Effects of bio-strength electric field on the motility and CD9 expression of human epidermal cell line HaCaT and mouse epidermal cells
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摘要:
目的 探讨生物强度电场对人表皮细胞株HaCaT和小鼠表皮细胞运动性及CD9表达的调节作用。 方法 采用实验研究方法。取对数生长期人永生化表皮细胞株HaCaT细胞及分离自16只1～3 d龄雌雄不拘BALB/c小鼠的原代表皮细胞进行实验。将HaCaT细胞分为200 mV/mm电场强度处理3 h的加电组和模拟处理的假电组，在活细胞工作站中观察细胞迁移(运动方向、位移速度、轨迹速度，加电组样本数为46、假电组样本数为34)及排列，免疫荧光法检测CD9蛋白的分布及表达。将HaCaT细胞与小鼠表皮细胞均分为假电组(模拟处理)和进行相应电场强度处理3 h的50 mV/mm组、100 mV/mm组、200 mV/mm组、400 mV/mm组，将HaCaT细胞与小鼠表皮细胞均分为未行处理的空白对照组和用200 mV/mm电场强度分别处理相应时间点的1 h组、3 h组、6 h组，蛋白质印迹法检测CD9的蛋白表达(样本数为3)。对数据行Mann-Whitney
U 检验、单因素方差分析、独立样本
t 检验及LSD检验。 结果 处理3 h内，加电组HaCaT细胞明显趋向负极移动，假电组HaCaT细胞围绕原点随机运动；与假电组比较，加电组HaCaT细胞方向性显著增强，位移速度、轨迹速度显著加快(
Z ＝-3.975、-6.052、-6.299，
P <0.01)。处理3 h后，加电组HaCaT细胞长轴与电场方向垂直，假电组HaCaT细胞呈任意取向排列。处理3 h后，加电组HaCaT细胞CD9蛋白(均位于细胞膜上)相对表达量明显低于假电组(
t ＝4.527，
P <0.01)。处理3 h后，假电组、50 mV/mm组、100 mV/mm组、200 mV/mm组、400 mV/mm组HaCaT细胞、小鼠表皮细胞CD9蛋白表达量分别为0.332±0.021、0.283±0.032、0.254±0.020、0.231±0.041、0.212±0.031与0.565±0.021、0.453±0.022、0.389±0.020、0.338±0.021、0.233±0.011。对于2种细胞而言，与假电组比较，电场处理4组细胞CD9蛋白表达量均明显降低(
P <0.01)；与50 mV/mm组比较，另外3个电场强度处理组细胞CD9蛋白表达量均明显降低(
P <0.01)；与100 mV/mm组比较，200 mV/mm组、400 mV/mm组细胞CD9蛋白表达量均明显降低(
P <0.01)；与200 mV/mm组比较，400 mV/mm组细胞CD9蛋白表达量明显降低(
P <0.01)。空白对照组、1 h组、3 h组、6 h组HaCaT细胞、小鼠表皮细胞CD9蛋白表达量分别为0.962±0.031、0.784±0.020、0.531±0.021、0.409±0.011与0.963±0.031、0.872±0.031、0.778±0.040、0.591±0.041。对于2种细胞而言，与空白对照组比较，1 h组、3 h组、6 h组细胞CD9蛋白表达量均明显降低(
P <0.01)；与1 h组比较，3 h组、6 h组细胞CD9蛋白表达量均明显降低(
P <0.05或
P <0.01)；与3 h组比，6 h组细胞CD9蛋白表达量明显降低(
P <0.01)。 结论 生物强度电场可使HaCaT细胞发生定向迁移和排列，可下调HaCaT细胞和小鼠表皮细胞中CD9的表达，且呈电场强度与处理时间依赖性。
Abstract:Objective To investigate the regulatory effect of bio-strength electric field (EF) on the motility and CD9 expression of human epidermal cell line HaCaT and mouse epidermal cells. Methods The experimental research method was used. Human immortal epidermal cell line HaCaT cells in logarithmic growth phase and primary epidermal cells isolated from 16 BALB/c mice (no matter male or female) aged 1-3 days were used for experiments. HaCaT cells were divided into EF group treated for 3 h at the EF intensity of 200 mV/mm and sham EF group with simulated treatment. The cell migration (direction, displacement velocity, and trajectory velocity, with 46 samples in EF group and 34 samples in sham EF group) and arrangement were observed in the living cell workstation, and the distribution and expression of CD9 protein were detected by immunofluorescence method. Both HaCaT cells and mouse epidermal cells were divided into sham EF group (simulated treatment) and EF groups treated respectively for 3 h at the corresponding EF intensity of 50, 100, 200, and 400 mV/mm. Both HaCaT cells and mouse epidermal cells were divided into blank control group without any treatment, and 1 h group, 3 h group, and 6 h group treated with EF at the intensity of 200 mV/mm for corresponding time respectively. The expression of CD9 protein was detected by Western blotting (
