Changes in the related indicators of bone formation and bone resorption in severely burned rats
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摘要:
目的 研究严重烧伤大鼠骨形成及骨吸收相关指标的变化。 方法 采用实验研究方法。将30只6~8周龄SD雌性大鼠按随机数字表法分为假伤组、12%体表总面积（TBSA）Ⅲ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组，每组10只。于各组大鼠背部进行相应处理，之后仅烧伤大鼠按Parkland公式经腹腔注射补液，创面外涂20 g/L碘伏，直至创面愈合。伤后28 d，取各组大鼠胫骨组织，分别行Masson、抗酒石酸酸性磷酸酶染色，观察新生骨组织、破骨细胞数量；取各组大鼠腹主动脉血制备血清，分别采用甲基百里酚蓝比色法、磷钼酸法测定骨代谢指标血清钙离子、磷离子浓度，采用酶联免疫吸附测定法检测血清中骨形成标志物Ⅰ型前胶原氨基端前肽（P1NP）和骨吸收标志物β-Ⅰ型胶原羧基端肽（β-CTX）水平；取各组大鼠第1腰椎组织，采用实时荧光定量反转录PCR法检测护骨因子、核因子κB受体激活蛋白配体（RANKL）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF-6）、活化T细胞核因子1（NFATC1）、c-Fos、c-Src的mRNA表达水平。数据处理采用单因素方差分析、Bonferroni法、Welch检验、Games-Howell检验、Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验及Bonferroni校正。 结果 伤后28 d，与假伤组比较，2个烧伤组大鼠胫骨组织中新生骨组织生成均减少，烧伤面积越大减少越明显；2个烧伤组大鼠胫骨组织中破骨细胞数量相近，均较假伤组明显增多。伤后28 d，3组大鼠血清钙离子浓度、血清中β-CTX水平相近（P>0.05）；24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠血清磷离子浓度明显高于12%TBSAⅢ度烧伤组（P<0.05），且2个烧伤组大鼠血清磷离子浓度均显著高于假伤组（P<0.01）；24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠血清中P1NP水平明显低于假伤组（P<0.01）。伤后28 d，假伤组、12%TBSAⅢ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中护骨因子mRNA表达水平分别为1.01±0.20、1.71±0.83、2.24±0.51，其中24%TBSAⅢ度烧伤组明显高于假伤组（P<0.01）；24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中RANKL mRNA表达水平为1.31±0.17，明显高于假伤组的1.00±0.14与12%TBSAⅢ度烧伤组的0.97±0.10（P<0.01）；12%TBSAⅢ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中TRAF-6、NFATC1（Z=3.141、3.782）、c-Src mRNA表达水平及12%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中c-Fos mRNA表达水平均明显高于假伤组（P<0.05或P<0.01）；12%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中c-Fos、c-Src mRNA表达水平均明显高于24%TBSAⅢ度烧伤组（P<0.01）。 结论 严重烧伤可引起大鼠新生骨组织生成减少及破骨细胞数量增多，血清磷离子浓度升高与血清中P1NP水平下降，骨组织中护骨因子、RANKL、TRAF-6、NFATC1、c-Fos、c-Src呈升高趋势，且NFATC1、c-Fos、c-Src随烧伤总面积增加呈下降趋势。 -
关键词:
- 烧伤 /
- 骨生成 /
- 代谢 /
- 骨转换 /
- 护骨因子/核因子κB受体激活蛋白配体系统
