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(1)重点从血管形成微环境、神经营养、细胞功能3个方面阐述了糖尿病足溃疡创面血管形成障碍的主要机制,并对目前的干预策略进行了汇总。

(2)针对新材料研发、干细胞治疗等促糖尿病足溃疡创面血管形成的热门研究方向进行了探讨。

Highlights:

(1)The main mechanisms for the development of angiogenesis disorders in diabetic foot ulcer wounds were expounded in focus from three aspects of angiogenesis microenvironment, neuronutrition, and cell function were expounded in focus, and the current intervention strategies were summarized.

(2)The hot research directions of promoting angiogenesis of diabetic foot ulcer wounds such as new materials research and development and stem cell therapy were discussed.

糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer,DFU）的发病率、截肢率、致死率高,是糖尿病最严重的并发症,给个人、家庭、社会造成了沉重负担^[1]。据统计,高达34%的糖尿病患者会出现DFU^[2],而高达1/4的DFU患者会被截肢,DFU也是造成患者下肢截肢的最主要原因^[3]。DFU发病机制复杂,高血糖引发的神经、血管病变导致局部组织缺血、缺氧,加之感染、炎症等多种因素造成创面愈合困难^[4]。创面局部有效微循环的建立是慢性创面愈合的先决条件,尤其是在DFU中,局部微环境的改善,可以促进血管形成,有效加速创面愈合^[5]。但因DFU局部高血糖、氧化应激、高炎症环境等多种因素刺激导致内皮细胞、干细胞损伤,加之神经营养受损,导致创面血管形成障碍^[6]。本文就DFU血管形成障碍问题,拟从血管形成微环境、神经营养及细胞功能3个方面对DFU微血管损伤相关机制及干预策略等相关新进展进行汇总阐述,以期为DFU治疗提供新的思路。

1.   DFU血管形成障碍的发生机制

创面愈合过程包括炎症、血管形成、组织增殖及重塑。血管形成通常被认为是新生血管的生长和现有血管的重塑,目的是恢复血管功能和结构。血管形成这一重要过程确保了氧气和营养物质被输送到损伤部位,促进创面有效愈合,是创面愈合过程中的关键阶段,血管内皮细胞、内皮祖细胞（endothelial progenitor cell,EPC）、干细胞等多种细胞参与其中。在DFU中,创面愈合功能障碍与血管形成不足密切相关^[7],高血糖、高炎症、缺血、缺氧、感染等微环境下各类血管形成相关细胞损伤,加之血管的神经营养受损,最终导致新生微血管数量减少^[8]。

1.1   创面局部微环境

血管形成受血管微环境中许多正性和负性的血管形成调节剂之间平衡的严格调控^[9]。在DFU中,高血糖、高炎症、缺血、缺氧、持续感染等多种微环境因素导致血管微环境调控失衡,血管形成受限,加重局部组织缺血、缺氧,进一步阻碍血管形成,形成恶性循环,加重组织损伤,在糖尿病创面的发病机制中起重要作用。

1.1.1   高血糖环境的影响

高血糖是糖尿病患者最基础的病理改变,也是DFU的重要微环境特征,对创面局部血管形成具有重要影响。研究表明,高血糖可导致内皮细胞功能障碍,诱导内皮细胞凋亡,从而使内皮细胞丧失对压力诱导下血管舒张的调控功能^{[10, 11]},加重微血管损伤。同时,高血糖刺激会激活多元醇、己糖胺、蛋白激酶C和晚期糖基化终末产物（advanced glycation end product,AGE）途径导致活性氧的过度产生,活性氧水平异常升高会改变内皮细胞等多种血管形成相关细胞的代谢,阻碍创面愈合进程^{[12, 13]}。持续高血糖也会导致AGE的不断累积,AGE通过与AGE受体（receptor for advanced glycation end product,RAGE）结合,激活MAPK/胞外信号调节激酶、TGF-β、c-Jun氨基端激酶和核因子κB等多条信号通路,增加细胞内氧化应激,加剧局部炎症反应^[14]。尤其是在白细胞中,AGE会与RAGE结合诱导白细胞的血管细胞黏附分子1表达增加,并加剧细胞内氧化应激反应,同时降低一氧化氮和内皮素1的水平^[15],影响血管形成。总之,不受控制的高血糖水平会通过多种途径损害创面血管形成,延迟创面愈合。