n =3). Data were statistically analyzed with Mann-Whitney
U test, one-way analysis of variance, independent sample
t test and least significant difference test. Results Within 3 hours of treatment, HaCaT cells in EF group tended to move towards the negative electrode obviously, while HaCaT cells in sham EF group moved randomly around the origin; compared with those of sham EF group, the directivity of HaCaT cells in EF group was significantly enhanced, and the displacement velocity and trajectory velocity were significantly increased (
Z =-3.975, -6.052, -6.299,
P <0.01). After 3 hours of treatment, the long axis of HaCaT cells in EF group was perpendicular to the direction of EF, while HaCaT cells in sham EF group arranged randomly. After 3 hours of treatment, the expression of CD9 protein in HaCaT cells in EF group was significantly down-regulated compared with that of sham EF group (
t =4.527,
P <0.01), although both expressed on cytomembrane. After 3 hours of treatment, the expression of CD9 protein in HaCaT cells and mouse epidermal cells in sham EF group, 50 mV/mm group, 100 mV/mm group, 200 mV/mm group, and 400 mV/mm group were 0.332±0.021, 0.283±0.032, 0.254±0.020, 0.231±0.041, 0.212±0.031 and 0.565±0.021, 0.453±0.022, 0.389±0.020, 0.338±0.021, 0.233±0.011, respectively. For both types of cells, compared with that of sham EF group, the expression of CD9 protein in cells was significantly decreased in the four groups of EF treatment (
P <0.01); compared with that of 50 mV/mm group, the expression of CD9 protein in cells was significantly decreased in the other three groups of EF treatment (
P <0.01); compared with that of 100 mV/mm group, the expression of CD9 protein in cells was significantly decreased in 200 mV/mm group and 400 mV/mm group (
P <0.01); compared with that of 200 mV/mm group, the expression of CD9 protein in cells was significantly decreased in 400 mV/mm group (
P <0.01). The expression levels of CD9 protein in HaCaT cells and mouse epidermal cells in blank control group, 1 h group, 3 h group, and 6 h group were 0.962±0.031, 0.784±0.020, 0.531±0.021, 0.409±0.011 and 0.963±0.031, 0.872±0.031, 0.778±0.040, 0.591±0.041, respectively. For both types of cells, compared with that of blank control group, the expression of CD9 protein in cells was significantly decreased in 1 h group, 3 h group, and 6 h group (
P <0.01); compared with that of 1 h group, the expression of CD9 protein in cells was significantly decreased in 3 h group and 6 h group (
P <0.05 or
P <0.01); compared with that of 3 h group, the expression of CD9 protein in cells was significantly decreased in 6 h group (
P <0.01). Conclusions The bio-strength intensity EF can induce the directional migration and arrangement of HaCaT cells and down-regulate the expression of CD9 in HaCaT cells and mouse epidermal cells in a time-dependent and intensity-dependent manner.
