Experimental study on the effect of three-dimensional porous structures on the vascularization rate of artificial dermis
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摘要:
目的 探索定向排列的三维多孔网状（A型）结构和蜂窝煤状垂直贯穿的三维多孔网状（B型）结构对人工真皮血管化速率的影响。 方法 采用实验研究方法。本研究中的人工真皮为硅胶层和支架层双层结构，根据支架层结构不同，分为含A型结构和B型结构的人工真皮（以下分别简称A型真皮、B型真皮），其中的A型结构和B型结构分别采用梯度冷冻干燥技术和物理制孔技术制得。采用扫描电镜观测2种真皮支架的微观形貌。采用比重瓶法测定2种真皮支架的孔隙率。参照国家医药行业标准中的方法，于降解4、8、13、24 h测定2种真皮降解液及残留物中羟脯氨酸的含量，反映2种真皮降解率。取L929细胞，按照随机数字表法分为A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组、阳性对照组，阳性对照组加入含体积分数5%二甲基亚砜的MEM培养基，阴性对照组加入高密度聚乙烯浸提液，其余2组加入相应的浸提液培养24 h，采用噻唑蓝试剂测定细胞增殖率，并对细胞毒性进行定级。取L929细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVEC），接种于预先置有2种真皮的孔板。接种后1、4、7、14 d，采用免疫荧光法检测L929细胞在2种真皮支架表面的黏附生长状况。接种后7 d，采用免疫荧光法和苏木精-伊红（HE）染色法检测前述2种细胞长入2种真皮支架的情况。在3只6个月龄雄性巴马小型猪背部两侧各制作3个5.0 cm×5.0 cm的全层皮肤缺损创面，6列创面按照随机数字表法分为A型真皮两步法组、B型真皮两步法组和B型支架一步法组。A型真皮两步法组和B型真皮两步法组的创面分别先行A型真皮或B型真皮移植后，再行自体刃厚皮片的移植，B型支架一步法组的创面行B型真皮（揭除硅胶层）+自体刃厚皮片一步法移植。大体观察Ⅱ期术后7 d A型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14 d B型支架一步法组的猪背创面出血、渗液和感染情况。同时，采用透明胶片网格法测定自体皮移植面积并计算其存活率。Ⅰ期术后4、7、14 d，HE染色法检测3组猪背创面中支架的炎症细胞、成纤维细胞（Fb）和毛细血管浸润情况。Ⅰ期术后7 d，免疫组织化学法进一步检测3组猪背创面中支架的血管化情况。Ⅰ期术后28 d、3个月，HE染色法检测A型真皮两步法组和B型支架一步法组猪背创面中支架的降解情况。对数据行单因素方差分析、独立样本t检验、Bonferroni校正。 结果 A型真皮支架表面均匀分布着大量圆形和椭圆形的微孔，纵切面可观察到柱状孔壁大体呈平行定向排列；B型真皮支架表面的蜂窝煤状贯穿大孔呈矩阵有序排列，纵切面蜂窝煤状贯穿孔的孔壁由微孔相互连通成网络结构。A型真皮支架的孔隙率为（93.2±0.7）%，与B型的（95.9±1.0）%相近（t=4.653，P>0.05）。A型真皮在4、8、13、24 h的降解率与B型真皮对应时间点的降解率相近（t=0.232、0.856、0.258、7.716，P>0.05）。培养24 h，A型真皮组、B型真皮组、阴性对照组L929细胞的增殖率显著高于阳性对照组（t=2 393.460、2 538.270、1 077.770，P<0.01）；阳性对照组细胞毒性评级为4级，其余3组为0级。接种后1、4、7、14 d，L929细胞和HUVEC在2种真皮支架中均呈时间依赖性增殖；且2种细胞在B型真皮上的黏附生长、增殖速率高于A型真皮。接种后7 d，L929细胞和HUVEC均已长满B型真皮支架层且至硅胶层一侧；而前述2种细胞向A型真皮内部迁移速度较慢，硅胶层一侧仅见少量细胞。Ⅱ期术后7 d A型真皮两步法组和B型真皮两步法组及Ⅰ期术后14 d B型支架一步法组创面均未出现出血、渗液、感染等情况；3组各6个创面的自体皮植皮存活率均为100%。Ⅰ期术后4、7、14 d，炎症细胞、Fb、毛细血管等逐渐向创面的支架层浸润，且细胞浸润速率从高到低依次为B型支架一步法组、B型真皮两步法组、A型真皮两步法组。Ⅰ期术后7 d 3组创面中支架的血管化速率从高到低依次为B型支架一步法组、B型真皮两步法组、A型真皮两步法组。B型支架一步法组猪背创面中的支架在术后28 d逐渐溃散，术后3个月完全降解；A型真皮两步法组猪背创面中的支架降解情况与前述相似。 结论 与A型结构相比，B型结构可加速人工真皮支架血管化进程，利于联合自体刃厚皮一步法移植修复猪全层皮肤缺损创面。一步法移植的效果与分次移植人工真皮与自体刃厚皮的两步法一致，可为创面治疗提供更优选择。 Abstract:Objective To explore the effects of orienting three-dimensional porous network (type A) and honeycomb briquette-shaped vertically penetrating three-dimensional porous network (type B) on the vascularization rate of artificial dermis. Methods The experimental research method was used. The artificial dermis was composed of a double layer of silicone layer and scaffold layer. Based on the difference of scaffold layer, they were divided into type A and type B artificial dermis (type A dermis and type B dermis, for short) containing type A and type B structure, respectively. The