Abstract:Objective To observe the changes in the related indicators of bone formation and bone resorption in severely burned rats. Methods The experimental research method was adopted. Thirty female Sprague-Dawley rats aged 6 to 8 weeks were divided into sham injury group, 12% total body surface area (TBSA) full-thickness burn group, and 24%TBSA full-thickness burn group according to the random number table, with 10 rats in each group. The rats were treated on the back correspondingly, after which, the burned rats were rehydrated by intraperitoneal injection according to the Parkland formula, and the wound was coated with 20 g/L iodophor until wound healing. On post injury day (PID) 28, the tibia tissue of rats in each group was collected. The new bone tissue and the number of osteoclasts were observed after staining with Masson and tartrate-resistant acid phosphatase, respectively. The abdominal aortic blood of rats in each group was harvested for serum preparation. The bone metabolism indexes of serum calcium ion and phosphorus ion concentration were determined by the methyl thymol blue colorimetric method and phosphomolybdic acid method, respectively. The serum levels of bone formation marker of aminoterminal propeptide of type 1 procollagen (P1NP) and bone resorption marker of beta-carboxy-terminated peptide of type Ⅰ collagen (β-CTX) were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. The first lumbar spine tissue of rats in each group was collected, and the mRNA expression levels of osteoprotegerin, receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL), tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF-6), nuclear factor of activated T cell 1 (NFATC1), c-Fos, and c-Src were detected by real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. Data were statistically analyzed with one-way analysis of variance, Bonferroni method, Welch test, Games-Howell test, Kruskal-Wallis test, Mann-Whitney U test, and Bonferroni correction. Results On PID 28, compared with that in sham injury group, the formation of new bone tissue in the tibia tissue of rats in the two burn groups was decreased, and the larger the burn area, the more obvious the decrease. The numbers of osteoclasts in the tibia tissue of rats in the two burn groups were similar, both significantly more than the number in sham injury group. On PID 28, the serum calcium ion concentration and serum level of β-CTX of rats in the three groups were similar (P>0.05). The serum phosphorus ion concentration of rats in 24%TBSA full-thickness burn group was significantly higher than that in 12%TBSA full-thickness burn group (P<0.05), and the serum phosphorus ion concentrations in the two burn groups were significantly higher than the concentration in sham injury group (P<0.01). The serum level of P1NP of rats in 24%TBSA full-thickness burn group was significantly lower than that in sham injury group (P<0.01). On PID 28, the mRNA expression levels of osteoprotegerin in the first lumbar spine tissue of rats in sham injury group, 12%TBSA full-thickness burn group, and 24%TBSA full-thickness burn group were 1.01±0.20, 1.71±0.83, and 2.24±0.51, respectively, and that in 24%TBSA full-thickness burn group was significantly higher than that in sham injury group (P<0.01). The mRNA expression level of RANKL in the first lumbar spine tissue of rats in 24%TBSA full-thickness burn group was 1.31±0.17, which was significantly higher than 1.00±0.14 in sham injury group and 0.97±0.10 in 12%TBSA full-thickness burn group (P<0.01). The mRNA expression levels of TRAF-6, NFATC1 (Z=3.141, 3.782), and c-Src in the first lumbar tissue of rats in 12%TBSA full-thickness burn group and 24%TBSA full-thickness burn group and the mRNA expression level of c-Fos in the first lumbar tissue of rats in 12%TBSA full-thickness burn group were significantly higher than those in sham injury group (P<0.05 or P<0.01). The mRNA expression levels of c-Fos and c-Src in the first lumbar spine tissue of rats in 12%TBSA full-thickness burn group were significantly higher than those in 24%TBSA full-thickness burn group (P<0.01). Conclusions Severe burns can cause a decrease in the generation of new bone tissue, an increase in the number of osteoclasts and the serum phosphorus ion concentration, and a decrease in the serum level of P1NP in rats. The level of osteoprotegerin, RANKL, TRAF-6, NFATC1, c-Fos, and c-Src in bone tissue showed an increasing trend while the level of NFATC1, c-Fos, and c-Src showed a decreasing trend with the increase of burn area. -