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Key words:
- Cell movement /
- Biological intensity electric field /
- Epidermal cells /
- CD9
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(1)表征了猪膀胱脱细胞基质与可吸收敷料的结构和成分差异，并证实了前者可增强小鼠巨噬细胞运动和趋化功能，诱导巨噬细胞向M2型极化的内在活性。
(2)明确了猪膀胱脱细胞基质可促进小鼠巨噬细胞快速迁入支架内部，并持续诱导巨噬细胞发生M2型极化和发挥旁分泌作用，营造促组织原位新生微环境。
近年来，利用生物活性材料促进原位组织再生（in situ tissue regeneration，ISTR）的组织工程策略得到快速发展。ISTR生物活性材料具有良好的生物相容性和低免疫原性。其中，Ⅰ型胶原蛋白多孔支架等人工材料因基本成分、结构与ECM相似，在ISTR领域的应用研究越来越受到关注［1］。然而临床证据显示，合成胶原蛋白支架缺乏生物活性分子，促进细胞迁入的能力及支架本身重塑能力不足［2］。猪膀胱脱细胞基质（urinary bladder matrix，UBM）由基底膜和脱细胞固有层组成，主要成分是结构蛋白如Ⅰ型胶原和层粘连蛋白，以及糖蛋白和生长因子等活性分子［3, 4］，现已被广泛用于修复软组织缺损，并且其单独应用即可促进复杂创面的愈合和皮肤重建［5］。相比而言，合成胶原蛋白支架还需结合负压吸引技术来实现复杂创面封闭［6］，并存在血管化不足及瘢痕形成等不足［7］。研究显示，调节巨噬细胞行为和功能是利用ECM生物支架促进ISTR的重要机制［8, 9］。
基于以上现状，本研究用尿素缓冲液提取猪UBM及胶原蛋白真皮替代支架——可吸收敷料（皮耐克）的可溶性成分，并检测其对小鼠骨髓源巨噬细胞运动和极化的影响。通过构建皮下埋植小鼠模型，探讨支架在小鼠体内对巨噬细胞的浸润、激活以及微环境的影响，以期为该支架在创面修复中的合理选用提供依据。
1. 材料与方法
本实验研究遵循江南大学动物实验伦理委员会和国家有关实验动物管理和使用的相关规定。
1.1 动物与主要试剂来源
18只健康无特殊病原体级6~8周龄体重23~25 g雄性C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。猪UBM购自美国ACell公司，可吸收敷料购自日本Gunze株式会社。猪Ⅰ型胶原蛋白购自无锡贝迪生物工程股份有限公司。DMEM/F12培养基、青霉素/链霉素双抗、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Gibco公司。易必迪划痕愈合插件购自德国ibidi公司。Transwell培养板和小室（滤孔孔径8 μm）购自美国Corning公司。多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物标记的大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体、别藻蓝蛋白标记的大鼠抗小鼠CD206单克隆抗体和藻红蛋白标记的大鼠抗小鼠 CD86单克隆抗体购自美国Bio Legend公司。大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体，兔抗小鼠F4/80、CD86和Ⅰ型胶原蛋白单克隆抗体及兔抗小鼠CD206、TGF-β1、VEGF、基质金属蛋白酶9（MMP-9）多克隆抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记的驴抗兔IgG多克隆抗体购自北京博斯特生物科技有限公司。异硫氰酸荧光素标记的山羊抗大鼠IgG多克隆抗体和二苯并环辛炔标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体购自美国Jackson Immunoresearch公司。巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）购自美国PeproTech公司。