type A and type B structures were prepared by gradient freeze-drying technique and physical pore-making technique, respectively. The micro-morphology of two kinds of dermis scaffold was observed by scanning electron microscopy. The porosity of two kinds of dermis scaffold was measured by the Pyrex method. According to the method of national medical industry standard, the hydroxyproline content in degradation liquids and their residues in two kind of dermis were determined after degradation at 4, 8, 13, and 24 h, reflecting the degradation rates of two kinds of dermis. According to the random number table, L929 cells were divided into type A dermis group, type B dermis group, negative control group, and positive control group. The positive control group was added with minimum essential medium (MEM) containing 5% dimethyl sulfoxide, The negative control group was added with high-density polyethylene extract, and the other two groups were added with the corresponding extract. At 24 hours after culture, the growth rate of L929 cells was detected by methyl thiazolyl tetrazolium, and the cytotoxicity was graded. L929 cells and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were inoculated into pore plates with two kinds of dermis preinstalled. On 1, 4, 7, and 14 d after inoculating, the adhesion and growth of L929 cells on the surfaces of the two kinds of scaffolds were detected by immunofluorescence method. On 7 d after inoculating, the migration of the above two kinds of cells into the two kinds of dermal scaffolds was detected by immunofluorescence and hematoxylin-eosin (HE) staining. Three full-thickness skin defect wounds of 5.0 cm×5.0 cm were created on both sides of the back of three 6-month-old healthy male Ba-Ma mini pigs. According to the random number table, six columns of wounds were divided into type A dermis two-step method group, type B dermis two-step method group, and type B dermis one-step method group. The wounds in type A dermis two-step method group and type B dermis two-step method group were transplanted with type A or type B dermis respectively before, and with autologous split-thickness skin grafting later. The wounds in type B dermis one-step method group were transplanted in a synchronous procedure including type B dermis (without silicone layer) and autologous skin grafting simultaneously. The bleeding, exudation, and infection of the wounds on the back in type A dermis two-step method group and type B dermis two-step method group on the 7th day after the second transplantation and in type B dermis one-step method group on the 14th day after the first transplantation were generally observed. The area of autologous skin graft was