1.1.2   高炎症环境的影响

DFU创面愈合过程中最明显的特征是反复的炎症反应,局部大量炎症细胞浸润及炎症因子释放,这对局部血管形成构成了巨大挑战^[16]。研究表明,糖尿病患者血清中细胞因子IL-1β、单核细胞趋化蛋白-1和TNF-α升高与DFU创面难愈密切相关^{[17, 18]}；目前已经证明有13种促炎性细胞因子,包括TNF-α、IL-1β和IL-6等在高血糖环境中上调^[19]；也有研究证实,在高血糖环境中,表观遗传学改变（包括组蛋白乙酰化和甲基化）也可导致炎症细胞因子表达增加,炎症细胞因子表达增加会进一步诱发局部炎症反应,形成级联效应^[20]。DFU创面局部细菌感染不仅会趋化中性粒细胞、巨噬细胞等各类免疫细胞,还会加重局部炎症反应,从而导致血管形成及组织再生受限。

1.1.3   缺氧微环境的影响

DFU发生后,极易导致局部组织缺血、缺氧。一方面,各类因素导致的末端血管损伤阻碍了创面的氧气及营养物质的输送,使创面局部相对缺氧^{[21, 22]}。而局部相对缺氧的刺激会使机体募集大量炎症细胞,炎症细胞的高氧耗将加重缺氧损伤。另一方面,局部组织细菌感染严重,高血糖环境下细菌代谢加快,氧耗增加,会进一步加重缺血、缺氧^[23]。长期严重的组织缺氧将会抑制血管形成、造成大量细胞死亡,严重阻碍创面愈合过程。缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）信号通路是机体应对缺氧最重要的调控通路,其在缺氧时被激活以适应缺氧环境,与细胞增殖、代谢及血管形成等过程密切相关。在DFU中,虽然组织缺氧严重,但HIF-1信号通路却被抑制,机体对缺氧的适应性反应受损,从而减慢创面愈合进程^[24]。有研究表明,高血糖可以通过多种途径抑制HIF-1信号通路,包括脯氨酸羟化酶结构域蛋白介导HIF-1信号通路下调,细胞内甲基乙二醛积累导致HIF-1信号通路被抑制,进一步导致诱导血管形成关键的HIF-1靶基因VEGF-A、VEGF-受体1等表达下调^{[24, 25]}。因此,缺氧微环境对DFU创面血管形成有重要影响,也是治疗DFU创面的一个重要靶标。

1.1.4   生物膜的影响

DFU与混合微生物定植感染关系密切,其中区别于其他急性感染的最重要因素是厌氧菌感染^[26],厌氧菌感染后更易导致创面局部细菌生物膜形成^[27]。而生物膜因其致密性等特点在DFU创面中不仅为细菌定植提供了条件,而且为细菌快速增殖创造了良好的微环境。一方面,机体对生物膜的免疫应答促使大量的中性粒细胞和巨噬细胞聚集于生物膜周围,它们分泌的高水平的活性氧和蛋白酶严重阻碍了创面血管形成。另一方面,中性粒细胞的长期驻存导致炎症因子大量分泌,阻碍血管形成。研究显示,在DFU感染创面中促炎的基质金属蛋白酶-9水平升高,抗炎的基质金属蛋白酶-8水平降低,导致局部炎症水平升高,血管形成受阻,创面愈合延缓^[28]。因此去除生物膜不仅有利于感染控制,也有利于改善创面局部微环境,进而促进局部血管形成,改善创面愈合质量。

1.2   神经营养受损

DFU的外周神经病变既是创面难愈的重要影响因素,也是导致血管形成受阻的重要因素之一。支配足部的外周神经元是人体最长的细胞,需要充足的血液供应和有效的糖脂代谢以保障其功能发挥。而在DFU患者中,糖脂代谢紊乱诱发的下肢神经细胞的结构和功能损伤,致使神经对血管和肌肉的营养功能及其自身的感觉传输功能受损^[29]。研究表明,高血糖介导的神经细胞及神经支持细胞的损伤可能是导致糖尿病神经损伤的最重要因素^{[30, 31]}。而肥胖、血脂异常、神经营养支持和胰岛素信号传导受损以及微血管疾病等因素也可诱导相关细胞发生过度氧化应激,进而导致线粒体功能障碍及炎症,最终导致神经细胞死亡^[31]。

DFU的微血管改变程度与糖尿病神经病变的临床严重程度相关^[32]。伴随神经细胞的损伤和死亡,神经细胞对微血管的调控及营养作用也大大削弱。高血糖、大量的AGE、过多的氧化的中间密度脂蛋白功能失调,会加重创面局部循环障碍^[33]。有研究显示,多元醇和肌醇代谢紊乱,将导致糖尿病患者神经内的钠钾-三磷酸腺苷酶降解、神经血管缺陷、神经营养障碍、轴突运输缺陷以及神经元和转运蛋白的非酶糖基化^[34],从而导致周围神经对血管的营养功能下降或丧失。