1.2 2种支架的微观结构观察
剪取适宜大小的猪UBM及可吸收敷料，固定于载物台并喷金，均在200、1 000倍扫描电子显微镜下观察微观结构。
1.3 2种支架浸提液的蛋白质分布
取250 mg的猪UBM和可吸收敷料支架，以含2 mol/L尿素的150 mmol/L氯化钠缓冲液浸泡2 d，离心和透析后获得2种支架的浸提液。将2种浸提液和Ⅰ型胶原蛋白溶液（1 mg/mL）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察浸提液中蛋白质在（30~270）×103区间的分子量分布，并与Ⅰ型胶原蛋白溶液进行对比。
1.4 巨噬细胞的提取与鉴定
取6只小鼠，脱颈处死后分离其双后肢股骨与胫骨，反复冲洗骨髓腔后以含体积分数10%胎牛血清、20 ng/mL M-CSF的DMEM/F12培养基重新悬浮原代骨髓源细胞，并在37 ℃、含体积分数5%二氧化碳的培养箱中培养诱导7 d，刺激其分化为原代巨噬细胞。采用流式细胞术，以多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物标记的大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体（稀释比为1∶1 000）检测F4/80阳性细胞百分比。
1.5 细胞迁移测定
1.5.1 划痕试验
将划痕插件放置在直径为35 mm培养皿的底部，将新提取的原代骨髓源细胞直接接种于插件的双室内，每室接种细胞数为2×104个。同1.4培养诱导7 d后，刺激室内细胞分化为原代巨噬细胞后移除插件。将原代巨噬细胞分为猪UBM浸提液组和可吸收敷料浸提液组，在培养皿中分别加入200 μL含体积分数10%相应浸提液的DMEM/F12培养基。分别于划痕后0（即刻）、1、3、7 d，在40倍倒置相差显微镜下观察细胞划痕愈合情况并采用ImageJ 1.51图像分析软件（美国国立卫生研究院）计算划痕后1、3、7 d的细胞迁移率。细胞迁移率=（划痕后 0 d 划痕面积-划痕后其他时间点划痕面积）÷划痕后 0 d 划痕面积×100%。
1.5.2 Transwell实验
取原代巨噬细胞同1.5.1分组，在24孔板中每孔加入500 μL含体积分数10%相应浸提液的DMEM/F12培养基。将Transwell小室置于孔板中，用不含胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮原代巨噬细胞，并接种到Transwell小室中，每孔2×104个细胞。分别于培养12、24 h，行结晶紫染色。于100倍倒置相差显微镜下拍摄3个视野，计数迁移细胞，结果取均值。
1.6 细胞极化测定
将原代巨噬细胞以每孔4×105个的密度接种于6孔板中，同1.5.1分组，每孔加入2 mL含体积分数10%相应浸提液的DMEM/F12培养基。培养24 h，收集各组细胞，加入别藻蓝蛋白标记的大鼠抗小鼠CD206单克隆抗体（稀释比为1∶1 000）及藻红蛋白标记的大鼠抗小鼠CD86单克隆抗体（稀释比为1∶1 000），于4 ℃避光孵育30 min。采用流式细胞仪检测CD206和CD86阳性细胞百分比。
以上实验样本数均为3。
1.7 动物实验
1.7.1 动物分组与建模
取12只小鼠，采用10 mg/mL氯胺酮（90 mg/kg）和1.6 mg/mL甲苯噻嗪（10 mg/kg）腹腔注射麻醉，背部脱毛，碘伏消毒。沿小鼠背部中线皮肤制作一个长1 cm的切口，钝性分离切口左右皮肤和皮下组织。将每只小鼠左侧切口纳入猪UBM组、右侧切口纳入可吸收敷料组，分别植入5 mm×5 mm的猪UBM、可吸收敷料，其中猪UBM固有层一面朝向皮肤。
1.7.2 组织学分析
术后7、14 d，各取6只小鼠，颈椎脱臼处死，切取植入的支架及其上方全层皮肤组织，常规制作石蜡切片（厚6 μm）。每个时间点每只小鼠取2张切片，每组各1张，行HE染色，分别在100、400倍光学显微镜下拍摄3个视野，并计数400倍视野下浸润的炎症细胞，结果取均值。
