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不同三维多孔结构对人工真皮血管化速率影响的实验研究

谭荣伟 刘曦 陈滢滢 许孟强 郭远军 王丹妍 梁嘉美 刘姣 苑莎莎 范炜 王香坤 佘振定

谭荣伟, 刘曦, 陈滢滢, 等. 不同三维多孔结构对人工真皮血管化速率影响的实验研究[J]. 中华烧伤杂志, 2021, 37(10): 959-969. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200715-00347.
引用本文: 谭荣伟, 刘曦, 陈滢滢, 等. 不同三维多孔结构对人工真皮血管化速率影响的实验研究[J]. 中华烧伤杂志, 2021, 37(10): 959-969. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200715-00347.
Tan RW,Liu X,Chen YY,et al.Experimental study on the effect of three-dimensional porous structures on the vascularization rate of artificial dermis[J].Chin J Burns,2021,37(10):959-969.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200715-00347.
Citation: Tan RW,Liu X,Chen YY,et al.Experimental study on the effect of three-dimensional porous structures on the vascularization rate of artificial dermis[J].Chin J Burns,2021,37(10):959-969.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200715-00347.

不同三维多孔结构对人工真皮血管化速率影响的实验研究

doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20200715-00347
基金项目: 

国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项 2018YFE0194300

广东省高端医疗器械专项 2020B1111150001

深圳市发改委战略性新兴产业发展专项 2019561

深圳市技术攻关项目 JSGG20180504170419462

详细信息
    通讯作者:

    佘振定,Email:shezd@landobiom.com

Experimental study on the effect of three-dimensional porous structures on the vascularization rate of artificial dermis

Funds: 

National Key Research and Development Program Intergovernmental Key Projects for International Cooperation in Science, Technology and Innovation 2018YFE0194300

Special Project of High-end Medical Devices in Guangdong Province 2020B1111150001

Shenzhen Development and Reform Commission Strategic Emerging Industries Development Project 2019561