施万细胞作为周围神经组织中最丰富的细胞,通过包裹神经轴突发挥营养神经的重要作用。在DFU创面局部组织缺氧状态下,施万细胞中多条炎症相关信号通路被激活,从而引发炎症级联反应,导致神经脱髓鞘改变,加重神经细胞损伤^[33]。研究表明,在糖尿病神经病变的周围神经和背根神经节中高水平表达的促炎转录因子：核因子κB蛋白,可以在氧分压下降时被上调,同时HIF-1α的表达升高^{[35, 36]}。而HIF-1α会导致还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2水平上调,进一步促进血管壁内活性氧自由基的累积,加重血管损伤,阻碍血管形成^[37]。综上所述,DFU的周围神经病变将加重微血管损伤,阻碍创面血管形成,延迟创面愈合。

1.3   血管形成相关细胞损伤及功能障碍

血管形成是指在已有的毛细血管中通过芽生等方式,激活血管内皮细胞,使其增殖、迁移、重建形成新的血管和血管网的复杂过程。血管形成是各类创面愈合的先决条件。在DFU中,各类因素导致促血管形成细胞因子和抑制血管形成细胞因子的平衡状态破坏,血管形成相关细胞活性及功能受损,血管形成障碍,创面愈合延迟。

1.3.1   血管内皮细胞

血管内皮细胞是血管形成过程中最重要的细胞,其活力直接决定血管形成的潜力。在DFU中,高血糖导致血管内皮细胞内活性氧生成增加,蛋白质的非酶糖基化水平升高,进而诱发慢性炎症,损害血管内皮细胞功能。糖尿病患者长期过高的氧化应激水平和高代谢状态也会损害内皮细胞代谢,导致VEGF和FGF等生长因子分泌减少,进而阻碍血管形成进程。AGE的形成,可通过提高促炎性细胞因子表达损害血管内皮细胞功能,进而阻碍血管形成^[38]。此外,在长期高血糖期间,糖基化的增加重新调整了人血管内皮细胞与KC的相互作用,限制了人血管内皮细胞在创面部位的移动,导致创面愈合受损^[39]。

1.3.2   EPC和干细胞

在创面血管形成过程中,EPC从骨髓迁移到外周血,聚集到缺血部位,然后分化为成熟的内皮细胞,进而形成具有功能的血管。在高血糖状态下,细胞的线粒体产生的活性氧水平升高,损害EPC的增殖、迁移及血管形成能力；另外高血糖也通过非编码RNA调节EPC的功能,如在DFU中上调的微小RNA-139-5p^[40]及微小RNA-155^[41]水平,将降低EPC的活性,从而影响糖尿病创面血管的形成。对EPC自噬的调控也是DFU创面血管形成的重要影响因素^[42]。研究表明,西格列汀可能通过基质细胞衍生因子-1α/趋化因子受体4轴降低EPC的自噬,从而增加循环EPC,促进糖尿病创面的血管形成^[43]。此外,其他干细胞也被用于DFU创面,以促进血管形成。研究表明,间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）可以通过增加促血管形成细胞因子VEGF的表达及对内皮细胞的募集来促进血管形成,在临床前和临床研究中被广泛应用^[44]。也有研究表明,干细胞及其外泌体具有促进DFU血管形成的重要作用^[45]。因此,干细胞具有促进DFU创面血管形成从而改善创面愈合的重要作用。

1.3.3   巨噬细胞

在DFU中,创面感染、AGE累积等多种因素导致巨噬细胞由抗炎的M2型向促炎的M1型转化,巨噬细胞的活性降低,使炎症持续,从而不利于血管形成。研究显示,在DFU中M1型巨噬细胞向M2型转化受损,导致血管形成不良、胶原沉积减少和创面愈合延迟,这可能是由于DFU中巨噬细胞对炎症刺激的过度反应,导致创面的炎症期不断延长,血管形成及组织修复程序无法启动所致^{[46, 47]}。加之AGE的不断累积,诱发表达RAGE的巨噬细胞数量增加,导致巨噬细胞吞噬作用大大减弱^[48],如研究者使用大鲵皮肤黏液多糖刺激M2型巨噬细胞极化在一定程度上促进了DFU创面血管形成,加速了创面愈合^[49]。因此,巨噬细胞功能障碍引发的持续性炎症是阻碍DFU创面血管形成的关键因素。

