摘要: 目的探讨小鼠脂肪来源问充质干细胞培养上清液（ADSC-CM）对热损伤引起KC（人表皮细胞株HaCaT）凋亡的影响。方法（1）取5只健康BALB／c小鼠双侧腹股沟脂肪组织，采用胶原酶消化法分离纯化脂肪来源间充质干细胞（ADSC）。取第3代细胞进行形态学观察，采用流式细胞仪检测间充质十细胞表面标志物CD3l、CD34、CD45、CD90、CDl05的表达，并行成脂成骨诱导分化鉴定。（2）利用51．5℃水浴孵育HaCaT细胞35S建立KC热损伤模型，流式细胞仪检测热损伤后即刻细胞凋亡率。（3）另取热损伤后HaCaT细胞按照随机数字表法分为常规培养组、无血清培养组、50％ADSC-CM组、100％ADSC-CM组，分别以含体积分数10％FBS的DMEM培养液、无血清的DMEM培养液、含体积分数50％ADSC．CM的DMEM培养液、体积分数100％ADSC-CM培养24h。采用吖啶橙-溴化乙啶（AO—EB）染色法观察各组细胞的凋亡情况，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实时荧光定量RT—PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞Bcl-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（easpase-3）的mRNA和蛋白表达水平（蛋白表达结果以灰度值比值表示）。流式细胞仪检测各组细胞周期分布。以上实验均重复测定3次。对数据行单因素方差分析和LSD．t检验。结果（1）分离培养的细胞形态规则，与Fb类似，CD3l、CD34、CD45阳性表达率低于10．0％，CD90、CDl05阳性表达率均高于90．0％，经诱导后可分化成脂肪细胞、骨细胞，鉴定为ADSC。（2）热损伤后即刻，HaCaT细胞的凋亡率为（9．8±0．4）％。（3）AO—EB染色结果显示，无血清培养组HaCaT细胞凋亡数量明显多于其他3组。无血清培养组细胞凋亡率为（8．1±1．2）％，明显高于50％ADSC-CM组的（6．0±0．8）％、常规培养组的（4．6±0．8）％和100％ADSC-CM组的（3．1±0．4）％（t值分别为3．02、4．96、6．60，P值均小于0．01）；100％ADSC-CM组细胞凋亡率接近于常规培养组（t=1．50，P〉0．05），而明显低于50％ADSC-CM组（t：10．21，P〈0．01）。（4）无血清培养组的Bcl-2mRNA表达量为0．34±0．08，显著低于常规培养组的0．98±0．04、50％ADSC-CM组的0．77±0．05和100％ADSC．CM组的1．06±0．04（t值分别为12．87、8．07、14．11，P值均小于0．01）；100％ADSC-CM组的Bel-2mRNA表达量接近于常规培养组（t=0．08，P〉0．05），且明显高于50％ADSC-CM组（t=8．08，P〈0．01）。（5）无血清培养组的caspase-3mRNA表达量为1．15±0．05，明显高于50％ADSC．CM组的0．72±0．1l、常规培养组的0．4l±0．03和100％ADSC-CM组的0．38±0．11（t值分别为6．93、13．97、22．79，P值均小于0．01）；100％ADSC-CM组的caspase-3mRNA表达量接近于常规培养组（t=0．05，P〉0．05），但明显低于50％ADSC-CM组（t=4．77，P〈0．01）。（6）无血清培养组的Bcl-2蛋白表达量为0．93±0．04，显著低丁常规培养组的1．74±0．06、50％ADSC-CM组的1．32±0．05和100％ADSC-CM组的1．90±0．04（z值分别为20．45、11．15、31．38，P值均小于0．01）；100％ADSC-CM组的Bcl-2蛋白表达量接近于常规培养组（t=1．33，P〉0．05），且明显高于50％ADSC-CM组（t=17．30，P〈0．01）。（7）无血清培养组的caspase-3蛋白表达量为0．63±0．08，明显高于50％ADSC-CM组的0．46±0．03、常规培养组的0．29±0．08和100％ADSC-CM组的0．21±0．03（t值分别为3．28、5．05、8．46，JP值均小于0．01）；100％ADSC-CM组的caspase-3蛋白表达量接近于常规培养组（t=0．08，P〉0．05），但明显低于50％ADSC-CM组（t=3．52，P〈0．05）。（8）培养24h，与无血清培养组比较，其他3组G2／M期细胞比例显著降低（t值分别为6．88、4．08、7．28，P〈0．05或P〈0．01）；与无血清培养组比较，常规培养组、100％ADSC-CM组处于s期的细胞比例明显增加（t值分别为2．67、2．40，P值均小于0．05）；各组G0／G1期细胞比例无明显变化（F=0．70，P〉0．05）。结论异种体积分数为100％的ADSC-CM可通过调节Bcl-2、caspase-3的表达来抑制热损伤引起的HaCaT细胞凋亡，缓解细胞G2／M期阻滞，加快细胞周期进程，推测异种或异体体积分数为100％的ADSC．CM在烧伤创面早期治疗方面有一定的应用潜力。