Shenzhen Technical Key Project JSGG20180504170419462

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    Corresponding author: She Zhending, Email: shezd@landobiom.com
  • 摘要:   目的  探索定向排列的三维多孔网状(A型)结构和蜂窝煤状垂直贯穿的三维多孔网状(B型)结构对人工真皮血管化速率的影响。  方法  采用实验研究方法。本研究中的人工真皮为硅胶层和支架层双层结构,根据支架层结构不同,分为含A型结构和B型结构的人工真皮(以下分别简称A型真皮、B型真皮),其中的A型结构和B型结构分别采用梯度冷冻干燥技术和物理制孔技术制得。采用扫描电镜观测2种真皮支架的微观形貌。采用比重瓶法测定2种真皮支架的孔隙率。参照国家医药行业标准中的方法,于降解4、8、13、24 h测定2种真皮降解液及残留物中羟脯氨酸的含量,反映2种真皮降解率。取L929细胞,按照随机数字表法分为A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组、阳性对照组,阳性对照组加入含体积分数5%二甲基亚砜的MEM培养基,阴性对照组加入高密度聚乙烯浸提液,其余2组加入相应的浸提液培养24 h,采用噻唑蓝试剂测定细胞增殖率,并对细胞毒性进行定级。取L929细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),接种于预先置有2种真皮的孔板。接种后1、4、7、14 d,采用免疫荧光法检测L929细胞在2种真皮支架表面的黏附生长状况。接种后7 d,采用免疫荧光法和苏木精-伊红(HE)染色法检测前述2种细胞长入2种真皮支架的情况。在3只6个月龄雄性巴马小型猪背部两侧各制作3个5.0 cm×5.0 cm的全层皮肤缺损创面,6列创面按照随机数字表法分为A型真皮两步法组、B型真皮两步法组和B型支架一步法组。A型真皮两步法组和B型真皮两步法组的创面分别先行A型真皮或B型真皮移植后,再行自体刃厚皮片的移植,B型支架一步法组的创面行B型真皮(揭除硅胶层)+自体刃厚皮片一步法移植。大体观察Ⅱ期术后7 d A型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14 d B型支架一步法组的猪背创面出血、渗液和感染情况。同时,采用透明胶片网格法测定自体皮移植面积并计算其存活率。Ⅰ期术后4、7、14 d,HE染色法检测3组猪背创面中支架的炎症细胞、成纤维细胞(Fb)和毛细血管浸润情况。Ⅰ期术后7 d,免疫组织化学法进一步检测3组猪背创面中支架的血管化情况。Ⅰ期术后28 d、3个月,HE染色法检测A型真皮两步法组和B型支架一步法组猪背创面中支架的降解情况。对数据行单因素方差分析、独立样本t检验、Bonferroni校正。  结果  A型真皮支架表面均匀分布着大量圆形和椭圆形的微孔,纵切面可观察到柱状孔壁大体呈平行定向排列;B型真皮支架表面的蜂窝煤状贯穿大孔呈矩阵有序排列,纵切面蜂窝煤状贯穿孔的孔壁由微孔相互连通成网络结构。A型真皮支架的孔隙率为(93.2±0.7)%,与B型的(95.9±1.0)%相近(t=4.653,P>0.05)。A型真皮在4、8、13、24 h的降解率与B型真皮对应时间点的降解率相近(t=0.232、0.856、0.258、7.716,P>0.05)。培养24 h,A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组L929细胞的增殖率显著高于阳性对照组(t=2 393.460、2 538.270、1 077.770,P<0.01);阳性对照组细胞毒性评级为4级,其余3组为0级。接种后1、4、7、14 d,L929细胞和HUVEC在2种真皮支架中均呈时间依赖性增殖;且2种细胞在B型真皮上的黏附生长、增殖速率高于A型真皮。接种后7 d,L929细胞和HUVEC均已长满B型真皮支架层且至硅胶层一侧;而前述2种细胞向A型真皮内部迁移速度较慢,硅胶层一侧仅见少量细胞。Ⅱ期术后7 d A型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14 d B型支架一步法组创面均未出现出血、渗液、感染等情况;3组各6个创面的自体皮植皮存活率均为100%。Ⅰ期术后4、7、14 d,炎症细胞、Fb、毛细血管等逐渐向创面的支架层浸润,且细胞浸润速率从高到低依次为B型支架一步法组、B型真皮两步法组、A型真皮两步法组。Ⅰ期术后7 d 3组创面中支架的血管化速率从高到低依次为B型支架一步法组、B型真皮两步法组、A型真皮两步法组。B型支架一步法组猪背创面中的支架在术后28 d逐渐溃散,术后3个月完全降解;A型真皮两步法组猪背创面中的支架降解情况与前述相似。  结论  与A型结构相比,B型结构可加速人工真皮支架血管化进程,利于联合自体刃厚皮一步法移植修复猪全层皮肤缺损创面。一步法移植的效果与分次移植人工真皮与自体刃厚皮的两步法一致,可为创面治疗提供更优选择。

     

  • 参考文献(32)

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  • 1  2种人工真皮试样支架表面和纵切面形貌观察。1A.A型真皮表观形貌,表面均匀分布着大量圆形和椭圆形的微孔 扫描电镜×30,图中标尺为1 mm;1B.B型真皮表观形貌,可见蜂窝煤状贯穿大孔呈矩阵有序排列 扫描电镜×30,图中标尺为1 mm;1C.A型真皮纵切面形貌,可观察到柱状孔壁大体呈平行纵向排列 扫描电镜×200,图中标尺为200 μm;1D.B型真皮纵切面形貌,清晰可见蜂窝煤状贯穿大孔断面(白色虚线标记) 扫描电镜×100,图中标尺为300 μm

    注:A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮,B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

    2  不同时间点L929细胞在2种支架上的黏附生长情况 鬼笔环肽-罗丹明-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×400,图中标尺为100 μm。2A、2B、2C、2D.分别为细胞在A型真皮接种1、4、7、14 d黏附生长情况,接种后的细胞均呈时间依赖性增殖;2E、2F、2G、2H.分别为细胞在B型真皮分别接种1、4、7、14 d黏附生长情况,与图2A、2B、2C、2D相比,细胞在B型真皮上的黏附生长、增殖速率更高

    注:细胞骨架阳性染色为红色,细胞核阳性染色为蓝紫色;A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮,B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

    3  接种后7 d 2种细胞在2种真皮支架中的长入情况 鬼笔环肽-罗丹明-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×400,图中标尺为200 μm。3A、3B.分别为人脐静脉内皮细胞分别向A、B型真皮支架纵向长入情况,细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架;3C、3D.分别为L929细胞分别向A、B型真皮支架纵向长入情况,细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架