1.7.3 免疫组织化学分析
另取1.7.2制作的部分切片，行免疫组织化学法染色，其中一抗为兔抗小鼠F4/80单克隆抗体（稀释比为1∶200），兔抗小鼠TGF-β1、VEGF、MMP-9多克隆抗体（稀释比均为1∶200），兔抗小鼠Ⅰ型胶原蛋白单克隆抗体（稀释比为1∶500）；二抗为HRP标记的驴抗兔 IgG多克隆抗体（稀释比为1∶200）。于 400倍光学显微镜下观察F4/80、TGF-β1、VEGF、MMP-9和Ⅰ型胶原蛋白的阳性表达（均为棕色），并拍摄3个视野，计数F4/80、TGF-β1、VEGF和MMP-9阳性细胞，结果取均值。
1.7.4 免疫荧光分析
另取1.7.2制作的部分切片，采用免疫荧光法检测巨噬细胞极化情况。其中一抗为大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体（稀释比为1∶200）、兔抗小鼠CD86单克隆抗体（稀释比为1∶100）、兔抗小鼠CD206多克隆抗体（稀释比为1∶200），二抗为异硫氰酸荧光素标记的山羊抗大鼠IgG多克隆抗体和二苯并环辛炔标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比均为1∶200），采用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色（阳性为蓝色）。F4/80阳性染色呈绿色代表巨噬细胞，CD86、CD206阳性染色均呈樱红色，F4/80分别与CD86、CD206双阳性表达均呈白色，分别代表巨噬细胞发生M1型、M2型极化。于200倍荧光显微镜下获取图像并分别计算CD86、CD206阳性细胞百分比。
1.8 统计学处理
采用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 2种支架的微观结构
猪UBM的一面为致密的基底膜结构，另一面为含有纤维结构的多孔固有层。可吸收敷料的两面均呈三维多孔结构。见图1。
1 可吸收敷料及猪膀胱脱细胞基质（UBM）支架的微观结构。1A、1B.分别为可吸收敷料的上、下表面，均呈三维多孔结构 扫描电子显微镜×200；1C.猪UBM上表面呈致密的基底膜结构 扫描电子显微镜×200；1D.猪UBM下表面呈含有纤维结构的多孔固有层 扫描电子显微镜×200；1E、1F.分别为图1A、1B中方框处放大图，显示可吸收敷料清晰的孔状结构 扫描电子显微镜×1 000；1G、1H.分别为图1C、1D中方框处放大图，显示猪UBM清晰的基底膜结构和纤维结构 扫描电子显微镜×1 0002.2 2种支架浸提液的蛋白质分布
在（50~70）×103的分子量区间，猪UBM浸提液的泳道出现多条非Ⅰ型胶原蛋白条带，可吸收敷料浸提液的泳道中未出现明显条带。
2.3 巨噬细胞鉴定
F4/80阳性细胞百分比>95%，表明小鼠骨髓源细胞已被成功诱导为巨噬细胞。
2.4 细胞迁移情况
2.4.1 划痕试验
划痕后1、3、7 d，猪UBM浸提液组细胞迁移率均明显高于可吸收敷料浸提液组（P<0.05）。见图2、表1。
2 2组小鼠巨噬细胞划痕后各时间点剩余划痕面积 倒置相差显微镜×40。2A、2B、2C、2D.分别为可吸收敷料浸提液组划痕后0（即刻）、1、3、7 d；2E、2F、2G、2H.分别为猪膀胱脱细胞基质浸提液组划痕后0、1、3、7 d，其中图2F、2G、2H剩余划痕面积分别明显小于图2B、2C、2D表1 2组小鼠巨噬细胞划痕后各时间点细胞迁移率比较（%，组别 样本数 1 d 3 d 7 d 可吸收敷料浸提液组 3 13.6±2.4 19.5±1.5 29.7±2.0 猪膀胱脱细胞基质浸提液组 3 44.9±2.5 59.9±0.9 71.7±0.5 t值 15.31 19.76 20.58 P值 <0.001 <0.001 <0.001 注：处理因素主效应，F=110.80，P<0.001；时间因素主效应，F=1 032.00，P<0.001；两者交互作用，F=8.04，P=0.006 2.4.2 Transwell实验
