Influence and mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing growth arrest specific 6 on full-thickness skin defect wounds in diabetic mice
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摘要:
目的 探讨过表达生长停滞特异性蛋白6（GAS6）的骨髓间充质干细胞（BMSC）,即GAS6/BMSC对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的影响及其机制。 方法 该研究为实验研究。将12只8周龄雄性C57BL/6J小鼠按照随机数字表法分为仅造成全层皮肤缺损的对照创面组与造成糖尿病全层皮肤缺损的糖尿病创面组,每组6只小鼠。伤后3、7、14、21 d,计算创面愈合率。伤后21 d,收集创面组织标本,行苏木精-伊红染色观察组织病理学情况；行Masson染色检测胶原沉积情况；行免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞数和CD31阳性细胞数,分别表示细胞增殖情况和毛细血管密度；行免疫荧光染色检测F4/80和髓过氧化物酶（MPO）双阳性细胞数,表示胞葬情况。取2只4周龄雄性C57BL/6J小鼠,提取BMSC,通过腺病毒转染构建GAS6/BMSC并成功鉴定。取18只8周龄雄性C57BL/6J小鼠制成糖尿病全层皮肤缺损创面模型后,按照随机数字表法将其分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、BMSC组和GAS6/BMSC组（每组6只小鼠）,伤后即刻于3组小鼠创面局部分别注射PBS、BMSC单细胞悬液、GAS6/BMSC单细胞悬液,于前述实验相同时间点计算创面愈合率、检测细胞增殖情况和毛细血管密度及胞葬情况。 结果 伤后3、7、14、21 d,糖尿病创面组小鼠创面愈合率均显著低于对照创面组（t值分别为7.99、8.62、9.80、5.85,P<0.05）。与对照创面组相比,糖尿病创面组小鼠伤后21 d的创面组织中大量炎症细胞浸润,胶原沉积减少。伤后21 d,糖尿病创面组小鼠创面组织中PCNA阳性细胞数和CD31阳性细胞数均显著少于对照创面组（t值分别为6.61、5.38,P<0.05）。伤后21 d,糖尿病创面组小鼠创面组织中F4/80和MPO双阳性细胞数为（3.3±0.8）个,较对照创面组的（12.7±1.8）个显著减少（t=11.00,P<0.05）。伤后14、21 d,BMSC组小鼠创面愈合率均显著高于PBS组（P<0.05）；伤后3、7、14、21 d,GAS6/BMSC组小鼠创面愈合率均显著高于BMSC组（P<0.05）。伤后21 d,BMSC组小鼠创面组织中PCNA阳性细胞数显著多于PBS组（P<0.05）,GAS6/BMSC组小鼠创面组织中PCNA阳性细胞数与CD31阳性细胞数均显著多于BMSC组（P<0.05）。伤后21 d,BMSC组小鼠创面组织中F4/80和MPO双阳性细胞数为（4.2±1.2）个,与PBS组的（3.5±1.1）个相近（P>0.05）；GAS6/BMSC组小鼠创面组织中F4/80和MPO双阳性细胞数为（8.2±1.2）个,显著多于BMSC组（P<0.05）。 结论 糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面中存在巨噬细胞的胞葬功能障碍,而GAS6/BMSC可通过恢复巨噬细胞的胞葬作用促进创面愈合。 Abstract:Objective To investigate the influence and mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) overexpressing growth arrest specific 6, i.e. GAS6/BMSCs on full-thickness skin defect wounds in diabetic mice. Methods This study was an experimental study. Twelve 8-week-old male C57BL/6J mice were divided into a control wound group with only full-thickness skin defects and a diabetic wound group with diabetic full-thickness skin defects according to the random number table method, with 6 mice in each group. The wound healing rates were calculated at 3, 7, 14, and 21 days after injury. At 21 days after injury, wound tissue specimens were collected for hematoxylin-eosin staining to observe the histopathological conditions; Masson staining was performed to detect collagen deposition; immunohistochemical staining was performed to detect the number of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-positive cells and CD31-positive cells, representing cell proliferation and capillary density, respectively; immunofluorescence staining was performed to detect the number of F4/80 and myeloperoxidase (MPO) double-positive cells, indicating efferocytosis. Two 4-week-old male C57BL/6J mice were used to extract BMSCs, and GAS6/BMSCs were constructed through adenovirus transfection and successfully identified. Eighteen 8-week-old male C57BL/6J mice were used to create diabetic full-thickness skin defect wound models and divided into phosphate buffered solution (PBS) group, BMSC group, and GAS6/BMSC group (with 6 mice in each group) according to the random number table method. Immediately after injury, PBS, BMSC single-cell suspension, and GAS6/BMSC