烧伤患者存在骨折发生率升高的风险［1］。严重烧伤成人髋骨骨折的发生率是健康成人的1.62倍［2］，严重烧伤儿童的四肢骨折发生率可高达健康儿童的2倍［3］。这主要是归因于严重烧伤后，机体内源性糖皮质激素增多和大量炎症细胞因子的产生直接和间接作用于成骨细胞和破骨细胞，使骨代谢异常［4, 5］，最终导致烧伤早期即出现骨质流失及骨密度下降［6, 7］。而且这种烧伤引起的骨质流失不仅发生于严重烧伤，即使是非严重烧伤也可能引起早期的骨密度下降［8］，但发病机制尚未阐明。
骨代谢是由成骨细胞的骨形成作用和破骨细胞的骨吸收作用共同维持的动态平衡［9］，当骨吸收强于骨形成时，则出现骨质流失［10, 11］。钙、磷是骨骼的重要组成成分，常用于代谢性骨病的诊断。目前国际上多推荐Ⅰ型前胶原氨基端前肽（P1NP）和β-Ⅰ型胶原羧基端肽（β-CTX）分别作为首选的骨形成与骨吸收标志物［12, 13］。而护骨因子/核因子κB受体激活蛋白配体（RANKL）系统是调节成骨细胞和破骨细胞之间通讯的关键信号通路［14］。因此，本研究从烧伤程度与骨形成及骨吸收相关指标变化2个方面阐述烧伤早期骨质流失的发病机制。
1. 材料与方法
本实验研究遵循武汉大学同仁医院暨武汉市第三医院和国家有关实验动物管理和使用的规定。
1.1 动物及主要试剂与仪器来源
30只无特殊病原体级6~8周龄健康雌性SD大鼠，体重150~170 g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2017-0012。多聚甲醛购自北京索莱宝科技有限公司，Masson染色试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染液试剂盒、无机磷测试盒、钙测试盒购自南京建成生物工程研究所有限公司，P1NP、β-CTX ELISA检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，RNA提取试剂盒、莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）反转录酶试剂盒、一步法荧光定量RT-PCR MasterMix试剂盒购自科鹿（武汉）生物科技有限公司，护骨因子、RANKL、TNF受体相关因子6（TRAF-6）、活化T细胞核因子1（NFATC1）、c-Fos、c-Src mRNA引物均由武汉金开瑞生物工程有限公司设计、合成。StepOne™型实时荧光定量PCR仪购自美国Life Technologies公司，TC-XP型基因扩增仪购自杭州博日科技股份有限公司，CX-21型光学显微镜购自日本OLYMPUS公司，TGL-16型冷冻离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，1680型酶标仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2 严重烧伤大鼠模型的制备及分组处理
取30只SD大鼠，按随机数字表法分为假伤组、12%TBSAⅢ度烧伤组和24%TBSAⅢ度烧伤组，每组10只。实验前12 h禁食、自由饮水。所有大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，背部常规脱毛。2个烧伤组大鼠行皮肤Ⅲ度烧伤造模：使用直径60 mm的黄铜棒加热至95 ℃，接触中下背部皮肤10 s。将12%TBSAⅢ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠分别制成12%、24%TBSAⅢ度烧伤（经病理切片证实）模型［15］，另伤后即刻均按Parkland公式经腹腔注射补液，第1个24 h补充乳酸林格液4 mL·kg-1·%TBSA-1，其中前8 h补充1/2，后16 h补充1/2；第2、3个24 h分别再补充总量的1/2，补液期间均正常进食、饮水［16］。造模后大鼠均单笼饲养，创面每日按时外涂20 g/L碘伏，保持干燥并定期护理，至愈合。假伤组大鼠除用常温黄铜棒接触背部皮肤10 s致假伤后常规单笼饲养外，不行其他处理。
1.3 标本采集
伤后28 d，同前麻醉各组大鼠，并取腹主动脉血4 mL，以400×g离心15 min后分离血清，放入-80 ℃冰箱保存备用。取血后立即断颈处死大鼠，迅速分离右侧胫骨和第1腰椎，去除右侧胫骨肌肉和结缔组织，将胫骨组织置入40 g/L多聚甲醛溶液固定，常温保存备用；去除第1腰椎软组织和椎体附件，将第1腰椎组织放入-80 ℃冰箱保存备用。
1.4 检测指标
1.4.1 胫骨组织成骨情况和破骨细胞数量
取每只大鼠固定24 h以上的胫骨组织50~100 mg，用乙二胺四乙酸进行脱钙处理4周，流水冲洗24 h去酸，梯度乙醇脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋、切片（厚度为5 μm）［17］。根据试剂盒说明书分别进行Masson和TRAP染色，在100倍光学显微镜下分别观察胫骨组织成骨情况和破骨细胞数量。Masson染色结果判定：新生骨质红染少，成熟骨内红染多，即红染越多，骨质越成熟；TRAP染色结果判定：破骨细胞呈酒红色，细胞核数越多，破骨细胞分化水平越高。
1.4.2 血清钙离子与磷离子浓度
