Effects of N-trimethyl chitosan-recombinant tissue factor pathway inhibitor complex on avulsion flap with roll compaction in rat
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摘要:
目的 探讨季铵化壳聚糖-重组组织因子途径抑制物（rTFPI）复合物对大鼠碾压撕脱皮瓣的影响。 方法 采用实验研究方法。采用离子交联法制备季铵化壳聚糖-rTFPI复合物溶液，用扫描电子显微镜观察复合物形态并测量其直径，用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定并计算复合物中rTFPI的包封率和复合物载药率（样本数为3），采用ELISA法测定放置0、10、30、45、60、90、120、240 min时溶液中rTFPI浓度（观察rTFPI释放情况）并计算其半衰期（样本数为3）。取24只6周龄雄性SD大鼠，按照随机数字表法分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯季铵化壳聚糖组、单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组（每组6只），大鼠背部均制备蒂部位于双侧髂棘连线上、从肌膜表面掀起的碾压撕脱皮瓣，原位缝合后即刻及术后1、2、3 d分别注射1次相应试剂治疗。术后1、3、7 d观察皮瓣大体变化；术后7 d，测量皮瓣成活面积并计算皮瓣成活率；将皮瓣平均分为蒂部、近段、中段、远段，用激光散斑血流成像仪检测皮瓣近段、中段、远段组织血流灌注情况；切取皮瓣中段组织行苏木精-伊红染色，观察组织结构变化和炎症细胞浸润情况，计数每100倍视野中栓塞血管和新生血管。对数据行单因素方差分析和LSD检验。 结果 季铵化壳聚糖-rTFPI复合物呈不规则球形结构，直径为150~200 nm；复合物中rTFPI的包封率为（88.7±2.1）%，复合物的载药率为（2.83±0.09）%。季铵化壳聚糖-rTFPI复合物溶液中rTFPI浓度随放置时间延长而逐渐增加，90 min时释放基本稳定，半衰期为（651±36）min。术后1 d，单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣远段变黑比较明显；术后3 d，单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣远段结痂、坏死较另外2组轻；术后7 d，各组大鼠皮瓣坏死界限清晰。术后7 d，单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣成活率分别为（63±7）%、（73±5）%，较PBS组的（41±3）%和单纯季铵化壳聚糖组的（52±7）%显著升高（P<0.05）；季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣成活率较单纯rTFPI组明显升高（P<0.05）。术后7 d，各组大鼠皮瓣均有血流灌注；单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣近段组织血流灌注值以及单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣近段、中段、远段组织血流灌注值明显高于PBS组（P<0.05或P<0.01），单纯rTFPI组大鼠皮瓣远段组织血流灌注值以及季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段和远段组织血流灌注值明显高于单纯季铵化壳聚糖组（P<0.05或P<0.01），季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段组织血流灌注值明显高于单纯rTFPI组（P<0.01）。术后7 d，PBS组和单纯季铵化壳聚糖组大鼠皮瓣中段组织中炎症细胞浸润较多，细胞水肿明显；与前面2组相比，单纯rTFPI组和季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段组织炎症程度显著降低，栓塞血管数明显减少（P<0.05或P<0.01），新生血管数明显增多（P<0.05或P<0.01）；与单纯rTFPI组比较，季铵化壳聚糖-rTFPI组大鼠皮瓣中段组织中新生血管数显著增多（P<0.05）。 结论 通过季铵化壳聚糖装载rTFPI能够起到缓释rTFPI的效果；季铵化壳聚糖-rTFPI复合物较单纯rTFPI能够进一步改善大鼠碾压撕脱皮瓣的血流灌注，提高皮瓣成活率。 -
关键词:
- 皮肤 /
- 壳聚糖 /
- 血液灌注 /
- 重组组织因子途径抑制物 /
- 碾压撕脱皮瓣
Abstract:Objective To investigate the effect of N-trimethyl chitosan-recombinant tissue factor pathway inhibitor (rTFPI) complex on avulsion flap with roll compaction in rat. Methods The experimental methods were adopted. The N-trimethyl chitosan-rTFPI complex solution was prepared by ion cross-linking method. The morphology of the complex was observed by scanning electron microscope, and its diameter was measured. The encapsulation rate of rTFPI in the complex and drug loading rate of the complex was determined and calculated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method (n=3). The concentration of rTFPI in the solution at 0, 10, 30, 45, 60, 90, 120, 240 minutes of storage was measured by ELISA method to observe the release of rTFPI, and its half-life was calculated (n=3). Twenty-four 6-week-old male Sprague-Dawley rats were divided into phosphate buffered saline (PBS) group, N-trimethyl chitosan alone group, rTFPI alone group, and N-trimethyl chitosan-rTFPI group according to the random number table, with 6 rats in each group. The avulsion flaps with roll compaction were prepared on the backs of rats with pedicles located on the line of the bilateral iliac spine and lifted from the surface of the muscle membrane. One injection of corresponding reagents was carried out immediately after in-situ suture and on post operation day (POD) 1, 2, and 3. General changes of the flap were observed on POD 1, 3, and 7. On POD 7, the survival area of the flap was measured and the survival rate of the flap was calculated; the flaps were divided into pedicle, proximal, middle, and distal segments, and the blood perfusion in the proximal, middle, and distal