皮细胞生长因子（VEGF）组、大鲵皮肤黏液多糖（简称大鲵黏多糖）组细胞分别采用常规培养基和含50 ng/mL VEGF、0.05 mg/mL大鲵黏多糖的培养基进行培养
图 3 3组M0型人巨噬细胞培养48 h后表达CD86和CD206蛋白的情况 Alexa Fluor 594-Alexa Fluor 488-4′,6-二脒基-2-苯基吲哚×600。3A、3B、3C.分别为空白对照组、LPS组、大鲵黏多糖组表达CD86蛋白的情况,图3C的荧光强度显著弱于图3B；3D、3E、3F.分别为空白对照组、LPS组、大鲵黏多糖组表达CD206蛋白的情况,图3F的荧光强度显著强于图3D和图3E
注：空白对照组、内毒素/脂多糖（LPS）组、大鲵皮肤黏液多糖（简称大鲵黏多糖）组分别采用常规培养基、含LPS培养基序贯常规培养基、含LPS培养基序贯含0.05 mg/mL的大鲵黏多糖培养基进行培养；CD86阳性染色为红色,CD206阳性染色为绿色,细胞核阳性染色为蓝色
图 4 3组糖尿病小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合情况。4A、4B、4C.分别为空白对照组伤后7、10、14 d创面愈合情况,愈合速度缓慢；4D、4E、4F.分别为藻酸盐敷料组伤后7、10、14 d创面愈合情况,分别较图4A、4B、4C的创面面积小；4G、4H、4I.分别为大鲵黏多糖组伤后7、10、14 d创面愈合情况,分别较图4D、4E、4F的创面面积小,且愈合质量佳
注：空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵皮肤黏液多糖（简称大鲵黏多糖）组小鼠创面分别用生理盐水、藻酸盐敷料和0.05 mg/mL大鲵黏多糖处理；橡胶夹板为参照物,其内径9 mm、外径11 mm
图 5 3组糖尿病小鼠伤后7 d全层皮肤缺损创面组织中CD31、CD206蛋白的表达情况 Alexa Fluor 594-4′,6-二脒基-2-苯基吲哚×200。5A、5B、5C.分别为空白对照组、藻酸盐敷料组和大鲵黏多糖组创面组织中CD31表达情况,图5C的荧光强度显著强于图5A、5B；5D、5E、5F.分别为空白对照组、藻酸盐敷料组和大鲵黏多糖组创面组织中CD206蛋白表达情况,图5F的荧光强度显著强于图5D、5E
注：空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵皮肤黏液多糖（简称大鲵黏多糖）组小鼠创面分别用生理盐水、藻酸盐敷料和大鲵黏多糖处理；CD31、CD206阳性染色均为红色,细胞核阳性染色为蓝色
Table 1. 3组糖尿病小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合率比较（%,
组别 鼠数（只） 3 d 7 d 10 d 14 d 空白对照组 3 8.5±1.7 15.6±3.8 26.3±4.3 52.6±12.3 藻酸盐敷料组 3 7.3±6.9 18.8±2.9 61.9±1.6 90.4±7.6 大鲵黏多糖组 3 11.4±5.6 33.3±5.3 74.4±6.8 97.8±1.5 q1值 0.40 1.07 11.76 12.50 P1值 0.958 0.732 <0.001 <0.001 q2值 0.96 5.84 15.90 14.96 P2值 0.777 0.001 <0.001 <0.001 q3值 1.36 4.77 4.14 2.46 P3值 0.607 0.006 0.017 0.207 注：空白对照组、藻酸盐敷料组、大鲵皮肤黏液多糖（简称大鲵黏多糖）组小鼠创面分别用生理盐水、藻酸盐敷料和0.05 mg/mL大鲵黏多糖处理；处理因素主效应,F=73.43,P<0.001；时间因素主效应,F=365.60,P<0.001；两者交互作用,F=17.29,P<0.001；q1值、P1值及q2值、P2值分别为藻酸盐敷料组、大鲵黏多糖组与空白对照组各时间点比较所得,q3值、P3值为大鲵黏多糖组与藻酸盐敷料组各时间点比较所得 
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