measured by the transparent film grid method, and the survival rate of autologous skin was calculated. On 4, 7, and 14 d after the first transplantation, the inflammatory cells, fibroblasts (Fbs), and capillary infiltration into the scaffolds of the three groups were detected by HE staining. On 7, 14 d after the first transplantation, the vascularization of the scaffolds was further observed by immunohistochemistry. On 28, 90 d after the first operation, the degradation of the scaffolds of type A dermis and type B dermis was observed by HE staining. Data were statistically analyzed with one-way analysis of variance, independent sample t test, and Bonferroni correction. Results A large number of round and oval micropores were evenly distributed on the surface of type A scaffold, and the cylindrical hole walls could be observed arranging in a parallel direction in the longitudinal section. The honeycomb briquette-shaped penetrating macropores on the surface of type B scaffold were arranged in an orderly matrix. The pore walls of the honeycomb briquette-shaped penetrating macropores were connected by micropores to form a network structure. The porosity of type A dermis was (93.21±0.72)%, which was similar to (95.88±1.00)% of type B dermis (t=4.653, P>0.05). The degradation rates of type A dermis at 4, 8, 13, and 24 h were similar to those of type B dermis at the corresponding time point (t=0.232, 0.856, 0.258, 7.716, P>0.05). At 24 h after culture, the proliferation rates of L929 cells in the type A dermis group, type B dermis group, and negative control group were significantly higher than those of the positive control group (t=2 393.46, 2 538.27, 1 077.77, P<0.01). The cytotoxicity rating of cells in positive control group was grade 4, while that of the other three groups was grade zero. On 1, 4, 7, and 14 d after inoculation, both L929 cells and HUVECs proliferated in a time-dependent manner in two kinds of dermal scaffolds. The adhesion growth and proliferation rate of the two kinds of cells on the surface of type B dermis was higher than that of type A dermis. On 7 d after inoculation, both L929 cells and HUVECs covered the surface of type B dermis and migrated into one side of the silicone layer. However, the above two kinds of cells migrated slowly into type A dermis, and only a few cells were found on one side of the silicone layer. There was no bleeding, exudation, or infection in the wounds repaired by type A and type B dermis. The survival rate of autologous skin grafting of 6 wounds in each group was 100%. On 4, 7, and 14 d after the first operation, inflammatory cells, Fbs, and capillaries gradually infiltrated into the scaffold layer, and the cell