培养12、24 h，猪UBM浸提液组细胞迁移数量均明显多于可吸收敷料浸提液组（P<0.05）。见表2、图3。
表2 Transwell实验观测培养各时间点2组小鼠巨噬细胞的迁移数量比较（个，组别 样本数 12 h 24 h 可吸收敷料浸提液组 3 16.0±1.3 26.0±2.7 猪膀胱脱细胞基质浸提液组 3 38.0±2.5 86.0±2.1 t值 12.20 33.26 P值 <0.001 <0.001 注：于100倍视野下计数；处理因素主效应，F=516.90，P<0.001；时间因素主效应，F=1 033.00，P<0.001；两者交互作用，F=221.90，P<0.001 
3 Transwell实验观察培养各时间点2组小鼠巨噬细胞的迁移情况 结晶紫×100。3A、3B.分别为可吸收敷料浸提液组、猪膀胱脱细胞基质（UBM）浸提液组培养12 h迁移至Transwell小室下层的细胞情况，图3B细胞数量明显多于图3A；3C、3D.分别为可吸收敷料浸提液组、猪UBM浸提液组培养24 h迁移至Transwell小室下层的细胞情况，图3D细胞数量明显多于图3C2.5 细胞极化情况
培养24 h，猪UBM浸提液组细胞中CD86阳性细胞百分比为（1.27±0.19）%，明显低于可吸收敷料浸提液组的（7.34±0.14）%（t=17.03，P<0.001）；猪UBM浸提液组细胞中CD206阳性细胞百分比为（73.4±0.7）%，可吸收敷料浸提液组细胞中CD206阳性细胞百分比为（32.2±0.5）%，组间比较差异有统计学意义（t=119.10，P<0.001）。
2.6 组织学分析
术后7、14 d，猪UBM组支架中浸润的炎症细胞数量均明显多于可吸收敷料组（P<0.05）。见图4、表3。
4 2组小鼠创面植入支架术后各时间点组织学观察。4A.术后7 d，可吸收敷料组支架底部聚集少量炎症细胞 苏木精-伊红×100；4B.术后7 d，猪膀胱脱细胞基质（UBM）组支架内部出现大量炎症细胞，较图4A明显增多 苏木精-伊红×100；4C.术后14 d，可吸收敷料组支架内部炎症细胞增多 苏木精-伊红×100；4D.术后14 d，猪UBM组支架内部炎症细胞广泛分布，较图4C明显增多 苏木精-伊红×100；4E、4F、4G、4H.分别为图4A、4B、4C、4D中方框处放大图，与放大前相比，可以看到更明显的炎症细胞浸润 苏木精-伊红×400注：炎症细胞细胞核呈深蓝色表3 2组小鼠植入支架术后各时间点浸润的炎症细胞数量比较（个，组别 样本数 7 d 14 d 可吸收敷料组 6 17.0±5.3 40.2±4.8 猪膀胱脱细胞基质组 6 41.8±2.2 77.5±6.5 t值 6.58 10.70 P值 <0.001 <0.001 注：于400倍视野下计数；处理因素主效应，F=132.60，P<0.001；时间因素主效应，F=146.50，P<0.001；两者交互作用，F=5.96，P=0.033 2.7 免疫组织化学分析
术后7、14 d，猪UBM组支架中F4/80、TGF-β1、VEGF和MMP-9阳性细胞数量均明显多于可吸收敷料组（P<0.05）；猪UBM组支架中Ⅰ型胶原蛋白沉积较可吸收敷料组更显著。见图5、表4。
5 2组小鼠创面植入支架术后各时间点F4/80、TGF-β1、VEGF、MMP-9和Ⅰ型胶原蛋白阳性表达（呈棕色） 二氨基联苯胺-苏木精×400。5A、5B、5C、5D.分别为术后7 d可吸收敷料组、术后7 d猪UBM组、术后14 d可吸收敷料组、术后14 d猪UBM组F4/80阳性表达情况，图5B、5D的F4/80阳性细胞数分别明显多于图5A、5C；5E、5F、5G、5H.分别为术后7 d可吸收敷料组、术后7 d猪UBM组、术后14 d可吸收敷料组、术后14 d猪UBM组TGF-β1阳性表达情况，图5F、5H的TGF-β1阳性细胞数分别明显多于图5E、5G；5I、5J、5K、5L.分别为术后7 d可吸收敷料组、术后7 d猪UBM组、术后14 d可吸收敷料组、术后14 d猪UBM组VEGF阳性表达情况，图5J、5L的VEGF阳性细胞数分别明显多于图5I、5K；5M、5N、5O、5P.