每只大鼠取血清2 mL，解冻后，分别采用甲基百里酚蓝比色法、磷钼酸法检测骨代谢指标血清钙离子、磷离子浓度，具体分别参照无机磷测试盒、钙测试盒说明书进行操作，采用酶标仪分别测定610、660 nm波长处吸光度值，常规计算各个指标含量。本实验重复3次，结果取均值。
1.4.3 血清P1NP与β-CTX水平
每只大鼠取血清2 mL，解冻后，采用ELISA法检测骨代谢指标血清中P1NP、β-CTX水平。严格按照ELISA检测试剂盒说明书操作，在0.5 h内，用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值。以标准对数浓度为横坐标，测量的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，计算各个指标表达水平。本实验重复3次，结果取均值。
1.4.4 第1腰椎组织中护骨因子/RANKL系统指标mRNA表达水平
采用实时荧光定量RT-PCR法检测［18］。每只大鼠取第1腰椎组织50~100 mg，液氮研磨后用RNA提取试剂盒提取总RNA，酶标仪分析RNA浓度和纯度，M-MLV反转录酶试剂盒进行互补DNA合成反应。根据一步法荧光定量RT-PCR MasterMix试剂盒操作步骤，使用实时荧光定量PCR仪进行荧光定量分析，引物序列及产物大小见表1。以β肌动蛋白为内参照，基于Δ循环阈值（Ct）的2-ΔΔCt法对护骨因子、RANKL、TRAF-6、NFATC1、c-Fos、c-Src的mRNA相对表达进行定量，以假伤组结果为1，其余组与其比值为相应蛋白mRNA表达水平的相对值。每个样本3个复孔，结果取均值。
表1 实时荧光定量反转录PCR法检测大鼠第1腰椎组织中护骨因子/RANKL系统指标的引物序列及产物大小指标名称 引物序列（5'→3'） 产物大小（bp） β肌动蛋白 上游：CGTTGACATCCGTAAAGACCTC 110 下游：TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT 护骨因子 上游：TGTTCTGGTGGACAGTTTGCC 279 下游：CTCTCAATCTCGTCTGGGCTG RANKL 上游：CCATCGGGTTCCCATAAAGTC 148 下游：GATGCCTGAAGCAAATGTTGG TRAF-6 上游：AAGCTGTCCTCTGGCAAATATC 193 下游：CATGTGCAACTGGGTGTTCTC NFATC1 上游：CAGCCACGAGGCTATCCTGT 151 下游：TCTCCCGATGTCTGTCTCCC c-Fos 上游：GAGAAACGGAGAATCCGAAGG 259 下游：TCAAGTCCAGGGAGGTCACAG c-Src 上游：GCAAGATCACTAGACGGGAATC 126 下游：TGTCAAAGTCGGATACAGAGAGG 注：RANKL为核因子κB受体激活蛋白配体，TRAF-6为肿瘤坏死因子受体相关因子6，NFATC1为活化T细胞核因子1 1.5 统计学处理
采用SPSS 22.0统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料数据以
2. 结果
2.1 胫骨组织成骨情况和破骨细胞数量
伤后28 d，假伤组大鼠胫骨组织中新生骨组织覆盖范围广泛；与假伤组相比，2个烧伤组大鼠胫骨组织中新生骨组织生成均减少；24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠胫骨组织中新生骨组织较12%TBSAⅢ度烧伤组减少。见图1。
1 假伤组与2种面积Ⅲ度烧伤组大鼠伤后28 d胫骨组织成骨情况（红色）比较 Masson×100。1A.假伤组新生骨组织覆盖范围广泛；1B.12%体表总面积（TBSA）Ⅲ度烧伤组新生骨组织较图1A少；1C.24%TBSAⅢ度烧伤组新生骨组织较图1A、1B少伤后28 d，假伤组大鼠胫骨组织中破骨细胞数量正常；与假伤组相比，2个烧伤组大鼠胫骨组织中破骨细胞数量明显增加；不同面积的烧伤组对比，破骨细胞数量差异不明显。见图2。
2 假伤组与2种面积Ⅲ度烧伤组大鼠伤后28 d胫骨组织中破骨细胞（→）数量比较 抗酒石酸酸性磷酸酶×100。2A.假伤组破骨细胞数量正常；2B.12%体表总面积（TBSA）Ⅲ度烧伤组破骨细胞数量较图2A增多；2C.24%TBSAⅢ度烧伤组破骨细胞数量较图2A增多，与图2B相近2.2 血清骨代谢指标
伤后28 d，3组大鼠血清钙离子浓度、血清中β-CTX水平相近（P>0.05）。伤后28 d，与假伤组比较，2个烧伤组大鼠血清磷离子浓度均显著升高（P<0.01）；24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠血清中磷离子浓度明显高于12%TBSAⅢ度烧伤组（P<0.05）。伤后28 d，与假伤组比较，24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠血清中P1NP水平明显下降（P<0.01），12%TBSAⅢ度烧伤组大鼠血清中P1NP水平有下降趋势但差异无统计学意义（P>0.05）；2个烧伤组大鼠血清中P1NP水平相近（P>0.05）。见表2。