infiltration rate from high to low was type B dermis one-step method group, type B dermis two-step method group, and type A dermis two-step method group. The scaffold in wound in the type B dermis one-step method group gradually collapsed on 28 d after the first operation, and completely degraded in 3 months after the first operation. The scaffold degradation rate of type A dermis two-step method group was similar to that mentioned above. Conclusions The honeycomb briquette-shaped vertically penetrating three-dimensional porous network structure of type B scaffold can accelerate its vascularization process, which is beneficial to autogenous split-thickness skin in one-step procedure to repair full-thickness skin defects wound in Ba-Ma mini pigs. Compared with the "two-step method" of staged transplantation of type A scaffold and autologous split-thickness skin, and one-step transplantation has equal efficacy and can provide a better choice for wound treatment. -
Key words:
- Skin, artificial /
- Wound healing /
- Three-dimensional /
- Pore structure /
- Full-thickness skin defect /
- Vascularization
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(1)甘草酸二铵能减轻严重烫伤大鼠的肝功能损伤，并且多次使用比单次使用效果好。
(2)甘草酸二铵可能通过减轻线粒体损伤及抑制内质网应激发挥减轻肝功能损伤的作用。
烧伤是一个全世界的重大公共卫生问题，烧伤患者器官功能障碍、感染及死亡风险都明显高于其他外伤患者［1］，重度烧伤患者病死率更高［2, 3］。据统计，近年来烧伤患者死亡的主要原因为MODS及脓毒血症［1］，其中肝脏器官功能障碍是烧伤预后不良的早期危险因素［4］。研究表明，重度烧伤患者肝功能变化与死亡风险有明显关联，而早期采取有效措施保护肝脏及防止肝损伤进一步恶化有助于提高患者存活率［2］。烧伤后肝损伤的发生与肝脏应激性损伤、缺血缺氧及再灌注损伤、感染、肝毒性物质损伤等［5, 6, 7, 8, 9, 10, 11］息息相关，内质网应激与线粒体损伤在肝损伤的发生过程中也有着不可忽视的作用［12］。
甘草酸具有抗炎、抗肝毒性、抗病毒、抗纤维化、调节免疫等生物学特性［13, 14, 15］，被证实可有效改善肝功能损伤，在临床上常被用于治疗肝炎［16］、药物性肝损伤［17］、非酒精性脂肪肝［18］等肝脏疾病。也有临床研究表明，严重烧伤患者早期使用甘草酸二铵能有效地治疗肝损伤［19, 20］，但其机制并不明确。本研究团队推测，甘草酸二铵对烧伤后肝脏的保护作用可能是通过缓解内质网应激及减少线粒体损伤来实现的。本文旨在通过体内实验探讨甘草酸二铵对烫伤大鼠肝损伤的影响及其作用机制。
1. 材料与方法
本实验研究遵循国家和安徽医科大学第一附属医院有关实验动物管理和使用的规定。
1.1 动物及主要试剂与仪器来源
54只7~9周龄健康清洁级雌性SD大鼠，体重200~250 g，由安徽医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（皖）2014-003。甘草酸二铵注射液购自正大天晴药业集团股份有限公司，RIPA裂解液、二辛丁酸蛋白浓度测定试剂盒（增强型）购自上海碧云天生物技术有限公司，兔抗大鼠葡萄糖调节蛋白78（GRP78）多克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗大鼠转录激活因子4（ATF4）多克隆抗体、兔抗大鼠B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）多克隆抗体、兔抗大鼠Bcl-2相关X蛋白（Bax）多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，兔抗大鼠蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，兔源性GAPDH多克隆抗体购自北京爱必信生物技术有限公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，大鼠鸟氨酸氨甲酰基转移酶（OCT）ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，RNA反转录试剂盒、SYBR Green定量PCR荧光染料购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