分别为术后7 d可吸收敷料组、术后7 d猪UBM组、术后14 d可吸收敷料组、术后14 d猪UBM组MMP-9阳性表达情况，图5N、5P的MMP-9阳性细胞数分别明显多于图5M、5O；5Q、5R、5S、5T.分别为术后7 d可吸收敷料组、术后7 d猪UBM组、术后14 d可吸收敷料组、术后14 d猪UBM组Ⅰ型胶原蛋白阳性表达情况，图5R、5T的Ⅰ型胶原蛋白沉积分别较图5Q、5S明显注：TGF-β1为转化生长因子β1，VEGF为血管内皮生长因子，MMP-9为基质金属蛋白酶9，UBM为膀胱脱细胞基质表4 2组小鼠植入支架术后各时间点F4/80、TGF-β1、VEGF和MMP-9阳性细胞数量比较（个，组别 样本数 F4/80 TGF-β1 VEGF MMP-9 可吸收敷料组 6 7 d 12.3±1.1 10.2±0.9 14.4±1.3 17.7±2.4 14 d 11.3±1.8 18.7±1.1 14.0±1.5 19.7±1.1 猪膀胱脱细胞基质组 6 7 d 50.0±1.0 48.7±1.6 26.0±0.5 36.5±1.5 14 d 30.0±0.7 49.8±1.4 26.3±1.8 37.2±1.8 t1值 46.11 40.69 13.90 14.15 P1值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 t2值 19.79 32.93 12.16 13.21 P2值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：于400倍视野下计数；TGF-β1为转化生长因子β1，VEGF为血管内皮生长因子，MMP-9为基质金属蛋白酶9；F4/80、TGF-β1、VEGF、MMP-9处理因素主效应，F值分别为283.30、50.64、0.01、2.14，P值分别为<0.001、<0.001、0.943、0.175；时间因素主效应，F值分别为2 038.00、2 710.00、331.70、374.40，P值均<0.001；两者交互作用，F值分别为231.90、20.17、0.34、0.44，P值分别为<0.001、<0.001、0.571、0.522；t1值、P1值，t2值、P2值分别为组间术后7、14 d各指标两两比较所得 2.8 免疫荧光分析
术后7 d，猪UBM组支架底层出现巨噬细胞，少量细胞发生M2型极化；可吸收敷料组支架底部聚集少量巨噬细胞。术后14 d，猪UBM组支架内部散在分布M2型巨噬细胞，未见明显M1型巨噬细胞；可吸收敷料组支架内部细胞发生M1型极化，未见明显M2型巨噬细胞。见图6。
6 2组小鼠创面植入支架术后各时间点巨噬细胞的分布和极化 异硫氰酸荧光素-二苯并环辛炔-4'，6-二脒基-2-苯基吲哚×200。6A.术后7 d，猪UBM组支架底层出现大量巨噬细胞；6B.术后7 d，可吸收敷料组支架底部聚集少量巨噬细胞；6C.术后14 d，猪UBM组支架未见明显M1型巨噬细胞；6D.术后14 d，可吸收敷料组支架内部出现少量M1型巨噬细胞；6E.术后7 d，猪UBM组支架底层见少量M2型巨噬细胞；6F.术后7 d，可吸收敷料组支架未见明显M2型巨噬细胞；6G.术后14 d，猪UBM组支架内部散在分布M2型巨噬细胞；6H.术后14 d，可吸收敷料组支架内部未见明显M2型巨噬细胞注：UBM为膀胱脱细胞基质；各图中右上小图为细胞核染色（蓝色）图、右中小图为F4/80染色(绿色，表示巨噬细胞)图、右下小图为CD86或CD206染色（樱红色）图，各图中左侧大图为右侧3张小图的合成图（F4/80与CD86或CD206的双染呈白色，分别表示巨噬细胞发生M1型或M2型极化）；各图中虚线表示肉膜与材料的分界；图6A~6D为加入F4/80与CD86双抗后的染色，图6E~6H为加入F4/80与CD206双抗后的染色术后7、14 d，猪UBM组支架中CD206阳性细胞百分比均明显高于可吸收敷料组（P<0.05），CD86阳性细胞百分比均明显低于可吸收敷料组（P<0.05）。见表5。