single-cell suspension were injected locally into the wounds of the three groups of mice, respectively. The wound healing rates were calculated, and the cell proliferation, capillary density, and efferocytosis were detected at the same time points as the previous experiments. Results At 3, 7, 14, and 21 days after injury, the wound healing rates of mice in diabetic wound group were significantly lower than those in control wound group (with t values of 7.99, 8.62, 9.80, and 5.85, respectively, P<0.05). Compared with those in control wound group, the wound tissue of mice in diabetic wound group showed the infiltration of a large number of inflammatory cells and reduced collagen deposition at 21 days after injury. At 21 days after injury, the number of PCNA-positive cells and CD31-positive cells in the wound tissue of mice in diabetic wound group were significantly less than that in control wound group (with t values of 6.61 and 5.38, respectively, P<0.05). At 21 days after injury, the number of F4/80 and MPO double-positive cells in the wound tissue of mice in diabetic wound group was 3.3±0.8, which was significantly less than 12.7±1.8 in control wound group (t=11.00, P<0.05). At 14 and 21 days after injury, the wound healing rates of mice in BMSC group were significantly higher than those in PBS group (P<0.05); at 3, 7, 14, and 21 days after injury, the wound healing rates of mice in GAS6/BMSC group were significantly higher than those in BMSC group (P<0.05). At 21 days after injury, the number of PCNA-positive cells in the wound tissue of mice in BMSC group was significantly higher than that in PBS group (P<0.05), and the number of PCNA-positive cells and CD31-positive cells in the wound tissue of mice in GAS6/BMSC group were significantly higher than that in BMSC group (P<0.05). At 21 days after injury, the number of F4/80 and MPO double-positive cells in the wound tissue of mice in BMSC group was 4.2±1.2, which was similar to 3.5±1.1 in PBS group (P>0.05); the number of F4/80 and MPO double-positive cells in the wound tissue of mice in GAS6/BMSC group was 8.2±1.2, which was significantly more than that in BMSC group (P<0.05). Conclusions Dysfunctional efferocytosis of macrophage exists in the full-thickness skin defect wounds of diabetic mice, while GAS6/BMSC can promote wound healing by restoring the efferocytosis of macrophages. -
Key words:
- Diabetes mellitus, type 2 /
- Ulcer /
- Mesenchymal stem cells /
- Macrophages /
- Efferocytosis /
- Growth arrest specific 6 /
- Wound repair
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(1)证实糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面中存在巨噬细胞胞葬功能障碍。
(2)构建了过表达生长停滞特异性蛋白6的骨髓间充质干细胞（以下简称GAS6/BMSC）,并证实了GAS6/BMSC可通过改善巨噬细胞的胞葬功能加速糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合。
Highlights:
(1)It was confirmed that efferocytosis of macrophage was dysfunctional in full-thickness skin defect wounds of diabetic mice.
(2)Bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing growth arrest specific 6 (hereinafter referred to as GAS6/BMSCs) were constructed, and it was confirmed that GAS6/BMSCs could accelerate the wound healing of full-thickness skin defects in diabetic mice through improving the efferocytosis of macrophage.
糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer,DFU）是一个日益严重的公共卫生问题。2023年的统计数据显示,全球有超过3 000万的DFU患者[1]。探寻DFU的发病机制、开发新一代治疗策略,符合我国在医疗健康领域的迫切需求。
DFU的显著特点是持续存在的局部慢性炎症[2, 3]。在这种炎症反应过程中,中性粒细胞是数量最多、最早到达损伤部位的免疫细胞[4]。在生理情况下,活化的中性粒细胞在24 h内会发生凋亡并被巨噬细胞吞噬,因而炎症被限制在可控的范围内[5]。这种巨噬细胞吞噬死细胞的过程被称为胞葬作用（efferocytosis）[6]。未被胞葬的中性粒细胞会发生继发性坏死,进而释放多种蛋白水解酶,继续招募免疫细胞,导致损伤扩大和炎症暴发[7, 8]。这说明,胞葬作用在控制炎症扩大和维持器官稳态中起核心作用。然而尚未见研究报道巨噬细胞对中性粒细胞的胞葬障碍是否参与DFU愈合。
生长停滞特异性蛋白6（growth arrest specific 6,GAS6）是胞葬过程中的关键分子,通过引导巨噬细胞识别凋亡细胞介导胞葬发生[9, 10]。GAS6表达下降会阻碍巨噬细胞的胞葬作用,导致炎症放大[11, 12, 13]。间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）具有强大的归巢作用,能够在细胞因子等信号的引导下趋向炎症部位,是一种递送蛋白和药物的理想载体,具有良好的临床转化价值[14, 15, 16]。有鉴于此,本研究探索巨噬细胞胞葬作用在DFU发生中的机制变化,并构建过表达GAS6的骨髓MSC（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）,即GAS6/BMSC进行针对性干预,拟为DFU的机制探讨、生物治疗和临床转化提供参考。
1. 材料与方法
本实验研究经山东大学齐鲁医院医学伦理委员会审核批准,批号：KYLL-2023（ZM）-354。
1.1 动物、细胞及主要试剂与仪器来源
30只8周龄体重约20 g和2只4周龄体重约15 g的雄性健康无特殊病原体级C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号：SCXK（京）2020-0004。装载GAS6基因的腺病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司,HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒、油红O染色试剂盒、茜素红S染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,兔抗小鼠增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）单克隆抗体、兔抗小鼠CD31单克隆抗体、生物素标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、兔抗小鼠GAS6单克隆抗体、兔抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、兔抗小鼠F4/80单克隆抗体、小鼠抗小鼠髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）单克隆抗体、Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体、Cy3标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体购自美国Abcam公司,藻红蛋白标记的兔抗小鼠CD29、CD45单克隆抗体及异硫氰酸荧光素标记的兔抗小鼠CD34、CD90单克隆抗体购自美国BioLegend公司,DMEM/F12培养基购自美国Thermo Fisher Scientific公司。BX51型荧光显微镜、IX71型倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司,通用型蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司,DxFLEX型流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。
1.2 糖尿病对创面愈合的影响
1.2.1 动物分组与处理
选取12只8周龄小鼠,按照随机数字表法分为对照创面组与糖尿病创面组,每组6只小鼠。糖尿病创面组小鼠使用高脂高糖饲料喂养6周后,按10 mL/kg的剂量一次性腹腔注射10 g/L链脲佐菌素溶液,注射后3 d测量尾静脉血糖,将血糖水平连续3 d≥16.7 mmol/L的小鼠视为2型糖尿病模型建立成功,纳入后续研究（均成功建模）；对照创面组小鼠使用基础维持饲料喂养,按10 mL/kg腹腔注射PBS作为对照。之后在2组小鼠背部剃毛,常规麻醉后将直径为10 mm的圆形全层皮肤切除,构建全层皮肤缺损创面模型。
1.2.2 创面愈合率计算
伤后0（即刻）、3、7、14、21 d观察2组小鼠创面愈合情况并拍照记录,计算伤后3、7、14、21 d创面愈合率,创面愈合率=（伤后0 d创面面积-各时间点创面面积）÷伤后0 d创面面积×100%。