CKX53型倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，PowerPac Basic型琼脂糖凝胶电泳仪购自美国伯乐公司，SMR16.1型酶标仪购自武汉优尔生生命科学装备有限公司，4500SF型凝胶数码成像分析系统购自上海Tanon科技有限公司，NANODROP 2000c型超微量蛋白核酸检测仪购自美国赛默飞世尔科技公司，AG22331型PCR扩增仪购自美国Eppendorf公司，Mx300P型实时荧光定量PCR仪购自德国罗氏科技有限公司，AU680型全自动生化检测分析仪购自贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司。
1.2 动物模型制备、分组及标本采集
取54只大鼠，在通风、恒温、恒湿环境下适应性饲养10 d。按随机数字表法将大鼠分为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+甘草酸二铵组，每组18只。按照3 mL/kg腹腔注射100 g/L水合氯醛将大鼠麻醉（麻醉方法下同），剃除背部毛发。单纯烫伤组及烫伤+甘草酸二铵组大鼠背部在98 ℃的水浴锅中持续浸泡12 s，造成30%TBSAⅢ度烫伤（经病理切片证实）；假伤组大鼠背部在37 ℃水浴锅中持续浸泡15 s模拟致伤。假伤组大鼠伤后不进行特殊处理；单纯烫伤组及烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后立即按Parkland公式经腹腔注射补充乳酸林格液4 mL·kg-1·%TBSA-1抗休克，其中前8 h补充液体总量的1/2，后16 h补充剩余的1/2；烫伤+甘草酸二铵组大鼠分别于伤后1、25、49 h经腹腔注射50 mg/kg甘草酸二铵溶液。伤后24、48、72 h，每组各取6只大鼠，麻醉后取3~5 mL腹主动脉血，以2 500×g离心10 min后取上清液，于-80 ℃冰箱保存；大鼠经腹主动脉放血处死后，取肝左外叶，部分于40 g/L多聚甲醛中固定保存，部分于-80 ℃冰箱保存。
1.3 血生物化学指标检测
取3组大鼠伤后各时间点血清，于4 ℃冰箱过夜，于次日使用全自动生化检测分析仪检测血清肝功能损伤相关指标AST、ALT、乳酸脱氢酶（LDH）、总蛋白、白蛋白含量。另取3组大鼠伤后各时间点血清，37 ℃水浴融化，按ELISA检测试剂盒说明书步骤检测线粒体损伤指标OCT含量。
1.4 肝组织病理学变化观察
取储存于多聚甲醛中的3组大鼠伤后72 h肝组织，送至武汉赛维尔生物科技有限公司制作病理切片（厚度为4 μm）并进行HE染色，于400倍光学显微镜下观察肝组织病理学变化。
1.5 实时荧光定量RT-PCR法检测肝组织中内质网应激和线粒体损伤相关标志物的mRNA表达
取-80 ℃冰箱中保存的3组大鼠伤后各时间点适量肝组织，裂解后提取总RNA，并测定浓度和纯度，经反转录合成互补DNA。采用Primer3（
http：//primer3.ut.ee ）自行设计引物并由通用生物（安徽）股份有限公司合成，引物序列及产物大小见表1。采用实时荧光定量PCR仪检测ATF4、GRP78、PERK、Bcl-2、Bax的mRNA表达。以GAPDH为内参照，采用Δ循环阈值（Ct）法分析数据，计算各基因的相对表达量，即2-ΔΔCt。表1 大鼠肝组织中内质网应激和线粒体损伤相关标志物的引物序列及产物大小基因名称 引物序列（5'→3'） 产物大小（bp） GAPDH 上游：AGACAGCCGCATCTTCTTGT 207 下游：CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT ATF4 上游：TCCTCGATACCAGCAAATCC 64 下游：ACCCATGAGGTTTGAAGTGC GRP78 上游：GATGTAGGCACGGTGGTTGG 131 下游：GTGAAGGCCACATACGACGG PERK 上游：CCAGGCATCGTGAGGTATTT 160 下游：GATCCATCTGCCGGATCTTA Bcl-2 上游：ATACCTGGGCCACAAGTGAG 214 下游：TGATTTGACCATTTGCCTGA Bax 上游：CGAGCTGATCAGAACCATCA 191 下游：CTCAGCCCATCTTCTTCCAG 注：GAPDH 为3-磷酸甘油醛脱氢酶，ATF4为转录激活因子4，GRP78 为葡萄糖调节蛋白78，PERK为蛋白激酶R样内质网激酶，Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白 1.6 蛋白质印迹法检测肝组织中内质网应激和线粒体损伤相关标志物的蛋白表达
取适量冻存于-80 ℃冰箱的假伤组大鼠伤后72 h和烫伤2组大鼠伤后各时间点肝组织，提取组织蛋白，并测定蛋白浓度，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用湿法转膜，用50 g/L脱脂牛奶室温封闭1~2 h。加入一抗兔抗大鼠GRP78多克隆抗体（稀释比为1∶1 000）、兔抗大鼠ATF4多克隆抗体（稀释比为1∶1 000）、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体（稀释比为1∶1 000）、兔抗大鼠Bax多克隆抗体（稀释比为1∶6 000）、兔抗大鼠PERK单克隆抗体（稀释比为1∶1 000）和兔源性GAPDH多克隆抗体（稀释比为1∶3 000），于4 ℃条件下孵育过夜。洗涤后加入HRP标记的山羊抗兔 IgG多克隆二抗（稀释比为 1∶10 000），室温孵育1.5 h。洗涤后行化学发光显影，采用Image J 图像分析软件（美国国立卫生研究院）行灰度分析，以GAPDH为内参照，观察GRP78、ATF4、PERK、Bcl-2、Bax蛋白表达。
1.7 统计学处理
采用SPSS 26.0统计软件进行分析。计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 血清肝功能损伤相关指标的含量
与假伤组比较，单纯烫伤组大鼠伤后各时间点血清中AST、ALT、LDH含量均明显升高（P<0.01），总蛋白、白蛋白含量均明显降低（P<0.05或P<0.01）。伤后24 h，相较于单纯烫伤组，烫伤+甘草酸二铵组大鼠血清中AST含量明显下降（P<0.05），而ALT、LDH、总蛋白和白蛋白含量均无明显变化（P>0.05）。伤后48 h，相较于单纯烫伤组，烫伤+甘草酸二铵组大鼠血清中AST、ALT、LDH含量均明显下降（P<0.01），总蛋白含量明显升高（P<0.01），而白蛋白含量无明显变化（P>0.05）。伤后72 h，相较于单纯烫伤组，烫伤+甘草酸二铵组大鼠血清中AST、ALT、LDH含量均明显下降（P<0.01），总蛋白和白蛋白含量均明显升高（P<0.01）。见表2。