表2 假伤组与2种面积Ⅲ度烧伤组大鼠伤后28 d血清骨代谢指标水平比较（组别 鼠数（只） 钙离子（mmol/L） 磷离子（mmol/L） P1NP（ng/L） β-CTX（ng/L） 假伤组 10 2.29±0.28 1.13±0.20 175±42 20±5 12%TBSAⅢ度 烧伤组 10 2.29±0.48 1.66±0.21 158±51 21±7 24%TBSAⅢ度 烧伤组 10 2.49±0.30 2.02±0.38 121±24 20±5 F值 1.039 26.572 6.790 0.101 P值 0.367 <0.001 0.007 0.904 P1值 >0.999 0.001 0.684 >0.999 P2值 0.645 <0.001 0.009 >0.999 P3值 0.692 0.019 0.137 >0.999 注：TBSA为体表总面积，P1NP为Ⅰ型前胶原氨基端前肽，β-CTX为β-Ⅰ型胶原羧基端肽；F值、P值为组间各指标总体比较所得；P1值、P2值分别为12%TBSAⅢ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组与假伤组各指标比较所得；P3值为12%TBSAⅢ度烧伤组与24%TBSAⅢ度烧伤组各指标比较所得 2.3 第1腰椎组织中护骨因子/RANKL系统指标mRNA表达水平
伤后28 d，与假伤组比较，12%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中护骨因子、RANKL mRNA表达水平无明显变化（P>0.05），TRAF-6、NFATC1（Z=3.141）、c-Fos、c-Src mRNA表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）；24%TBSAⅢ度烧伤组护骨因子、RANKL、TRAF-6、NFATC1（Z=3.782）、c-Src mRNA表达水平均显著升高（P<0.01），c-Fos mRNA表达水平无明显变化（P>0.05）。伤后28 d，与12%TBSAⅢ度烧伤组比较，24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中护骨因子、TRAF-6、NFATC1（Z=1.436）mRNA表达水平无明显变化（P>0.05），RANKL mRNA表达水平明显升高（P<0.01），c-Fos、c-Src mRNA表达水平明显降低（P<0.01）。见表3。
表3 假伤组与2种面积Ⅲ度烧伤组大鼠伤后28 d第1腰椎组织中护骨因子/RANKL系统指标mRNA表达水平比较组别 鼠数（只） 护骨因子（ RANKL（ TRAF-6（ NFATC1［M（P25，P75）］ c-Fos（ c-Src（ 假伤组 10 1.01±0.20 1.00±0.14 1.00±0.29 0.95（0.82，1.17） 1.00±0.19 1.01±0.16 12%TBSAⅢ度烧伤组 10 1.71±0.83 0.97±0.10 2.00±1.00 3.01（1.24，3.38） 1.59±0.23 4.60±1.08 24%TBSAⅢ度烧伤组 10 2.24±0.51 1.31±0.17 3.36±1.44 2.07（1.83，2.27） 1.11±0.11 1.84±0.33 统计量值 F=26.051 F=18.267 F=15.966 χ2=16.777 F=29.391 F=71.462 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 P1值 0.065 >0.999 0.029 0.006 <0.001 <0.001 P2值 <0.001 <0.001 0.001 <0.001 0.593 <0.001 P3值 0.228 <0.001 0.063 0.453 <0.001 <0.001 注：RANKL为核因子κB受体激活蛋白配体，TBSA为体表总面积，TRAF-6为肿瘤坏死因子受体相关因子6，NFATC1为活化T细胞核因子1；统计量值、P值为组间各指标总体比较所得；P1值、P2值分别为12%TBSAⅢ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组与假伤组各指标比较所得；P3值为12%TBSAⅢ度烧伤组与24%TBSAⅢ度烧伤组各指标比较所得 3. 讨论
烧伤严重程度通过烧伤面积与深度划分，Ⅲ度烧伤面积≥10%TBSA的烧伤为严重烧伤。以往研究认为，烧伤总面积≥40%TBSA的严重烧伤会诱发机体强烈的应激反应并伴随大量炎症介质、应激激素、儿茶酚胺等释放，促使骨骼、肌肉等处于高分解代谢，导致骨质流失［17，19］。研究显示，烧伤总面积≥20%TBSA的烧伤也可出现类似于40%TBSA烧伤的系统性代谢反应［20］。本研究中，24%TBSAⅢ度烧伤大鼠在伤后28 d胫骨新生骨组织较假伤组明显减少，证实骨质流失可以发生在严重烧伤的早期阶段。此外，本研究显示，12%TBSAⅢ度烧伤组大鼠伤后28 d胫骨组织中也有一定程度新生骨组织减少。这也进一步证实即使是<20%TBSA的Ⅲ度烧伤也可能存在烧伤早期骨密度下降的风险。TRAP染色中，2个烧伤组大鼠胫骨组织中破骨细胞数量较假伤组有所增多，从组织形态学角度证实严重烧伤大鼠骨组织内骨形成与骨吸收共同维持的动态平衡被打破，骨稳态向骨吸收方向转移。
