Effects of N-trimethyl chitosan-recombinant tissue factor pathway inhibitor complex on avulsion flap with roll compaction in rat
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摘要:
目的 探讨季铵化壳聚糖-重组组织因子途径抑制物（rTFPI）复合物对大鼠碾压撕脱皮瓣的影响。 方法 采用实验研究方法。采用离子交联法制备季铵化壳聚糖-rTFPI复合物溶液，用扫描电子显微镜观察复合物形态并测量其直径，用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定并计算复合物中rTFPI的包封率和复合物载药率（样本数为3），采用ELISA法测定放置0、10、30、45、60、90、120、240 min时溶液中rTFPI浓度（观察rTFPI释放情况）并计算其半衰期（样本数为3）。取24只6周龄雄性SD大鼠，按照随机数字表法分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯季铵化壳聚糖组、单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组（每组6只），大鼠背部均制备蒂部位于双侧髂棘连线上、从肌膜表面掀起的碾压撕脱皮瓣，原位缝合后即刻及术后1、2、3 d分别注射1次相应试剂治疗。术后1、3、7 d观察皮瓣大体变化；术后7 d，测量皮瓣成活面积并计算皮瓣成活率；将皮瓣平均分为蒂部、近段、中段、远段，用激光散斑血流成像仪检测皮瓣近段、中段、远段组织血流灌注情况；切取皮瓣中段组织行苏木精-伊红染色，观察组织结构变化和炎症细胞浸润情况，计数每100倍视野中栓塞血管和新生血管。对数据行单因素方差分析和LSD检验。 结果 季铵化壳聚糖-rTFPI复合物呈不规则球形结构，直径为150~200 nm；复合物中rTFPI的包封率为（88.7±2.1）%，复合物的载药率为（2.83±0.09）%。季铵化壳聚糖-rTFPI复合物溶液中rTFPI浓度随放置时间延长而逐渐增加，90 min时释放基本稳定，半衰期为（651±36）min。术后1 d，单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣远段变黑比较明显；术后3 d，单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣远段结痂、坏死较另外2组轻；术后7 d，各组大鼠皮瓣坏死界限清晰。术后7 d，单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣成活率分别为（63±7）%、（73±5）%，较PBS组的（41±3）%和单纯季铵化壳聚糖组的（52±7）%显著升高（P<0.05）；季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣成活率较单纯rTFPI组明显升高（P<0.05）。术后7 d，各组大鼠皮瓣均有血流灌注；单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣近段组织血流灌注值以及单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣近段、中段、远段组织血流灌注值明显高于PBS组（P<0.05或P<0.01），单纯rTFPI组大鼠皮瓣远段组织血流灌注值以及季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段和远段组织血流灌注值明显高于单纯季铵化壳聚糖组（P<0.05或P<0.01），季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段组织血流灌注值明显高于单纯rTFPI组（P<0.01）。术后7 d，PBS组和单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣中段组织中炎症细胞浸润较多，细胞水肿明显；与前面2组相比，单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段组织炎症程度显著降低，栓塞血管数明显减少（P<0.05或P<0.01），新生血管数明显增多（P<0.05或P<0.01）；与单纯rTFPI组比较，季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段组织中新生血管数显著增多（P<0.05）。 结论 通过季铵化壳聚糖装载rTFPI能够起到缓释rTFPI的效果；季铵化壳聚糖-rTFPI复合物较单纯rTFPI能够进一步改善大鼠碾压撕脱皮瓣的血流灌注，提高皮瓣成活率。 -
关键词:
- 皮肤 /
- 壳聚糖 /
- 血液灌注 /
- 重组组织因子途径抑制物 /
- 碾压撕脱皮瓣