1.2.3 标本采集与指标检测
1.2.3 .1 标本采集
伤后21 d,收集2组小鼠所有创面组织,常规固定后,行石蜡包埋、切片（厚度为4 μm）。
1.2.3 .2 创面组织病理学及胶原沉积情况观察
取2组小鼠创面组织切片,行常规HE染色,于荧光显微镜（明场通道）100倍放大倍数下观察组织病理学情况。另取2组小鼠创面组织切片,行常规Masson染色,于荧光显微镜（明场通道）40倍放大倍数下观察胶原沉积情况。
1.2.3 .3 创面组织中细胞增殖情况和毛细血管密度检测
取2组小鼠创面组织切片,行免疫组织化学染色,检测细胞增殖情况和毛细血管密度。一抗为兔抗小鼠PCNA单克隆抗体、兔抗小鼠CD31单克隆抗体（稀释比均为1∶200）,二抗为生物素标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶200）,用二氨基联苯胺显色,用苏木精溶液对细胞核进行染色。于荧光显微镜（明场通道）200倍放大倍数下观察PCNA阳性细胞（棕褐色）、CD31阳性细胞（棕褐色）,用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）统计PCNA阳性细胞数与CD31阳性细胞数,分别表示细胞增殖情况和毛细血管密度。
1.2.3 .4 创面组织中胞葬情况检测
取2组小鼠创面组织切片,行免疫荧光染色,检测胞葬情况。一抗为兔抗小鼠F4/80单克隆抗体和小鼠抗小鼠MPO单克隆抗体（稀释比均为1∶200）,二抗为Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体和Cy3标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比均为1∶200）,用4',6-二脒基-2-苯基吲哚对细胞核进行染色。于荧光显微镜200倍放大倍数下观察F4/80和MPO双阳性细胞（F4/80阳性为红色,MPO阳性为绿色,双阳性为黄色）,用ImageJ软件统计F4/80和MPO双阳性细胞数,以此表示胞葬情况。
1.3 GAS6/BMSC的构建与鉴定
选用2只4周龄小鼠,颈椎脱臼处死消毒后,取出股骨和胫骨,剪掉两端后用DMEM/F12培养基反复冲洗骨髓腔,至骨头变成白色。收集骨髓组织,轻柔吹打均匀,加入DMEM/F12培养基至15 mL,移入T75培养瓶中培养,获得BMSC（经成脂成骨分化和表面标志物鉴定）。当BMSC生长至30%~40%融合时,常规加入装载小鼠GAS6基因的腺病毒进行转染,获得GAS6/BMSC,培养48 h后于倒置荧光显微镜（明场通道）200倍放大倍数下观察细胞形态。
取GAS6/BMSC,另取BMSC作为对照,采用蛋白质印迹法检测BMSC与GAS6/BMSC中的GAS6蛋白表达水平。一抗为兔抗小鼠GAS6单克隆抗体（稀释比为1∶1 000）和兔抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体（稀释比为1∶5 000）,二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶2 000）。以β肌动蛋白为内参照,用ImageJ软件分析条带灰度值,用目的蛋白与内参照蛋白的灰度值比值表示目的蛋白表达水平。该实验样本数为3。
取GAS6/BMSC,采用流式细胞术检测细胞表面标志物CD29、CD45、CD34、CD90的阳性表达率。抗体为藻红蛋白标记的兔抗小鼠CD29、CD45单克隆抗体及异硫氰酸荧光素标记的兔抗小鼠CD34、CD90单克隆抗体（稀释比均为1∶50）。
取GAS6/BMSC,使用成脂诱导分化培养基和成骨诱导分化培养基分别诱导细胞分化,诱导15 d后分别行油红O染色和茜素红S染色,于倒置荧光显微镜（明场通道）200倍放大倍数下观察其成脂和成骨分化（均为红色）水平。
1.4 GAS6/BMSC对糖尿病创面的影响
选取剩余18只8周龄小鼠,按1.2.1中方法构建糖尿病全层皮肤缺损创面模型后,按随机数字表法将其分为PBS组、BMSC组和GAS6/BMSC组（每组6只小鼠）,伤后即刻于3组小鼠创面局部分别注射100 μL PBS、BMSC单细胞悬液、GAS6/BMSC单细胞悬液,后2组细胞浓度均为1×106个/mL。同1.2.2、1.2.3.3和1.2.3.4进行相应时间点创面愈合率计算及创面组织中细胞增殖情况、毛细血管密度及胞葬情况检测。
1.5 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布,以
2. 结果
2.1 糖尿病对创面愈合的影响
2.1.1 创面愈合率及组织病理学与胶原沉积情况
伤后0~21 d,2组小鼠创面面积均逐渐缩小。伤后3、7、14、21 d,糖尿病创面组小鼠创面愈合率均显著低于对照创面组（P<0.05）,见图1与表1。伤后21 d,与对照创面组相比,糖尿病创面组小鼠创面组织中大量炎症细胞浸润,肉芽组织和胶原沉积减少,皮肤完整性恢复不良。