表2 假伤组与严重烫伤2组大鼠伤后各时间点肝功能损伤相关指标含量比较（U/L，组别与时间点 鼠数（只） AST ALT LDH 总蛋白 白蛋白 假伤组 18 24 h 60±5 23±3 126±40 53.3±1.0 31.6±1.0 48 h 65±11 25±4 129±41 51.4±1.5 30.0±1.3 72 h 73±15 27±6 124±39 48.8±2.6 30.5±1.1 单纯烫伤组 18 24 h 1 520±291a 285±48a 2 257±568a 48.9±2.9d 22.7±1.6a 48 h 928±91a 211±23a 687±312a 43.3±2.0a 22.7±1.4a 72 h 515±125a 127±30a 568±208a 34.4±7.1a 18.2±3.2a 烫伤+甘草酸二铵组 18 24 h 1 228±63b 248±40 1 817±422 50.1±3.2 24.1±3.0 48 h 628±41c 136±10c 269±59c 47.5±2.5c 24.1±1.6 72 h 186±27c 64±16c 145±36c 46.0±2.4c 24.1±2.5c F 1值 121.08 92.62 45.38 4.74 33.72 P 1值 <0.001 <0.001 <0.001 0.025 <0.001 F 2值 344.11 236.87 14.83 24.29 42.84 P 2值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 F 3值 57.07 37.41 24.42 16.74 37.99 P 3值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：各组各时间点鼠数均为6只；AST为天冬氨酸转氨酶，ALT为丙氨酸转氨酶，LDH为乳酸脱氢酶；AST、ALT、LDH、总蛋白、白蛋白含量处理因素主效应，F值分别为309.40、242.67、68.65、35.33、105.21，P值均<0.001；时间因素主效应，F值分别为162.92、88.07、97.16、25.46、4.06，P值分别为<0.001、<0.001、<0.001、<0.001、0.024；两者交互作用，F值分别为42.25、24.72、24.30、5.21、3.46，P值分别为<0.001、<0.001、<0.001、0.002、0.015；F 1值、P 1值，F 2值、P 2值，F 3值、P 3值分别为3组大鼠伤后24、48、72 h各指标总体比较所得；与假伤组比较，a P<0.01，d P<0.05；与单纯烫伤组比较，b P<0.05，c P<0.01 2.2 血清OCT含量
与假伤组比较，单纯烫伤组大鼠伤后各时间点血清OCT含量均明显升高（P<0.01）；与单纯烫伤组相比，烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后各时间点血清中OCT的含量均明显降低（P<0.05或P<0.01）。见表3。
表3 假伤组与严重烫伤2组大鼠伤后各时间点血清OCT含量比较（U/L，组别 鼠数（只） 24 h 48 h 72 h 假伤组 18 15.1±2.5 15.7±2.6 16.4±3.7 单纯烫伤组 18 48.5±3.9a 40.8±2.4a 38.7±2.0a 烫伤+甘草酸二铵组 18 39.0±4.5b 31.8±2.0c 22.1±2.6c F值 127.48 179.10 127.42 P值 <0.001 <0.001 <0.001 注：各组各时间点鼠数均为6只；OCT为鸟氨酸氨甲酰基转移酶；处理因素主效应，F=355.49，P<0.001；时间因素主效应，F=35.30，P<0.001；两者交互作用，F=20.37，P<0.001；F值、P值为3组伤后各时间点OCT含量总体比较所得；与假伤组比较，a P<0.01；与单纯烫伤组比较，b P<0.05，c P<0.01 2.3 肝组织病理学变化
伤后72 h，假伤组大鼠肝组织中细胞形态正常，排列规则，未见明显炎症细胞浸润；单纯烫伤组大鼠肝组织中细胞排列紊乱，可见明显胞质疏松，并伴有弥漫性的脂肪病变和中等量炎症细胞浸润；烫伤+甘草酸二铵组大鼠肝组织中细胞排列较规则，可见散在的脂肪变性，伴有少量散在炎症细胞浸润。见图1。
1 假伤组与严重烫伤2组大鼠伤后72 h肝组织病理学变化 苏木精-伊红×400。1A.假伤组肝细胞呈放射状排列，排列规则，未见明显炎症细胞浸润；1B.单纯烫伤组肝细胞排列紊乱，胞质疏松，伴有中等量炎症细胞浸润；1C.烫伤+甘草酸二铵组肝细胞排列较规则，有少量炎症细胞浸润2.4 肝组织中线粒体损伤相关标志物的mRNA和蛋白表达
与假伤组比较，单纯烫伤组大鼠伤后24、48、72 h肝组织Bcl-2 mRNA（P<0.05或P<0.01）和蛋白表达均明显减少，Bax的mRNA（P<0.01）和蛋白表达均明显增加。与单纯烫伤组比较，烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后24 h肝组织Bcl-2、Bax的mRNA（P>0.05）和蛋白表达均无明显变化；烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后48 h肝组织Bax 的mRNA（P<0.05）和蛋白表达均明显减少，Bcl-2的mRNA（P>0.05）和蛋白表达均无明显变化；烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后72 h肝组织Bax的mRNA（P<0.01）和蛋白表达均明显减少，Bcl-2的mRNA（P<0.01）和蛋白表达均明显增加。见图2。
2 假伤组与烫伤2组大鼠伤后各时间点肝组织中线粒体损伤相关标志物的mRNA和蛋白表达比较。2A.Bcl-2的mRNA表达（样本数均为6，2.5 肝组织中内质网应激相关标志物的mRNA和蛋白表达