Abstract:Objective To investigate the effect of N-trimethyl chitosan-recombinant tissue factor pathway inhibitor (rTFPI) complex on avulsion flap with roll compaction in rat. Methods The experimental methods were adopted. The N-trimethyl chitosan-rTFPI complex solution was prepared by ion cross-linking method. The morphology of the complex was observed by scanning electron microscope, and its diameter was measured. The encapsulation rate of rTFPI in the complex and drug loading rate of the complex was determined and calculated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method (n=3). The concentration of rTFPI in the solution at 0, 10, 30, 45, 60, 90, 120, 240 minutes of storage was measured by ELISA method to observe the release of rTFPI, and its half-life was calculated (n=3). Twenty-four 6-week-old male Sprague-Dawley rats were divided into phosphate buffered saline (PBS) group, N-trimethyl chitosan alone group, rTFPI alone group, and N-trimethyl chitosan-rTFPI group according to the random number table, with 6 rats in each group. The avulsion flaps with roll compaction were prepared on the backs of rats with pedicles located on the line of the bilateral iliac spine and lifted from the surface of the muscle membrane. One injection of corresponding reagents was carried out immediately after in-situ suture and on post operation day (POD) 1, 2, and 3. General changes of the flap were observed on POD 1, 3, and 7. On POD 7, the survival area of the flap was measured and the survival rate of the flap was calculated; the flaps were divided into pedicle, proximal, middle, and distal segments, and the blood perfusion in the proximal, middle, and distal segment tissue of the flap was detected by the laser speckle blood flow imager; tissue samples in the middle of the flap were cut and stained with hematoxylin and eosin to observe the changes in tissue structure and the infiltration of inflammatory cells, and the numbers of embolized blood vessels and new blood vessels per 100 times visual field were counted. Data were statistically analyzed with one-way analysis of variance and least significant difference test. Results The N-trimethyl chitosan-rTFPI complex had an irregular spherical structure with a diameter of 150-200 nm. The encapsulation rate of rTFPI in the complex and drug loading rate of the complex were (88.7±2.1)% and (2.83±0.09)%, respectively. The concentration of rTFPI in the solution of the N-trimethyl