循环钙、磷水平与骨代谢密切相关。严重烧伤后全身炎症反应导致甲状旁腺功能减退及甲状旁腺钙离子敏感受体表达水平上调［21］，钙-甲状旁腺激素轴紊乱和1，25二羟基维生素D3转化减少［22］，导致钙代谢紊乱，尿钙流失增加［23］。严重烧伤后维生素D下降，使小肠和肾小管钙、磷重吸收减少［24, 25］。本课题组前期临床研究显示，重度烧伤患者早期血清钙离子浓度明显下降，血清磷离子浓度无明显变化［26］。本次动物实验中，伤后28 d，与假伤组比较，2个烧伤组大鼠血清钙离子浓度无明显变化，血清磷离子浓度上升明显，面积越大升高越显著。与重度烧伤患者血清结果［27］相比，本动物实验中血清钙、磷离子浓度均相对升高。由于动物实验并不受临床个体化治疗的影响，本课题组推测烧伤早期骨吸收作用可能导致骨骼中钙、磷离子释放入血［27, 28］。而循环内磷离子随着烧伤面积增加而逐渐升高也提示了更为显著的破骨效应。骨质内钙、磷离子的减少最终增加骨质疏松及骨折风险［29］。
血清中P1NP水平反映了骨中成骨细胞产生的新胶原合成的变化，与骨组织主要成分的合成密切相关［30］。CTX可反映骨吸收过程中的胶原降解水平，从而反映骨吸收状态［12］。Rousseau等［31］对20例7%~85%TBSA Ⅱ~Ⅲ度烧伤患者进行血清骨代谢指标检测，结果显示伤后1个月内血清P1NP及CTX仅出现部分升高。在本研究中，伤后28 d，24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠血清中P1NP水平较假伤组明显下降，推测严重烧伤引起的骨质流失可能与成骨细胞合成减少有关，而<20%TBSA的Ⅲ度烧伤早期是否存在骨形成下降并不清楚。常用的CTX包括α-CTX和β-CTX，其中β-CTX不受肾脏降解，稳定性较好，β-CTX升高可很好地反映骨吸收程度［32］。然而，本研究中各组大鼠间血清中β-CTX水平相近，与常规结论不符，可能与本研究样本量较小有关，还有待更多实验验证。
Klein等［33］通过电镜骨扫描观察到，40%TBSA Ⅲ度烧伤绵羊模型的骨骼上存在骨吸收陷窝，提示烧伤引起的骨质流失中存在过度增强的破骨效应。RANKL与破骨细胞生成密切相关，而成骨细胞分泌的护骨因子是RANKL的诱骗受体，竞争性结合RANKL，阻断下游信号通路，抑制破骨细胞形成［34, 35］。文献及本课题组前期研究显示，重度烧伤患者血清护骨因子、RANKL水平均在烧伤后显著升高，提示烧伤引起该细胞系的早期反应，促进循环内护骨因子、RANKL增高［27，36, 37］。本研究中，伤后28 d，24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中RANKL、护骨因子及其下游信号TRAF-6、NFATC1等的mRNA表达水平均较假伤组显著升高，提示破骨效应的多条信号通路被启动。虽然伤后28 d，12%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中护骨因子及RANKL与假伤组相比，差异无统计学意义（P>0.05），但下游信号因子TRAF-6、NFATC1、c-Fos、c-Src mRNA表达水平明显升高。说明2个烧伤组大鼠骨组织内均出现骨稳态失衡，骨吸收效应占主导。另外，伤后28 d，24%TBSAⅢ度烧伤组大鼠第1腰椎组织中c-Fos、c-Src mRNA表达水平明显低于12%TBSAⅢ度烧伤组，可能与严重烧伤后骨转换减弱有关［38］。
综上所述，本研究通过大鼠模型证实烧伤引起的骨代谢指标变化在Ⅲ度烧伤面积>20%TBSA和>10%TBSA且<20%TBSA的烧伤大鼠中均可发生。严重烧伤大鼠循环磷离子浓度升高可能与烧伤早期骨吸收作用导致的磷离子释放入血有关。严重烧伤引起的骨质流失除破骨效应外，可能还与P1NP下降引起的成骨细胞减少有关。骨组织中护骨因子/RANKL的早期变化表明不同严重程度烧伤导致骨质流失的发病机制不完全一致。然而，烧伤后多种炎症介质及激素水平变化引起的骨代谢异常作用机制十分复杂，还有待进一步研究，以为防治烧伤后骨质流失提供理论依据。
所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 假伤组与2种面积Ⅲ度烧伤组大鼠伤后28 d胫骨组织成骨情况（红色）比较 Masson×100。1A.假伤组新生骨组织覆盖范围广泛；1B.12%体表总面积（TBSA）Ⅲ度烧伤组新生骨组织较图1A少；1C.24%TBSAⅢ度烧伤组新生骨组织较图1A、1B少