图 1 2组小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点面积情况。1A、1B.分别为对照创面组与糖尿病创面组伤后0 d（即刻）创面情况,创面面积一致；1C、1D.分别为对照创面组与糖尿病创面组伤后7 d创面情况,图1C创面面积显著小于图1D；1E、1F.分别为对照创面组与糖尿病创面组伤后14 d创面情况,图1E创面面积显著小于图1F；1G、1H.分别为对照创面组与糖尿病创面组伤后21 d创面情况,图1G创面面积显著小于图1H注：糖尿病创面组小鼠制成糖尿病模型后致伤,对照创面组小鼠单纯致伤Table 1. 2组小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合率比较（%,组别 样本数 3 d 7 d 14 d 21 d 对照创面组 6 31.7±4.8 48.3±5.5 86.8±3.4 92.0±4.1 糖尿病创面组 6 10.8±4.2 24.3±4.0 65.8±4.0 79.0±3.6 t值 7.99 8.62 9.80 5.85 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：糖尿病创面组小鼠制成糖尿病模型后致伤,对照创面组小鼠单纯致伤；处理因素主效应,F=263.80,P<0.001；时间因素主效应,F=1 090.00,P<0.001；两者交互作用,F=19.47,P<0.001 2.1.2 创面组织中细胞增殖情况和毛细血管密度及胞葬情况
伤后21 d,糖尿病创面组小鼠创面组织中PCNA阳性细胞数、CD31阳性细胞数以及F4/80和MPO双阳性细胞数分别为（25±5）、（722±81）、（3.3±0.8）个,均较对照创面组的（48±7）、（1 075±139）、（12.7±1.8）个显著减少（t值分别为6.61、5.38、11.00,P<0.001）。见图2。
图 2 2组小鼠全层皮肤缺损创面伤后21 d组织中细胞增殖情况、毛细血管密度和胞葬情况。2A、2B.分别为糖尿病创面组与对照创面组PCNA阳性细胞（棕褐色）情况,图2A中阳性细胞数显著少于图2B 二氨基联苯胺-苏木精×200；2C、2D.分别为糖尿病创面组与对照创面组CD31阳性细胞（棕褐色）情况,图2C中阳性细胞数显著少于图2D 二氨基联苯胺-苏木精×200；2E、2F.分别为糖尿病创面组与对照创面组F4/80和MPO双阳性细胞（黄色）情况,图2E中双阳性细胞数显著少于图2F Alexa Fluor 488-Cy3-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×200注：糖尿病创面组小鼠制成糖尿病模型后致伤,对照创面组小鼠单纯致伤；分别以增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞数、CD31阳性细胞数、F4/80（阳性为红色）和髓过氧化物酶（MPO,阳性为绿色）双阳性细胞数表示细胞增殖情况、毛细血管密度、胞葬情况2.2 GAS6/BMSC的鉴定
培养48 h,GAS6/BMSC呈长梭形,簇状或旋涡状排列,具备典型的BMSC形态。GAS6/BMSC中GAS6的蛋白表达量为0.75±0.05,显著高于BMSC中的0.27±0.04（t=12.98,P<0.001）。GAS6/BMSC表面标志物CD29、CD45的阳性表达率分别为（99.53±0.25）%和（99.4±0.3）%,CD34、CD90的阳性表达率分别为（0.040±0.020）%和（0.033±0.015）%。成脂、成骨诱导15 d后,见GAS6/BMSC内有大量脂滴和钙结节沉积。见图3。综上,GAS6/BMSC构建成功。
图 3 过表达GAS6的小鼠BMSC的鉴定。3A.培养48 h,GAS6/BMSC形态为长梭形 倒置荧光显微镜（明场通道）×200；3B.蛋白质印迹法检测显示GAS6/BMSC中GAS6蛋白表达水平显著高于作为对照的BMSC；3C.成脂诱导15 d后,GAS6/BMSC内可见脂滴（红色） 油红O×200；3D.成骨诱导15 d后,GAS6/BMSC内可见钙盐结节（红色） 茜素红S×200注：GAS6为生长停滞特异性蛋白6,BMSC为骨髓间充质干细胞,GAS6/BMSC为过表达GAS6的BMSC2.3 GAS6/BMSC对糖尿病创面的影响
2.3.1 创面愈合率
伤后0~21 d,各组小鼠创面面积均逐渐缩小。伤后14、21 d,BMSC组小鼠创面愈合率均显著高于PBS组（P<0.05）；伤后3、7、14、21 d,GAS6/BMSC组小鼠创面愈合率均显著高于BMSC组（P<0.05）。见图4与表2。
图 4 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点面积情况。4A、4B、4C.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组伤后0 d（即刻）创面情况,创面面积一致；4D、4E、4F.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组伤后7 d创面情况,图4D与图4E创面面积相近,图4F创面面积显著小于图4E；4G、4H、4I.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组伤后14 d创面情况,图4H创面面积显著小于图4G,图4I创面面积显著小于图4H；4J、4K、4L.