chitosan-rTFPI complex gradually increased with prolonged storage time, and the release was basically stable at 90 min, with half-life of (651±36) min. On POD 1, the distal parts of flaps of rats in N-trimethyl chitosan alone group darkened significantly. On POD 3, scabs and necrosis were relatively mild on the distal segment of the flaps of rats in rTFPI alone group and N-trimethyl chitosan-rTFPI group as compared with those of the other two groups. On POD 7, the necrosis boundaries of the flaps of rats in each group were clear. On POD 7, the flap survival rates of rats in rTFPI alone group and N-trimethyl chitosan-rTFPI group were (63±7)% and (73±5)%, respectively, which were significantly higher than (41±3)% in PBS group and (52±7)% in N-trimethyl chitosan alone group. Moreover, the flap survival rate of rats in N-trimethyl chitosan-rTFPI group was significantly higher than that in rTFPI alone group (P<0.05). On POD 7, the flaps of rats in each group had blood perfusion; the blood perfusion values in the proximal segment tissue of the rat flaps in N-trimethyl chitosan alone group and the blood perfusion values in the proximal, middle, and distal segment tissue of the rat flaps in rTFPI alone group and N-trimethyl chitosan-rTFPI group were significantly higher than those in PBS group (P<0.05 or P<0.01); the blood perfusion values in the distal segment tissue of the rat flaps in rTFPI alone group and the blood perfusion values in the middle and distal segment tissue of the rat flaps in N-trimethyl chitosan-rTFPI group were significantly higher than those in N-trimethyl chitosan alone group (P<0.05 or P<0.01); the blood perfusion value in the middle segment tissue of the rat flaps in N-trimethyl chitosan-rTFPI group was significantly higher than that in rTFPI alone group (P<0.01). On POD 7, inflammatory cells infiltrated more and cell edema was obvious in the middle segment tissue of the rat flaps in PBS group and N-trimethyl chitosan alone group. Compared with those of the previous two groups, the inflammation degrees in the middle segment tissue of the rat flaps in rTFPI alone group and N-trimethyl chitosan-rTFPI group were significantly milder, the number of embolized blood vessels was significantly decreased (P<0.05 or P<0.01), and the number of new blood vessels was significantly