    注:细胞骨架阳性染色为红色,细胞核阳性染色为蓝紫色;A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮,B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

    4  接种后7 d 2种细胞在2种真皮支架中的长入情况 苏木精-伊红×400,图中标尺为100 μm。4A、4B.分别为人脐静脉内皮细胞分别向A、B型真皮支架长入情况,细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架;4C、4D.分别为L929细胞分别向A、B型真皮支架长入情况,细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架

    注:细胞核阳性染色为蓝紫色(↑);A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮,B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

    5  3组猪背全层皮肤缺损创面移植自体皮存活情况。5A.A型真皮两步法组Ⅱ期术后7 d创面情况,创面移植的自体皮完全存活;5B.B型真皮两步法组Ⅱ期术后7 d的创面情况,创面移植的自体皮完全存活;5C.B型真皮支架一步法组术后14 d创面,创面移植的自体皮完全存活

    注:图中小孔为柱状活检样取出后遗留的痕迹;A型真皮两步法组Ⅰ期术后14 d行Ⅱ期自体皮移植,B型真皮两步法组Ⅰ期术后7 d行Ⅱ期自体皮移植;A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮,B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

    6  3组猪背全层皮肤缺损创面移植支架中的细胞浸润情况 苏木精-伊红×400,图中标尺为100 μm。6A.Ⅰ期术后4 d,A型真皮两步法组创面中支架内有炎症细胞浸润,未见成纤维细胞(Fb)浸润;6B.Ⅰ期术后7 d,A型真皮两步法组创面中支架内炎症细胞较图6A略有增加,支架创基侧有较多Fb浸润;6C.Ⅰ期术后14 d,A型真皮两步法组创面中支架内炎症细胞较图6B增多,整层支架完全被Fb和毛细血管浸润;6D.Ⅰ期术后4 d,B型真皮两步法组创面中的支架与创基交界处已有少量Fb浸润;6E.Ⅰ期术后7 d,B型真皮支架一步法组创面中的支架整层已被大量Fb浸润;6F.Ⅰ期术后14 d,B型真皮支架一步法组创面中的支架内炎症反应明显消退,支架孔隙间已生成大量致密的新生胶原

    注:A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮,B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

    7  3组猪背全层皮肤缺损创面中移植支架的血管化情况 二氨基联苯胺-苏木精×100,图中标尺为500 μm。7A.Ⅰ期术后7 d,A型真皮两步法组创面支架中仅基底侧局部可见血管腔;7B. Ⅰ期术后14 d,A型真皮两步法组创面中支架内有较多细小血管样结构均匀长入;7C.Ⅰ期术后7 d,B型真皮两步法组创面中支架的蜂窝煤状贯穿大孔中有大量CD31阳性信号表达;7D.Ⅰ期术后7 d,B型支架一步法组创面中支架完全血管化

    注:AD为支架层,AS为移植的自体皮;红色虚线标记处为蜂窝煤状贯穿大孔;棕色为CD31阳性表达,反映细胞血管化情况;A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮,B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

    8  B型真皮支架一步法组和A型真皮两步法组猪背创面中的移植支架降解情况。8A.A型真皮两步法组术后28 d创面中支架的降解情况,支架溃散,仅可见大块碎片(↑) 苏木精-伊红×400,图中标尺为100 μm;8B.A型真皮两步法组术后90 d创面中支架降解情况,支架完全降解,所移植自体皮表皮突清晰可见,未见明显瘢痕增生,炎症反应完全消失 苏木精-伊红×100,图中标尺为500 μm;8C.B型真皮支架一步法组术后28 d创面中支架降解情况与8A相似 苏木精-伊红×400,图中标尺为100 μm;8D.B型真皮支架一步法组术后90 d创面中支架降解情况与8B相似 苏木精-伊红×100,图中标尺为500 μm

    注:A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮,B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮

      《中华烧伤杂志》第六届编辑委员会通讯编委名单按姓氏拼音排序

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    易南于东宁岳丽青翟红军詹日兴张博张东霞张红艳张菊芳张玲娟
    张庆红张彦琦张寅张元海张志赵全赵冉赵雄郑德义郑东风
    郑军周国富周俊峄周琴周万芳朱峰朱宇刚祝筱梅邹立津邹晓防
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  • 收稿日期:  2020-07-15

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