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组伤后21 d的创面情况,图4K创面面积显著小于图4J,图4L创面面积显著小于图4K注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、骨髓间充质干细胞（BMSC）组与过表达生长停滞特异性蛋白6的BMSC（GAS6/BMSC）组小鼠创面局部分别注射PBS、BMSC单细胞悬液、GAS6/BMSC单细胞悬液Table 2. 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合率比较（%,组别 样本数 3 d 7 d 14 d 21 d PBS组 6 12.8±5.8 27.2±4.1 63.0±3.4 74.5±4.3 BMSC组 6 12.3±3.6 29.3±5.9 68.3±2.2 80.2±3.2 GAS6/BMSC组 6 31.7±4.4 49.7±6.4 84.0±2.9 92.0±2.6 F值 33.38 30.18 86.95 40.69 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 P1值 0.980 0.780 0.015 0.030 P2值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、骨髓间充质干细胞（BMSC）组与过表达生长停滞特异性蛋白6的BMSC（GAS6/BMSC）组小鼠创面局部分别注射PBS、BMSC单细胞悬液、GAS6/BMSC单细胞悬液；处理因素主效应,F=197.30,P<0.001；时间因素主效应,F=1 399.00,P<0.001；两者交互作用,F=10.41,P<0.001；F值、P值为各时间点组间总体比较所得,P1值为BMSC组与PBS组各时间点比较所得,P2值为GAS6/BMSC组与BMSC组各时间点比较所得 2.3.2 创面组织中细胞增殖情况和毛细血管密度及胞葬情况
伤后21 d,PBS组、BMSC组和GAS6/BMSC组小鼠创面组织中PCNA阳性细胞数分别为（26±7）、（35±6）、（47±7）个,CD31阳性细胞数分别为（722±81）、（785±69）、（1 006±176）个,F4/80和MPO双阳性细胞数分别为（3.5±1.1）、（4.2±1.2）、（8.2±1.2）个,3个指标组间总体比较,差异均有统计学意义（F值分别为16.83、9.48、29.91,P<0.001）。BMSC组小鼠创面组织中PCNA阳性细胞数显著多于PBS组（P=0.043）,CD31阳性细胞数以及F4/80和MPO双阳性细胞数与PBS组相近（P值分别为0.633、0.575）；GAS6/BMSC组小鼠创面组织中PCNA阳性细胞数、CD31阳性细胞数及F4/80和MPO双阳性细胞数均显著多于BMSC组（P值分别为0.018、0.015、<0.001）。见图5。
图 5 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后21 d组织中细胞增殖情况、毛细血管密度和胞葬情况。5A、5B、5C.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组PCNA阳性细胞（棕褐色）情况,图5B中阳性细胞数显著多于图5A,图5C中阳性细胞数显著多于图5B；5D、5E、5F.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组CD31阳性细胞（棕褐色）情况,图5E与图5D中阳性细胞数相近,图5F中阳性细胞数显著多于图5E；5G、5H、5I.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组F4/80和MPO双阳性细胞（黄色）情况,图5G与图5H中双阳性细胞数相近,图5I中双阳性细胞数显著多于图5H注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、骨髓间充质干细胞（BMSC）组与过表达生长停滞特异性蛋白6的BMSC（GAS6/BMSC）组小鼠创面局部分别注射PBS、BMSC单细胞悬液、GAS6/BMSC单细胞悬液；分别以增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞数、CD31阳性细胞数、F4/80（阳性为红色）和髓过氧化物酶（MPO,阳性为绿色）双阳性细胞数表示细胞增殖情况、毛细血管密度、胞葬情况3. 讨论
DFU愈合时间长达3~12个月,并且最终20%的患者需要截肢治疗,给社会带来巨大的医疗负担[17]。深入解析DFU延迟愈合的潜在分子机制对于治疗DFU至关重要。巨噬细胞功能失调是导致DFU延迟愈合的重要因素[2]。既往研究多以巨噬细胞M1型和M2型极化为重点,然而这种体外建立的分类方法不能涵盖体内巨噬细胞的功能多样性。越来越多的证据表明,巨噬细胞的胞葬作用在消除炎症、维持内环境稳定方面发挥关键作用[6,18, 19, 20, 21]。具体而言,中性粒细胞通过释放蛋白水解酶介导组织损伤,招募免疫细胞并扩大炎症反应,而健康的巨噬细胞可以将中性粒细胞及时清除,从而控制炎症反应、维持组织稳态并促进损伤恢复,这种现象即胞葬[5,7,22, 23, 24]。巨噬细胞的胞葬功能障碍是炎症放大和创面难愈的关键机制[25, 26],然而关于巨噬细胞胞葬在DFU中的作用目前尚不明确。