increased (P<0.05 or P<0.01). Compared with that of rTFPI alone group, the number of new blood vessels in the middle segment tissue of the rat flaps in N-trimethyl chitosan-rTFPI group increased significantly (P<0.05). Conclusions The effect of sustained release of rTFPI can be achieved by loading rTFPI with N-trimethyl chitosan. Compared with rTFPI alone, the N-trimethyl chitosan-rTFPI complex can further improve the blood perfusion of the avulsion flaps with roll compaction in rat and improve the survival rate of the flap. -
碾压撕脱伤是发生车祸、机械损伤时常见的疾病，早期因局部体征不够明显而容易被忽视，最终导致愈合不良，碾压撕脱后皮肤软组织损伤的救治是创伤性疾病的难题［1, 2］。碾压撕脱皮瓣常常引发血管内广泛微血栓，导致局部血运障碍，影响皮瓣成活，因此有效减轻血管壁损伤，降低血栓形成，将可能提高碾压撕脱皮瓣的成活率［3］。研究已经证实组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）在血管壁修复的过程中发挥着重要作用，并且在血管成形术中可能有预防血栓形成的功效［4］。
前期研究显示重组TFPI（rTFPI）可以有效增加碾压撕脱皮瓣的成活面积，临床上可能对预防碾压撕脱皮瓣坏死有作用［5］。然而，运用传统的给药方式易使rTFPI在体内较快衰减［6, 7］，无法长时间作用于撕脱皮瓣。壳聚糖是一种来源丰富的天然高分子结构［8］，具有止血、抗菌、生物相容性好、生物可降解性佳、稳定性高、毒性低等特点［9, 10, 11］，其季铵化改性后具有较好的缓释特性［12, 13］。
本课题组拟通过制备装载rTFPI的季铵化壳聚糖复合物，以缓释rTFPI治疗大鼠撕脱皮瓣血运障碍，研究提高大鼠碾压撕脱皮瓣成活率的方法。
1. 材料与方法
本实验研究符合国家关于动物使用的相关规定，并经浙江大学动物保护协会批准。
1.1 动物及主要试剂与仪器来源
24只6周龄无特殊病原体级健康雄性SD大鼠，体重130~150 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。rTFPI购于美国BioVision公司，壳聚糖季铵盐购于湖南长沙研邦化工科技有限公司，rTFPI的ELISA检测试剂盒购于上海赫澎生物科技有限公司。自制大鼠皮瓣撕脱碾压伤模型机（专利号：CN211558428U），SU8010场发射扫描电镜购于日本日立公司，TS100型光学显微镜购自日本尼康公司，BX60型荧光显微镜摄像机购于日本OLYMPUS公司，Moorflpi型激光散斑血流成像仪购于英国Moor Instruments公司。
1.2 采用离子交联法制备季铵化壳聚糖-rTFPI复合物溶液
取10 mg rTFPI置于Appendorf离心管中，加入1 mL无菌PBS，轻轻涡旋混匀后于-20 ℃冰箱保存待用。取100 μL上述rTFPI母液，加入9 900 μL无菌PBS溶液，制得100 μg/mL的rTFPI溶液。取0.5 g壳聚糖季铵盐，溶于100 mL体积分数1%乙酸溶液中，磁力搅拌使其充分溶解，获得5 mg/mL季铵化壳聚糖溶液。
取上述季铵化壳聚糖溶液10 mL，加入使用PBS稀释rTFPI母液6.25倍后的rTFPI溶液（浓度为1.6 mg/mL）1 mL，磁力搅拌30 min。滴加0.5 mg/mL三聚磷酸钠溶液5 mL，继续搅拌30 min后，制得含有3.125 mg/mL季铵化壳聚糖、100 μg/mL rTFPI的季铵化壳聚糖-rTFPI复合物溶液（季铵化壳聚糖与rTFPI质量比为125∶4）。同时吸取PBS溶液1 mL代替上述rTFPI溶液，按照制备季铵化壳聚糖-rTFPI复合物溶液步骤，制备注射用3.125 mg/mL季铵化壳聚糖溶液。
取100 μL季铵化壳聚糖-rTFPI复合物溶液，置于真空蒸发器中镀金增强成像能力后，于3 000倍扫描电子显微镜视野下观察季铵化壳聚糖-rTFPI复合物的形态并测量直径。
1.3 季铵化壳聚糖-rTFPI复合物中rTFPI的包封率和载药率测定
取rTFPI母液，用PBS配制成rTFPI质量浓度为0、25、50、100、200和400 μg/mL的标准品溶液，按ELISA检测试剂盒操作流程［14］，用酶标仪检测450 nm波长处吸光度值。以标准浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线并建立标准曲线方程。