2 假伤组与2种面积Ⅲ度烧伤组大鼠伤后28 d胫骨组织中破骨细胞（→）数量比较 抗酒石酸酸性磷酸酶×100。2A.假伤组破骨细胞数量正常；2B.12%体表总面积（TBSA）Ⅲ度烧伤组破骨细胞数量较图2A增多；2C.24%TBSAⅢ度烧伤组破骨细胞数量较图2A增多，与图2B相近
表1 实时荧光定量反转录PCR法检测大鼠第1腰椎组织中护骨因子/RANKL系统指标的引物序列及产物大小
指标名称 引物序列（5'→3'） 产物大小（bp） β肌动蛋白 上游：CGTTGACATCCGTAAAGACCTC 110 下游：TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT 护骨因子 上游：TGTTCTGGTGGACAGTTTGCC 279 下游：CTCTCAATCTCGTCTGGGCTG RANKL 上游：CCATCGGGTTCCCATAAAGTC 148 下游：GATGCCTGAAGCAAATGTTGG TRAF-6 上游：AAGCTGTCCTCTGGCAAATATC 193 下游：CATGTGCAACTGGGTGTTCTC NFATC1 上游：CAGCCACGAGGCTATCCTGT 151 下游：TCTCCCGATGTCTGTCTCCC c-Fos 上游：GAGAAACGGAGAATCCGAAGG 259 下游：TCAAGTCCAGGGAGGTCACAG c-Src 上游：GCAAGATCACTAGACGGGAATC 126 下游：TGTCAAAGTCGGATACAGAGAGG 注：RANKL为核因子κB受体激活蛋白配体，TRAF-6为肿瘤坏死因子受体相关因子6，NFATC1为活化T细胞核因子1 
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表2 假伤组与2种面积Ⅲ度烧伤组大鼠伤后28 d血清骨代谢指标水平比较（
组别 鼠数（只） 钙离子（mmol/L） 磷离子（mmol/L） P1NP（ng/L） β-CTX（ng/L） 假伤组 10 2.29±0.28 1.13±0.20 175±42 20±5 12%TBSAⅢ度 烧伤组 10 2.29±0.48 1.66±0.21 158±51 21±7 24%TBSAⅢ度 烧伤组 10 2.49±0.30 2.02±0.38 121±24 20±5 F值 1.039 26.572 6.790 0.101 P值 0.367 <0.001 0.007 0.904 P1值 >0.999 0.001 0.684 >0.999 P2值 0.645 <0.001 0.009 >0.999 P3值 0.692 0.019 0.137 >0.999 注：TBSA为体表总面积，P1NP为Ⅰ型前胶原氨基端前肽，β-CTX为β-Ⅰ型胶原羧基端肽；F值、P值为组间各指标总体比较所得；P1值、P2值分别为12%TBSAⅢ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组与假伤组各指标比较所得；P3值为12%TBSAⅢ度烧伤组与24%TBSAⅢ度烧伤组各指标比较所得
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表3 假伤组与2种面积Ⅲ度烧伤组大鼠伤后28 d第1腰椎组织中护骨因子/RANKL系统指标mRNA表达水平比较
组别 鼠数（只） 护骨因子（ RANKL（ TRAF-6（ NFATC1［M（P25，P75）］ c-Fos（ c-Src（ 假伤组 10 1.01±0.20 1.00±0.14 1.00±0.29 0.95（0.82，1.17） 1.00±0.19 1.01±0.16 12%TBSAⅢ度烧伤组 10 1.71±0.83 0.97±0.10 2.00±1.00 3.01（1.24，3.38） 1.59±0.23 4.60±1.08 24%TBSAⅢ度烧伤组 10 2.24±0.51 1.31±0.17 3.36±1.44 2.07（1.83，2.27） 1.11±0.11 1.84±0.33 统计量值 F=26.051 F=18.267 F=15.966 χ2=16.777 F=29.391 F=71.462 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 P1值 0.065 >0.999 0.029 0.006 <0.001 <0.001 P2值 <0.001 <0.001 0.001 <0.001 0.593 <0.001 P3值 0.228 <0.001 0.063 0.453 <0.001 <0.001 注：RANKL为核因子κB受体激活蛋白配体，TBSA为体表总面积，TRAF-6为肿瘤坏死因子受体相关因子6，NFATC1为活化T细胞核因子1；统计量值、P值为组间各指标总体比较所得；P1值、P2值分别为12%TBSAⅢ度烧伤组、24%TBSAⅢ度烧伤组与假伤组各指标比较所得；P3值为12%TBSAⅢ度烧伤组与24%TBSAⅢ度烧伤组各指标比较所得
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