表5 2组小鼠植入支架术后各时间点CD206和CD86阳性细胞百分比比较（%，组别 样本数 CD206 CD86 可吸收敷料组 6 7 d 41.2±10.1 80.2±7.9 14 d 56.0±8.9 72.1±2.5 猪膀胱脱细胞基质组 6 7 d 72.0±6.1 8.3±1.5 14 d 81.2±1.7 4.5±0.8 t1值 5.05 20.90 P1值 0.002 <0.001 t2值 4.13 19.64 P2值 0.007 <0.001 注：CD206、CD86处理因素主效应，F值分别为7.73、5.98，P值分别为0.024、0.040；时间因素主效应，F值分别为42.16、821.90，P值均<0.001；两者交互作用，F值分别为0.42、0.79，P值分别为0.543、0.399；t1值、P1值，t2值、P2值分别为组间术后7、14 d各指标两两比较所得 3. 讨论
本研究评估了猪UBM对巨噬细胞运动和分化的影响，以及调控其向支架内部迁移和营造有利于组织新生微环境的活性。本研究首先表征了猪UBM的微观结构和组成成分，以及这些成分对巨噬细胞运动和分化行为的影响。猪UBM固有层主要由三维纤维网状结构构成，与人工合成的可吸收敷料的孔状结构差异显著。相比孔状结构，纤维网状结构能增强Fb和巨噬细胞等细胞对支架的黏附［10, 11, 12, 13］。划痕试验中，猪UBM所含有的非Ⅰ型胶原蛋白的蛋白质成分增强了巨噬细胞的运动功能，并在Transwell实验中促进巨噬细胞趋化。Jiang等［14］研究揭示猪UBM含有血小板衍生生长因子、VEGF等成分，但未评估这些成分对巨噬细胞等参与组织修复细胞的行为的影响。通过流式细胞术，本研究证实了猪UBM所含非Ⅰ型胶原蛋白成分诱导巨噬细胞向M2型极化的活性。上述结果提示，猪UBM具有增强巨噬细胞趋化和运动，以及发生M2型极化的固有活性。
本研究评估了猪UBM在植入缺损区域后是否发挥与体外实验类似的对巨噬细胞行为的影响。本研究中猪UBM加速炎症细胞迁入，并提高这些细胞在纤维支架中的黏附和迁移能力，并且迁入炎症细胞以F4/80阳性巨噬细胞为主，与其他研究结果［15］一致。研究表明M1型巨噬细胞主要发挥促炎作用，清除微生物和坏死组织，M2型巨噬细胞通过分泌抗炎细胞因子、生长因子调控修复微环境及组织修复细胞的行为，促进组织新生［16, 17］。多种研究结果表明巨噬细胞向M2型极化是ECM支架介导组织重塑过程的关键因素［18, 19, 20］。免疫组织化学染色提示，与可吸收敷料相比，猪UBM植入后快速诱导F4/80阳性巨噬细胞迁入和部分发生M2型极化；并且，这一作用是持续性的。猪UBM诱导ISTR的发生依赖于其诱导巨噬细胞迁入和M2型极化的作用。戊二醛交联处理能使支架失去对巨噬细胞的调控活性，抑制周围组织巨噬细胞迁入，产生异物反应［21］，不引发排斥反应是猪UBM这类支架作为促进ISTR的基本性能之一。此外，巨噬细胞在重塑期的表型和功能变化是组织再生的重要条件之一［22, 23］。本研究进一步评估了猪UBM对迁入支架内部的巨噬细胞的旁分泌功能的作用。猪UBM诱导迁入细胞表达TGF-β1、VEGF、MMP-9等促进组织新生和重塑的功能分子。与猪UBM相似，其他支架同样通过促进迁入细胞合成TGF-β1、VEGF、MMP-9等功能分子［24, 25, 26, 27, 28］，塑造ISTR微环境。此外，Ⅰ型胶原蛋白的免疫组织化学染色显示，与可吸收敷料相比，猪UBM加速和增强了Ⅰ型胶原蛋白分子的合成及其在支架中的沉积。对皮肤损伤修复而言，MMP-9的合成和Ⅰ型胶原蛋白的沉积是ISTR的重要步骤和标志［29］。MMP-9合成的抑制会导致植入材料异物反应的发生［30］。因此，猪UBM通过诱导巨噬细胞迁入、向M2型极化、旁分泌生长因子和ECM重塑分子，在组织缺损处塑造ISTR微环境。
综上，本研究证实了猪UBM可增强巨噬细胞运动，诱导其向支架内部趋化和迁移，并发生M2型极化和发挥旁分泌功能，营造含有TGF-β1等生长因子和MMP-9组织重塑分子的微环境，促进组织新生和ECM重塑。
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