取季铵化壳聚糖-rTFPI复合物溶液1 mL，于高速离心机（温度25 ℃）中以28 620×g离心10 min。吸取上清液，用ELISA检测试剂盒检测450 nm处吸光度值，并根据前述标准曲线方程计算上清液中rTFPI浓度，结合上清液体积计算出上清液中rTFPI总质量，分别计算季铵化壳聚糖-rTFPI复合物中rTFPI的包封率和复合物的载药率。包封率=（溶液中rTFPI总质量-上清液中rTFPI总质量）÷溶液中rTFPI总质量×100%，载药率=（溶液中rTFPI总质量-上清液中rTFPI总质量）÷溶液中季铵化壳聚糖总质量×100%，其中溶液中rTFPI总质量=100 μg/mL×1 mL，季铵化壳聚糖的总质量=3.125 mg/mL×1 mL。本实验重复3次。
1.4 季铵化壳聚糖-rTFPI复合物中rTFPI的体外释放情况测定
取季铵化壳聚糖-rTFPI复合物溶液10 mL，于37 ℃条件下恒温磁力搅拌，分别于放置0、10、30、45、60、90、120、240 min取样0.1 mL，每次取样后补充相同体积的PBS溶液；将吸取的季铵化壳聚糖-rTFPI溶液置于高速离心机（温度25 ℃）中，以11 180×g离心15 min，取上清液10 μL，同1.3采用ELISA检测试剂盒检测并计算rTFPI浓度。根据不同时间点上清液中rTFPI含量变化，观察rTFPI的体外释药规律，并根据公式M0-M＝M0e-kt及线性回归计算半衰期，其中M0为溶液中rTFPI的总质量，M为不同时间点释放出来的rTFPI质量，e为自然常数，t是时间，k是释放速率常数。本实验重复3次。
1.5 动物分组与处理
取24只SD大鼠，按照随机数字表法分成PBS组、单纯季铵化壳聚糖组、单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组，每组6只。每只大鼠按照50 mg/kg腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠麻醉，背部常规脱毛，用碘酊和体积分数75%乙醇消毒手术部位。参照文献［15, 16］制备大鼠碾压撕脱皮瓣模型，即背部设计一个8.0 cm×2.5 cm的任意皮瓣，蒂部位于双侧髂棘连线上，从肌膜表面掀起皮瓣后，用自制的大鼠皮瓣撕脱碾压伤模型机以3.0 kg施压砝码和2.5 kg牵拉砝码进行碾压、撕脱，反复3次造成碾压撕脱皮瓣，原位缝合，见图1A, 1C。皮瓣表面再次消毒，给予大鼠肌内注射4 万U/mL青霉素溶液和20 μg/mL链霉素溶液各0.5 mL。术后即刻开始于各组大鼠皮瓣中远部皮下注射相应试剂30 μL，其中rTFPI质量浓度为100 μg/mL、季铵化壳聚糖质量浓度为3.125 mg/mL，分6个注射点进行注射，每侧3个，分别距离蒂部2.5、5.0、7.5 cm（图1D），每个注射点注射4~5 μL。之后分别于术后1、2、3 d上午9：00同前注射1次，即共注射4次。
1.6 观测指标
1.6.1 皮瓣大体情况
分别于术后1、3、7 d（如当天需注射，于当天注射前）观察大鼠皮瓣大体情况并拍照。术后7 d，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（美国国立卫生研究院）测量成活皮瓣的面积并计算皮瓣成活率［17, 18］，以皮瓣是否变黑结痂为判定皮瓣坏死与成活的分界，皮瓣成活率=成活皮瓣面积÷设计的皮瓣面积×100%。
1.6.2 血流灌注情况
术后7 d，取各组大鼠，同前麻醉，将皮瓣平均分为蒂部、近段、中段、远段（各2.0 cm宽、2.5 cm长），采用激光散斑血流成像仪检测皮瓣近段、中段和远段组织中间部位的血流灌注情况［19, 20］，每个点位（直径1 mm）测量持续1 min。尽量保证每只大鼠的麻醉时长一致，测量时房间温度均为24 ℃，以减少麻醉时间和温度变化对测量血流灌注的影响。检测完成后，采用激光散斑血流成像仪附带软件包PIMSoft获取、分析和报告血流灌注相对数值。皮瓣的血流灌注情况直观观察：紫红色代表血流灌注多，蓝色代表血流灌注少，黑色代表无血流灌注。
1.6.3 病理学变化
术后7 d，取各组大鼠，颈部脱臼处死，在皮瓣中段区域切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm组织块，常规固定、脱水、包埋和切片（厚度为3~4 μm），行HE染色［21］。在100倍光学显微镜下观察组织结构变化和炎症细胞浸润情况；另用荧光显微镜摄像机拍照，计数新生血管和栓塞血管，每个标本选取5个视野计总数取均值分析。
1.7 统计学处理
采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 季铵化壳聚糖-rTFPI复合物表征和性能
制备的季铵化壳聚糖-rTFPI复合物粒子分布均匀，大小相对一致，基本呈不规则球形结构，直径为150~200 nm，见图2。
rTFPI的标准曲线方程为y=0.005 7x+0.083 8 （R2=0.990 5），其中y代表rTFPI浓度，x代表吸光度值。根据公式计算得出复合物中rTFPI的包封率为（88.7±2.1）%、复合物的载药率为（2.83±0.09）%。在体外缓释实验中，随着放置时间的延长，季铵化壳聚糖-rTFPI复合物中的rTFPI释放率逐渐增加，90 min时释放基本稳定，见图3。根据公式计算得出平均k值为0.005 63，rTFPI半衰期为（651±36）min。
2.2 皮瓣大体情况