2.   DFU血管形成障碍的干预策略

2.1   改善创面微环境

改善创面局部高血糖、高炎症环境、缺氧及感染的微环境是促进DFU血管形成的关键。一方面可以通过药物调整血糖水平,改善机体整体内环境紊乱,减轻炎症反应程度；另一方面,可以通过彻底清创,去除坏死组织和感染源,为血管形成及创面愈合创造有利的微环境。高压氧治疗也被广泛用于DFU治疗中,研究表明其不仅可以提高血浆及创面处的氧浓度,改善缺氧微环境,抑制厌氧菌生长,还可以促进M1型巨噬细胞向M2型转化,降低局部炎症水平,促进血管形成和肉芽组织增生^{[50, 51, 52]}。目前,许多关于新型敷料及小分子物质的研究也致力于改善创面局部微环境。如Lan等^[53]构建了温敏性水凝胶作为递送小干扰RNA的平台,有效沉默了基质金属蛋白酶-9基因,改善了创面局部炎症微环境,促进了创面愈合；Li等^[54]研究显示过表达核转录因子红系2相关因子2的人脂肪干细胞外泌体可以有效降低大鼠DFU创面局部炎症和氧化应激水平,促进血管形成及组织修复。

2.2   加强神经营养与改善神经损伤

糖尿病神经损伤早于DFU发生,因此加强糖尿病患者的神经功能监测及改善神经损伤对于预防DFU发生具有重要意义。但糖尿病神经病变早期临床表现常较隐匿、易被忽略,目前尚无针对糖尿病神经损伤的特殊治疗手段^[31]。针对糖尿病患者的血糖控制及生活方式改变是重要预防手段,此外下肢神经电生理检测也是检测手段之一。若已出现神经损伤,则应积极处置,以延缓神经损伤,包括加强神经营养、改善微循环、减轻氧化应激、调节细胞代谢等^[55]。目前,各类物理疗法如电刺激、磁疗等,也被应用于治疗糖尿病神经病变,具有一定的神经改善作用^[56]。此外,大量研究显示脂肪干细胞及外泌体对于糖尿病神经病变改善具有积极作用,也可促进局部血管形成^[44,57],是目前研究的热点方向。

2.3   提高细胞活性与促进血管形成

提高内皮细胞、EPC及干细胞活性也是促进DFU创面血管形成的重要手段。在改善局部微环境基础上加入促血管形成细胞因子,可以在一定程度上加快创面愈合。EPC从骨髓募集到循环,然后迁移到损伤部位,参与血管形成过程,受包括VEGF、碱性FGF、EGF、胰岛素样生长因子Ⅰ、血小板源性生长因子等多种细胞因子的调控^[42]。在DFU局部加入生长因子可以在一定程度上提高EPC活性,从而促进创面愈合。MSC具有强大的增殖能力和分化能力,在一定环境下可以分化成包括血管内皮细胞和平滑肌细胞在内的多种细胞,从而促进局部创面的血管形成；同时,MSC通过旁分泌作用,释放多种促血管形成细胞因子,如VEGF、碱性FGF、HIF-1等,从而提高内皮细胞活性并减少其凋亡,促进血管形成^{[44, 45]}。研究显示,单体三磷酸鸟苷酶17是DFU中人真皮微血管内皮细胞血管形成的潜在调节因子,也是促进DFU创面血管形成的重要影响因素^[58]。因细胞因子及干细胞直接在创面使用会很快被清除,因此各类负载材料的研究也是DFU治疗探索的重要方向。

3.   总结与展望

目前,随着对DFU治疗研究的不断深入,促进创面局部血管形成对DFU创面愈合的重要意义也已被深刻认识,但现有改善血运的各项治疗手段仍无法阐明血管形成障碍的具体机制。改善DFU局部血管形成、促进创面愈合在临床治疗中仍面临巨大的挑战^[59]。探索有效的血管形成策略对于提高糖尿病患者的愈合效果、降低截肢风险、改善整体身体健康至关重要。目前针对各类创面敷料的研究主要集中于调节创面局部复杂微环境及提高各类修复细胞的活力,旨在改善炎症、促进血管形成、加速创面愈合。但其中大量研究都仍处在实验阶段,距离转化应用还有很长的路要走。从不同角度对DFU创面血管形成受阻机制进行探索,从而找到针对性治疗策略将是未来研究的重要方向。

目前生物材料与细胞、药物各类分子相结合的研究已成为DFU治疗探索的热点方向。无论是基于石墨烯、条件响应的水凝胶或纳米材料的骨架,还是这些材料携带的干细胞、外泌体、细胞因子及小分子药物等,目的均在于对局部微环境进行调节以利于血管形成和组织再生,提供一定的骨架支撑以利于血管组织网络的构建,加入部分血管形成所需细胞及因子为血管形成提供一定的细胞准备。总之,随着对DFU创面微血管损伤机制研究及新材料探索的不断深入,对DFU血管形成的干预手段也不断丰富,将为治愈DFU带来新的希望。