本研究显示,与单纯全层皮肤缺损小鼠模型相比,糖尿病全层皮肤缺损小鼠模型的创面愈合率显著降低,创面组织中增殖细胞数量减少、毛细血管密度下降；最重要的是,糖尿病全层皮肤缺损小鼠创面中巨噬细胞的胞葬作用受到显著抑制。以上结果和同行研究提示,巨噬细胞的胞葬功能障碍是DFU愈合缓慢的关键机制之一。在此基础上,本课题组构建了GAS6/BMSC对糖尿病全层皮肤缺损创面进行针对性治疗。GAS6介导巨噬细胞识别凋亡细胞并触发下游“eat-me”信号,是促进巨噬细胞胞葬的关键分子[9, 10]。既往研究证明,在炎症性肺损伤、肥胖相关骨关节炎和脑出血等多种疾病中,GAS6表达水平降低导致的巨噬细胞胞葬功能障碍是疾病进展的关键因素[11, 12, 13]。因此,补充GAS6可能是恢复胞葬的有效途径。MSC表面表达多种趋化因子受体和黏附分子,在损伤、炎症和缺氧等刺激下,通过不同信号途径触发细胞变形并穿过血管内皮细胞定向迁移至损伤部位,具有靶向性优势[27, 28, 29, 30, 31, 32]。此外,MSC分泌的外泌体内含有大量蛋白质和核酸等物质,能够将目的蛋白运送至邻近细胞发挥生物学效应,是保存、递送药物的天然载体,具有生物相容性高、免疫原性和毒性低的特点[14, 15, 16,33, 34, 35]。以MSC为代表的细胞治疗是促进创面愈合的新兴治疗手段[36, 37, 38, 39, 40, 41]。本研究显示,与PBS或未转染GAS6的BMSC相比,GAS6/BMSC显著促进糖尿病全层皮肤缺损小鼠模型的创面愈合,并提高创面组织中增殖细胞数量、毛细血管密度,改善巨噬细胞的胞葬功能。从机制上讲,GAS6/BMSC通过有效恢复巨噬细胞的胞葬作用,使其充分发挥吞噬功能,及时清除凋亡细胞,最终加速DFU愈合。
然而,本研究尚存在一定局限：（1）仅验证了糖尿病全层皮肤缺损创面中巨噬细胞存在胞葬功能障碍的现象,其中具体的分子机制尚不清楚。（2）仅进行了动物实验,尚缺乏细胞实验。如何建立DFU巨噬细胞胞葬障碍的体外模型是目前尚待解决的难题。（3）未探究GAS6/BMSC影响巨噬细胞胞葬功能的方式和下游具体机制。
综上,本研究初步证明了胞葬功能障碍是抑制DFU愈合的关键,并提出通过GAS6/BMSC恢复胞葬的策略,为DFU的治疗提供了新的靶点。
刘培、王超、魏绮键、李玉腾：实验操作；崔丽君、王昌钏、张帆、马玲：数据整理、统计学分析；田轩：实验设计、研究指导、论文撰写、论文修改和经费支持所有作者声明不存在利益冲突 -
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图 1 2组小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点面积情况。1A、1B.分别为对照创面组与糖尿病创面组伤后0 d（即刻）创面情况,创面面积一致；1C、1D.分别为对照创面组与糖尿病创面组伤后7 d创面情况,图1C创面面积显著小于图1D；1E、1F.分别为对照创面组与糖尿病创面组伤后14 d创面情况,图1E创面面积显著小于图1F；1G、1H.分别为对照创面组与糖尿病创面组伤后21 d创面情况,图1G创面面积显著小于图1H
注：糖尿病创面组小鼠制成糖尿病模型后致伤,对照创面组小鼠单纯致伤
图 2 2组小鼠全层皮肤缺损创面伤后21 d组织中细胞增殖情况、毛细血管密度和胞葬情况。2A、2B.分别为糖尿病创面组与对照创面组PCNA阳性细胞（棕褐色）情况,图2A中阳性细胞数显著少于图2B 二氨基联苯胺-苏木精×200；2C、2D.分别为糖尿病创面组与对照创面组CD31阳性细胞（棕褐色）情况,图2C中阳性细胞数显著少于图2D 二氨基联苯胺-苏木精×200；2E、2F.分别为糖尿病创面组与对照创面组F4/80和MPO双阳性细胞（黄色）情况,图2E中双阳性细胞数显著少于图2F Alexa Fluor 488-Cy3-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×200
注：糖尿病创面组小鼠制成糖尿病模型后致伤,对照创面组小鼠单纯致伤；分别以增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞数、CD31阳性细胞数、F4/80（阳性为红色）和髓过氧化物酶（MPO,阳性为绿色）双阳性细胞数表示细胞增殖情况、毛细血管密度、胞葬情况
图 3 过表达GAS6的小鼠BMSC的鉴定。3A.培养48 h,GAS6/BMSC形态为长梭形 倒置荧光显微镜（明场通道）×200；3B.蛋白质印迹法检测显示GAS6/BMSC中GAS6蛋白表达水平显著高于作为对照的BMSC；3C.成脂诱导15 d后,GAS6/BMSC内可见脂滴（红色） 油红O×200；3D.成骨诱导15 d后,GAS6/BMSC内可见钙盐结节（红色） 茜素红S×200
注：GAS6为生长停滞特异性蛋白6,BMSC为骨髓间充质干细胞,GAS6/BMSC为过表达GAS6的BMSC