所有大鼠皮瓣均存活。术后1 d，单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣远段变黑比较明显，其余3组大鼠皮瓣远段变黑不明显。术后3 d，PBS组大鼠皮瓣中远段变黑，远段皮瓣开始结痂并逐渐坏死；单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣远段也开始结痂坏死；而单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣远段结痂、坏死情况相对较轻，其中季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣变黑结痂情况最轻。术后7 d，各组大鼠皮瓣坏死界限清晰，坏死区域呈干痂，其中季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣结痂坏死范围最小。见图4。
4 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后各时间点大体情况。4A、4B、4C.分别为磷酸盐缓冲液组术后1、3、7 d皮瓣情况，3 d时皮瓣中远段变黑明显且远段开始结痂坏死；4D、4E、4F.分别为单纯季铵化壳聚糖组术后1、3、7 d皮瓣情况，1 d时皮瓣远段变黑明显，3 d时皮瓣远段开始结痂；4G、4H、4I.分别为单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组术后1、3、7 d皮瓣情况，皮瓣远段结痂坏死情况分别较图4A、4B、4C与图4D、4E、4F轻；4J、4K、4L.分别为季铵化壳聚糖-rTFPI组术后1、3、7 d皮瓣情况，皮瓣结痂坏死情况最轻，坏死范围最小术后7 d，PBS组、单纯季铵化壳聚糖组、单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣成活率分别为（41±3）%、（52±7）%、（63±7）%、（73±5）%（F=28.292，P<0.01）。PBS组大鼠皮瓣成活率和单纯季铵化壳聚糖组相近（P>0.05）；与PBS组和单纯季铵化壳聚糖组相比，单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣成活率显著升高（P<0.05）；季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣成活率较单纯rTFPI组显著升高（P<0.05）。
2.3 皮瓣血流灌注情况
术后7 d，PBS组与单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣血流灌注区域相对较少，单纯rTFPI组大鼠皮瓣血流灌注区域较前2组扩大，季铵化壳聚糖-rTFPI组皮瓣大部分区域有血流灌注，见图5。术后7 d，与PBS组比较，单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣近段组织血流灌注值明显升高（P<0.05），单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣近段、中段、远段组织血流灌注值明显升高（P<0.05或P<0.01）；与单纯季铵化壳聚糖组比较，单纯rTFPI组大鼠皮瓣远段组织血流灌注值明显升高（P<0.05），季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段和远段组织血流灌注值明显升高（P<0.01）；与单纯rTFPI组比较，季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣仅中段组织血流灌注值明显升高（P<0.01）。见表1。
5 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d皮瓣血流灌注情况。5A.磷酸盐缓冲液组皮瓣血流灌注区域相对较少；5B.单纯季铵化壳聚糖组皮瓣血流灌注区域与图5A相近；5C.单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组皮瓣血流灌注区域较图5A、5B扩大；5D.季铵化壳聚糖-rTFPI组皮瓣大部分区域有血流灌注注：图中紫红色表示有血流灌注，蓝色表示血流灌注少，黑色表示无血流灌注表1 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d各部分组织血流灌注情况比较（组别 鼠数（只） 近段 中段 远段 PBS组 6 138±33 122±11 94±23 单纯季铵化壳聚糖组 6 176±17a 134±36 80±42 单纯rTFPI组 6 182±42a 154±17 b 130±26be 季铵化壳聚糖-rTFPI组 6 189±24b 190±22 bcd 162±44bc F值 3.889 11.432 7.808 P值 <0.05 <0.01 0.01 注：与磷酸盐缓冲液（PBS）组比较，aP<0.05，bP<0.01；与单纯季铵化壳聚糖组比较，cP<0.01，eP<0.05；与单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组比较，dP<0.01 2.4 病理学变化