与假伤组比较，单纯烫伤组大鼠伤后各时间点肝组织ATF4、GRP78、PERK的mRNA（P<0.05或P<0.01）和蛋白表达均明显增加。与单纯烫伤组相比，烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后24 h肝组织ATF4、GRP78、PERK的mRNA（P>0.05）和蛋白表达均无明显变化；烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后48 h肝组织ATF4的mRNA（P<0.01）和蛋白表达均明显减少，但GRP78、PERK的mRNA（P>0.05）和蛋白表达均无明显变化；烫伤+甘草酸二铵组大鼠伤后72 h肝组织ATF4、GRP78、PERK的mRNA（P<0.05或P<0.01）和蛋白表达均明显减少。见图3。
3 假伤组与烫伤2组大鼠伤后各时间点肝组织中内质网应激相关标志物的mRNA和蛋白表达比较。3A.PERK的mRNA表达（样本数均为6，3. 讨论
肝脏在烧伤后的机体代谢、炎症反应及免疫调节过程中发挥着巨大作用，肝损伤是重度烧伤患者常见的并发症之一［21］。甘草作为中草药，一直被广泛用于治疗肝脏相关疾病，而甘草酸是甘草中最为重要的生物活性化合物［22, 23］。甘草酸二铵作为第3代甘草酸制剂，是18β-甘草酸与18α-甘草酸的混合构型体，具有水溶性强、扩散性强等特点。有研究证实，甘草酸二铵能有效减轻由刀豆蛋白A诱导的小鼠肝损伤［23］。还有临床研究表明，严重烧伤患者使用甘草酸二铵能显著减轻肝损伤［19, 20］。本研究建立了30%TBSA的Ⅲ度烫伤SD大鼠模型，并观察了腹腔注射甘草酸二铵对大鼠烫伤后肝损伤的影响。结果显示，单纯烫伤组大鼠伤后各时间点血清中AST、ALT、LDH等肝功能损伤指标的含量均较假伤组显著升高，血清总蛋白、白蛋白含量均较假伤组明显减少，HE染色显示单纯烫伤组大鼠肝脏出现脂肪病变、炎症反应，表明严重烧伤大鼠伤后存在肝损伤。
白蛋白是由肝实质细胞合成，是血浆中含量最多的蛋白，肝脏受损后白蛋白及总蛋白的合成将会减少，因此血清中白蛋白及总蛋白含量减少提示着肝功能受损；但对严重烧伤患者来说，血清白蛋白及总蛋白的减少主要是由创面渗出及低血容量性休克所致，因此这2项指标减少只能在一定程度上提示肝功能受损，需结合其他指标一起观察。本研究结果表明，当注射1次甘草酸二铵后，大鼠血清中总蛋白及白蛋白含量均无明显改变，但当连续注射3次甘草酸二铵后，大鼠血清中总蛋白及白蛋白含量均明显升高，提示连续多次使用甘草酸二铵可减轻大鼠肝功能损伤。
线粒体是真核细胞中一个极为重要的细胞器。在维持细胞生理功能的过程中，线粒体结构和功能的完整性起着尤为重要的作用［24］，它不仅能合成ATP为细胞供能，还在细胞损伤过程中起着关键作用［25］。OCT是一种主要存在于肝细胞线粒体内的标志性酶，肝损伤后肝细胞膜及线粒体外膜通透性增加，OCT随之释放入血，因此血清内OCT含量增加提示肝细胞线粒体受损［11，23］。本研究结果显示，单纯烫伤组大鼠伤后各时间点血清OCT含量均较假伤组显著升高，说明严重烫伤大鼠伤后存在线粒体损伤，而注射甘草酸二铵后大鼠血清OCT含量均明显降低，与相关研究结果［12，26］一致。且连续注射甘草酸二铵3次后，大鼠血清中OCT含量下降得更为明显，这说明多次使用甘草酸二铵对线粒体损伤的改善作用较单次注射更为明显。本研究团队还检测了肝组织中Bcl-2和Bax的表达水平，Bcl-2及Bax是Bcl-2蛋白家族中的重要成员［25］。Bcl-2蛋白家族定位在线粒体外膜上，其促凋亡和抗凋亡成员在线粒体表面相互作用。当细胞内出现应激信号时，促凋亡蛋白如胞质Bax蛋白被激活并转移到线粒体表面，在线粒体表面中和抗凋亡蛋白如Bcl-2膜蛋白，从而触发线粒体膜通透性增加，继而诱导凋亡［25］。本研究结果显示，单纯烫伤组大鼠伤后各时间点Bcl-2 mRNA和蛋白表达均较假伤组减少，而Bax mRNA和蛋白表达均较假伤组增加；注射1次甘草酸二铵后，大鼠肝组织中Bcl-2及Bax的mRNA及蛋白表达均无明显改变，但连续注射3次甘草酸二铵后，大鼠肝组织中Bcl-2的mRNA及蛋白表达均明显增加，Bax的mRNA及蛋白表达均明显减少。以上结果提示连续多次使用甘草酸二铵可减轻烫伤引起的线粒体损伤。
研究表明，严重烧伤会导致肝脏结构和功能完整性破坏，钙稳态失衡，肝凋亡和内质网稳态失衡等改变［27］，继而使肝脏功能出现紊乱，其中内质网过度应激和线粒体损伤是2种重要的通路。内质网是细胞中不可或缺的亚细胞单位，负责蛋白质的合成、修饰、折叠、组装和运输［28, 29］。当在炎症、氧化应激和缺氧等压力条件下，错误折叠或未折叠蛋白不断累积，内质网稳态被打破，功能出现紊乱，即为内质网应激［30］。细胞为缓解内质网应激，帮助内质网恢复功能，会触发未折叠蛋白反应（UPR）。本研究主要关注的是UPR中的PERK通路。在正常情况下，PERK与GRP78紧密连接，保持在非活力状态；当内质网稳态受到干扰时，PERK会与GRP78解离，磷酸化后形成二聚体，即磷酸化PERK（p-PERK）。 p-PERK将下游的真核起始因子2α磷酸化，促进ATF4翻译，从而启动一系列基因转录来缓解内质网压力［31］。然而，内质网应激过于严重时，ATF4会诱导促细胞凋亡程序的运行［30］。有研究表明，严重烧伤可激活内质网应激信号转导途径 ［23］。同样，本研究结果显示，严重烫伤大鼠肝组织中内质网应激相关标志物GRP78、ATF4、PERK的mRNA和蛋白表达水平在烫伤后显著升高；注射1次甘草酸二铵后，肝组织中ATF4、GRP78及PERK的mRNA及蛋白表达均无明显改变；连续注射2次甘草酸二铵后，肝组织中ATF4的mRNA及蛋白表达有所下降，但GRP78及PERK的mRNA及蛋白表达均无明显改变；连续注射3次甘草酸二铵后，肝组织中ATF4、GRP78及PERK的mRNA及蛋白表达均明显降低。以上结果提示连续多次使用甘草酸二铵可减轻烫伤引起的内质网应激。
综上所述，严重烫伤会起内质网应激与线粒体损伤，造成肝功能损伤；甘草酸二铵可明显减弱肝内质网应激，同时改善线粒体功能，继而有效降低严重烫伤后大鼠肝损伤的程度。然而，目前尚不清楚线粒体损伤是否诱导内质网应激，或者内质网应激是否诱导线粒体损伤。有研究显示，线粒体损伤和内质网应激可能是相互联系的［32］，而甘草酸二铵具有改善肝线粒体功能的作用并减轻肝内质网应激，从而减轻肝损伤，但其潜在关联仍需进一步实验深入研究。