图 4 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点面积情况。4A、4B、4C.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组伤后0 d（即刻）创面情况,创面面积一致；4D、4E、4F.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组伤后7 d创面情况,图4D与图4E创面面积相近,图4F创面面积显著小于图4E；4G、4H、4I.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组伤后14 d创面情况,图4H创面面积显著小于图4G,图4I创面面积显著小于图4H；4J、4K、4L.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组伤后21 d的创面情况,图4K创面面积显著小于图4J,图4L创面面积显著小于图4K
注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、骨髓间充质干细胞（BMSC）组与过表达生长停滞特异性蛋白6的BMSC（GAS6/BMSC）组小鼠创面局部分别注射PBS、BMSC单细胞悬液、GAS6/BMSC单细胞悬液
图 5 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后21 d组织中细胞增殖情况、毛细血管密度和胞葬情况。5A、5B、5C.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组PCNA阳性细胞（棕褐色）情况,图5B中阳性细胞数显著多于图5A,图5C中阳性细胞数显著多于图5B；5D、5E、5F.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组CD31阳性细胞（棕褐色）情况,图5E与图5D中阳性细胞数相近,图5F中阳性细胞数显著多于图5E；5G、5H、5I.分别为PBS组、BMSC组与GAS6/BMSC组F4/80和MPO双阳性细胞（黄色）情况,图5G与图5H中双阳性细胞数相近,图5I中双阳性细胞数显著多于图5H
注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、骨髓间充质干细胞（BMSC）组与过表达生长停滞特异性蛋白6的BMSC（GAS6/BMSC）组小鼠创面局部分别注射PBS、BMSC单细胞悬液、GAS6/BMSC单细胞悬液；分别以增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞数、CD31阳性细胞数、F4/80（阳性为红色）和髓过氧化物酶（MPO,阳性为绿色）双阳性细胞数表示细胞增殖情况、毛细血管密度、胞葬情况
Table 1. 2组小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合率比较（%,
组别 样本数 3 d 7 d 14 d 21 d 对照创面组 6 31.7±4.8 48.3±5.5 86.8±3.4 92.0±4.1 糖尿病创面组 6 10.8±4.2 24.3±4.0 65.8±4.0 79.0±3.6 t值 7.99 8.62 9.80 5.85 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：糖尿病创面组小鼠制成糖尿病模型后致伤,对照创面组小鼠单纯致伤；处理因素主效应,F=263.80,P<0.001；时间因素主效应,F=1 090.00,P<0.001；两者交互作用,F=19.47,P<0.001 
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Table 2. 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面伤后各时间点愈合率比较（%,
组别 样本数 3 d 7 d 14 d 21 d PBS组 6 12.8±5.8 27.2±4.1 63.0±3.4 74.5±4.3 BMSC组 6 12.3±3.6 29.3±5.9 68.3±2.2 80.2±3.2 GAS6/BMSC组 6 31.7±4.4 49.7±6.4 84.0±2.9 92.0±2.6 F值 33.38 30.18 86.95 40.69 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 P1值 0.980 0.780 0.015 0.030 P2值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：磷酸盐缓冲液（PBS）组、骨髓间充质干细胞（BMSC）组与过表达生长停滞特异性蛋白6的BMSC（GAS6/BMSC）组小鼠创面局部分别注射PBS、BMSC单细胞悬液、GAS6/BMSC单细胞悬液；处理因素主效应,F=197.30,P<0.001；时间因素主效应,F=1 399.00,P<0.001；两者交互作用,F=10.41,P<0.001；F值、P值为各时间点组间总体比较所得,P1值为BMSC组与PBS组各时间点比较所得,P2值为GAS6/BMSC组与BMSC组各时间点比较所得
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