术后7 d，PBS组和单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣中段组织中的炎症细胞浸润较多，细胞水肿明显。与前面2组比较，单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段组织中炎症细胞浸润减少，未见明显细胞水肿，其中单纯rTFPI组大鼠皮瓣可见新生毛细血管，季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣组织内新生毛细血管较多，见图6。
6 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d皮瓣中段组织病理情况 苏木精-伊红×100。6A.磷酸盐缓冲液组细胞水肿明显；6B.单纯季铵化壳聚糖组炎症细胞浸润较多，可见细胞水肿；6C.单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组炎症细胞浸润减少，可见新生毛细血管；6D.季铵化壳聚糖-rTFPI组新生毛细血管较图6C增多注：蓝色箭头标记水肿细胞，黑色箭头标记炎症细胞，红色箭头标记新生血管术后7 d，PBS组与单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣中段组织中的栓塞血管数、新生血管数均相近（P>0.05）；与PBS组和单纯季铵化壳聚糖组相比，单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段组织中的栓塞血管数明显减少（P<0.05或P<0.01），新生血管数明显增加（P<0.05或P<0.01）；与单纯rTFPI组相比，季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段组织中栓塞血管数无明显变化（P>0.05），而新生血管数明显增加（P<0.05），见表2。
表2 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d中段组织中每100倍视野下血管情况比较（根，组别 鼠数（只） 栓塞血管数 新生血管数 PBS组 6 16.2±4.3 7.4±1.7 单纯季铵化壳聚糖组 6 15.6±3.0 6.8±1.9 单纯rTFPI组 6 9.8±3.8ab 10.6±2.1cd 季铵化壳聚糖-rTFPI组 6 7.6±1.1ac 14.0±2.2ace F值 8.248 13.924 P值 0.002 0.000 注：与磷酸盐缓冲液（PBS）组比较，aP<0.01，dP<0.05；与单纯季铵化壳聚糖组比较，bP<0.05，cP<0.01；与单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组比较，eP<0.05 3. 讨论
皮肤撕脱伤组织以微循环损伤为重，其发生机制为血管内皮细胞损伤脱落，大量组织因子暴露激发外源性凝血途径，血管内大量微血栓形成，血管周围大量炎症细胞浸润［22, 23, 24］，组织中血管内皮细胞膜表面的细胞黏附分子1及整合素CD11b高表达同时参与皮瓣继发性坏死［25］。因此，应用抗血栓药物预防血栓形成是治疗的重点［26］，临床上常使用抗血栓药物如肝素类药物进行救治［27］，常用于皮瓣术后小切口放血治疗以促进静脉血运［28］，但因其血肿发生率较高很少直接注射至皮瓣区内［29］。
Khouri等［30］研究表明，行游离皮瓣血管吻合术患者应用人rTFPI后血肿发生率低于肝素应用效果，其在手术期间和术后预防血栓形成的效果和肝素一样。rTFPI通过抑制活化的凝血因子Ⅶa和凝血因子Ⅹa的蛋白水解而调节外源性血栓形成［31, 32, 33］ ，rTFPI还可以通过直接与被活化的凝血因子Ⅹa激活的凝血因子Ⅴ相互作用，抑制凝血酶原的组装［34］。本课题组在前期研究和本研究中均观察到，通过在撕脱伤大鼠模型上局部注射rTFPI，可以有效增加碾压撕脱皮瓣的成活面积，但是单纯rTFPI治疗后皮瓣成活率也只是较PBS组增加了20%左右，治疗效果受到一定限制。
为了能够长时间维持组织中较高的rTFPI浓度，本研究通过将季铵化壳聚糖与rTFPI交联，缓释rTFPI以加强其对皮瓣组织的作用。纳米缓释技术［35］是目前医学研究中能够实现药物缓释的理想手段。壳聚糖是一种可再生的天然碱性多糖，具有良好的保湿和吸附性能，是实现纳米缓释作用的理想选择。季铵化壳聚糖纳米粒具有较好的生物黏附性、渗透性和抗菌性，可以改善药物的传递和转运，被广泛应用于医学领域。有研究表明，脂肪酸修饰的带胰岛素的季铵化壳聚糖具有98%以上的包封率和载药率［36］。本研究显示季铵化壳聚糖-rTFPI复合物形态良好，分布均匀，大小一致且适中，rTFPI在季铵化壳聚糖中的包封率较高，约为90%，说明季铵化壳聚糖对rTFPI的吸附或包封能力较强；但季铵化壳聚糖-rTFPI载药率较低，这是因为rTFPI和季铵化壳聚糖的质量差异较大，其在复合物中的占比较低。体外缓释实验显示随着放置时间的延长，季铵化壳聚糖-rTFPI复合物释放rTFPI浓度增加，90 min释放基本趋于稳定，半衰期约为11 h，说明其能够有效稳定地输送释放rTFPI。