所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 2种人工真皮试样支架表面和纵切面形貌观察。1A.A型真皮表观形貌，表面均匀分布着大量圆形和椭圆形的微孔 扫描电镜×30，图中标尺为1 mm；1B.B型真皮表观形貌，可见蜂窝煤状贯穿大孔呈矩阵有序排列 扫描电镜×30，图中标尺为1 mm；1C.A型真皮纵切面形貌，可观察到柱状孔壁大体呈平行纵向排列 扫描电镜×200，图中标尺为200 μm；1D.B型真皮纵切面形貌，清晰可见蜂窝煤状贯穿大孔断面（白色虚线标记） 扫描电镜×100，图中标尺为300 μm
注：A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮
2 不同时间点L929细胞在2种支架上的黏附生长情况 鬼笔环肽-罗丹明-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×400，图中标尺为100 μm。2A、2B、2C、2D.分别为细胞在A型真皮接种1、4、7、14 d黏附生长情况，接种后的细胞均呈时间依赖性增殖；2E、2F、2G、2H.分别为细胞在B型真皮分别接种1、4、7、14 d黏附生长情况，与图2A、2B、2C、2D相比，细胞在B型真皮上的黏附生长、增殖速率更高
注：细胞骨架阳性染色为红色，细胞核阳性染色为蓝紫色；A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮
3 接种后7 d 2种细胞在2种真皮支架中的长入情况 鬼笔环肽-罗丹明-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×400，图中标尺为200 μm。3A、3B.分别为人脐静脉内皮细胞分别向A、B型真皮支架纵向长入情况，细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架；3C、3D.分别为L929细胞分别向A、B型真皮支架纵向长入情况，细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架
注：细胞骨架阳性染色为红色，细胞核阳性染色为蓝紫色；A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮
4 接种后7 d 2种细胞在2种真皮支架中的长入情况 苏木精-伊红×400，图中标尺为100 μm。4A、4B.分别为人脐静脉内皮细胞分别向A、B型真皮支架长入情况，细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架；4C、4D.分别为L929细胞分别向A、B型真皮支架长入情况，细胞长入B型真皮支架的数量明显多于A型真皮支架
注：细胞核阳性染色为蓝紫色（↑）；A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮
5 3组猪背全层皮肤缺损创面移植自体皮存活情况。5A.A型真皮两步法组Ⅱ期术后7 d创面情况，创面移植的自体皮完全存活；5B.B型真皮两步法组Ⅱ期术后7 d的创面情况，创面移植的自体皮完全存活；5C.B型真皮支架一步法组术后14 d创面，创面移植的自体皮完全存活
注：图中小孔为柱状活检样取出后遗留的痕迹；A型真皮两步法组Ⅰ期术后14 d行Ⅱ期自体皮移植，B型真皮两步法组Ⅰ期术后7 d行Ⅱ期自体皮移植；A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮
6 3组猪背全层皮肤缺损创面移植支架中的细胞浸润情况 苏木精-伊红×400，图中标尺为100 μm。6A.Ⅰ期术后4 d，A型真皮两步法组创面中支架内有炎症细胞浸润，未见成纤维细胞（Fb）浸润；6B.Ⅰ期术后7 d，A型真皮两步法组创面中支架内炎症细胞较图6A略有增加，支架创基侧有较多Fb浸润；6C.Ⅰ期术后14 d，A型真皮两步法组创面中支架内炎症细胞较图6B增多，整层支架完全被Fb和毛细血管浸润；6D.Ⅰ期术后4 d，B型真皮两步法组创面中的支架与创基交界处已有少量Fb浸润；6E.Ⅰ期术后7 d，B型真皮支架一步法组创面中的支架整层已被大量Fb浸润；6F.Ⅰ期术后14 d，B型真皮支架一步法组创面中的支架内炎症反应明显消退，支架孔隙间已生成大量致密的新生胶原
注：A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮
7 3组猪背全层皮肤缺损创面中移植支架的血管化情况 二氨基联苯胺-苏木精×100，图中标尺为500 μm。7A.Ⅰ期术后7 d，A型真皮两步法组创面支架中仅基底侧局部可见血管腔；7B. Ⅰ期术后14 d，A型真皮两步法组创面中支架内有较多细小血管样结构均匀长入；7C.Ⅰ期术后7 d，B型真皮两步法组创面中支架的蜂窝煤状贯穿大孔中有大量CD31阳性信号表达；7D.Ⅰ期术后7 d，B型支架一步法组创面中支架完全血管化
注：AD为支架层，AS为移植的自体皮；红色虚线标记处为蜂窝煤状贯穿大孔；棕色为CD31阳性表达，反映细胞血管化情况；A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮
8 B型真皮支架一步法组和A型真皮两步法组猪背创面中的移植支架降解情况。8A.A型真皮两步法组术后28 d创面中支架的降解情况，支架溃散，仅可见大块碎片（↑） 苏木精-伊红×400，图中标尺为100 μm；8B.A型真皮两步法组术后90 d创面中支架降解情况，支架完全降解，所移植自体皮表皮突清晰可见，未见明显瘢痕增生，炎症反应完全消失 苏木精-伊红×100，图中标尺为500 μm；8C.B型真皮支架一步法组术后28 d创面中支架降解情况与8A相似 苏木精-伊红×400，图中标尺为100 μm；8D.B型真皮支架一步法组术后90 d创面中支架降解情况与8B相似 苏木精-伊红×100，图中标尺为500 μm
注：A型真皮指含定向排列三维多孔网状结构的人工真皮，B型真皮指含蜂窝煤状垂直贯穿三维多孔网状结构的人工真皮
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