本实验表明，与单纯rTFPI治疗比较，经季铵化壳聚糖缓释rTFPI治疗的大鼠皮瓣成活率明显增加。说明通过季铵化壳聚糖装载缓释rTFPI，其作用时间得到延长，可以进一步提高大鼠碾压撕脱皮瓣的成活率，这在后续皮瓣血流监测和病理观察中也得到证实。造模7 d时激光散斑血流成像仪显示，与PBS对照和单纯季铵化壳聚糖治疗比较，经单纯rTFPI治疗和季铵化壳聚糖缓释rTFPI治疗后皮瓣血流灌注明显增多，且季铵化壳聚糖缓释rTFPI治疗皮瓣中段的血流灌注值又明显比单纯rTFPI治疗高。病理结果也显示，与PBS对照和单纯季铵化壳聚糖治疗比较，术后7 d单纯rTFPI治疗和季铵化壳聚糖缓释rTFPI治疗皮瓣的炎症程度显著降低，新生血管明显增多，并且季铵化壳聚糖缓释rTFPI治疗后皮瓣的新生血管数较单纯rTFPI治疗显著增多。进而说明缓释rTFPI治疗能够进一步改善大鼠碾压撕脱皮瓣的微循环，从而减轻皮瓣炎症程度，减少皮瓣坏死面积。季铵化壳聚糖-rTFPI复合物提高大鼠碾压撕脱皮瓣成活率的原因可能与皮瓣组织水肿减轻、炎症细胞浸润减少、血管栓塞减少以及新生毛细血管增生等密切相关，其具体作用机制仍有待进一步深入探究。
本研究联合了rTFPI抑制血管血栓形成的特点以及季铵化壳聚糖纳米粒的缓释抗炎作用，通过适度调控水肿程度、炎症反应以及血管新生能力从而促进大鼠碾压撕脱皮瓣成活。这不仅给撕脱伤皮瓣坏死的治疗提供了新途径，也是纳米材料维持药物有效作用浓度又一次新的尝试，对改善创伤患者撕脱皮瓣存活、提高患者救治率、降低其致残率，具有重要的临床参考意义。
所有作者均声明不存在利益冲突 -
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4 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后各时间点大体情况。4A、4B、4C.分别为磷酸盐缓冲液组术后1、3、7 d皮瓣情况，3 d时皮瓣中远段变黑明显且远段开始结痂坏死；4D、4E、4F.分别为单纯季铵化壳聚糖组术后1、3、7 d皮瓣情况，1 d时皮瓣远段变黑明显，3 d时皮瓣远段开始结痂；4G、4H、4I.分别为单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组术后1、3、7 d皮瓣情况，皮瓣远段结痂坏死情况分别较图4A、4B、4C与图4D、4E、4F轻；4J、4K、4L.分别为季铵化壳聚糖-rTFPI组术后1、3、7 d皮瓣情况，皮瓣结痂坏死情况最轻，坏死范围最小
5 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d皮瓣血流灌注情况。5A.磷酸盐缓冲液组皮瓣血流灌注区域相对较少；5B.单纯季铵化壳聚糖组皮瓣血流灌注区域与图5A相近；5C.单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组皮瓣血流灌注区域较图5A、5B扩大；5D.季铵化壳聚糖-rTFPI组皮瓣大部分区域有血流灌注
注：图中紫红色表示有血流灌注，蓝色表示血流灌注少，黑色表示无血流灌注
6 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d皮瓣中段组织病理情况 苏木精-伊红×100。6A.磷酸盐缓冲液组细胞水肿明显；6B.单纯季铵化壳聚糖组炎症细胞浸润较多，可见细胞水肿；6C.单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组炎症细胞浸润减少，可见新生毛细血管；6D.季铵化壳聚糖-rTFPI组新生毛细血管较图6C增多
注：蓝色箭头标记水肿细胞，黑色箭头标记炎症细胞，红色箭头标记新生血管
表1 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d各部分组织血流灌注情况比较（
组别 鼠数（只） 近段 中段 远段 PBS组 6 138±33 122±11 94±23 单纯季铵化壳聚糖组 6 176±17a 134±36 80±42 单纯rTFPI组 6 182±42a 154±17 b 130±26be 季铵化壳聚糖-rTFPI组 6 189±24b 190±22 bcd 162±44bc F值 3.889 11.432 7.808 P值 <0.05 <0.01 0.01 注：与磷酸盐缓冲液（PBS）组比较，aP<0.05，bP<0.01；与单纯季铵化壳聚糖组比较，cP<0.01，eP<0.05；与单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组比较，dP<0.01 
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表2 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d中段组织中每100倍视野下血管情况比较（根，
组别 鼠数（只） 栓塞血管数 新生血管数 PBS组 6 16.2±4.3 7.4±1.7 单纯季铵化壳聚糖组 6 15.6±3.0 6.8±1.9 单纯rTFPI组 6 9.8±3.8ab 10.6±2.1cd 季铵化壳聚糖-rTFPI组 6 7.6±1.1ac 14.0±2.2ace F值 8.248 13.924 P值 0.002 0.000 注：与磷酸盐缓冲液（PBS）组比较，aP<0.01，dP<0.05；与单纯季铵化壳聚糖组比较，bP<0.05，cP<0.01；与单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组比较，eP<0.05
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