segment tissue of the flap was detected by the laser speckle blood flow imager; tissue samples in the middle of the flap were cut and stained with hematoxylin and eosin to observe the changes in tissue structure and the infiltration of inflammatory cells, and the numbers of embolized blood vessels and new blood vessels per 100 times visual field were counted. Data were statistically analyzed with one-way analysis of variance and least significant difference test. Results The N-trimethyl chitosan-rTFPI complex had an irregular spherical structure with a diameter of 150-200 nm. The encapsulation rate of rTFPI in the complex and drug loading rate of the complex were (88.7±2.1)% and (2.83±0.09)%, respectively. The concentration of rTFPI in the solution of the N-trimethyl chitosan-rTFPI complex gradually increased with prolonged storage time, and the release was basically stable at 90 min, with half-life of (651±36) min. On POD 1, the distal parts of flaps of rats in N-trimethyl chitosan alone group darkened significantly. On POD 3, scabs and necrosis were relatively mild on the distal segment of the flaps of rats in rTFPI alone group and N-trimethyl chitosan-rTFPI group as compared with those of the other two groups. On POD 7, the necrosis boundaries of the flaps of rats in each group were clear. On POD 7, the flap survival rates of rats in rTFPI alone group and N-trimethyl chitosan-rTFPI group were (63±7)% and (73±5)%, respectively, which were significantly higher than (41±3)% in PBS group and (52±7)% in N-trimethyl chitosan alone group. Moreover, the flap survival rate of rats in N-trimethyl chitosan-rTFPI group was significantly higher than that in rTFPI alone group (P<0.05). On POD 7, the flaps of rats in each group had blood perfusion; the blood perfusion values in the proximal segment tissue of the rat flaps in N-trimethyl chitosan alone group and the blood perfusion values in the proximal, middle, and distal segment tissue of the rat flaps in rTFPI alone group and N-trimethyl chitosan-rTFPI group were significantly higher than those in PBS group (P<0.05 or P<0.01); the blood perfusion values in the distal segment tissue of the rat flaps in rTFPI alone group and the blood perfusion values in the middle and distal segment tissue of the rat flaps in N-trimethyl chitosan-rTFPI group were significantly higher than those in N-trimethyl chitosan alone group (P<0.05 or P<0.01); the blood perfusion value in the middle segment tissue of the rat flaps in N-trimethyl chitosan-rTFPI group was significantly higher than that in rTFPI alone group (P<0.01). On POD 7, inflammatory cells infiltrated more and cell edema was obvious in the middle segment tissue of the rat flaps in PBS group and N-trimethyl chitosan alone group. Compared with those of the previous two groups, the inflammation degrees in the middle segment tissue of the rat flaps in rTFPI alone group and N-trimethyl chitosan-rTFPI group were significantly milder, the number of embolized blood vessels was significantly decreased (P<0.05 or P<0.01), and the number of new blood vessels was significantly increased (P<0.05 or P<0.01). Compared with that of rTFPI alone group, the number of new blood vessels in the middle segment tissue of the rat flaps in N-trimethyl chitosan-rTFPI group increased significantly (P<0.05). Conclusions The effect of sustained release of rTFPI can be achieved by loading rTFPI with N-trimethyl chitosan. Compared with rTFPI alone, the N-trimethyl chitosan-rTFPI complex can further improve the blood perfusion of the avulsion flaps with roll compaction in rat and improve the survival rate of the flap. -
结核病严重影响患者身心健康。近些年肺外结核患者占结核病患者总数的百分比达33.4%，呈增高趋势［1, 2, 3, 4, 5］，而胸壁是肺外结核的好发部位之一［6, 7］。胸壁结核的皮下肿物往往久治不愈［8, 9, 10］，其皮肤破溃导致局部窦道和创面形成［11, 12, 13］。结核性胸壁创面的特点是口小底大，伴多发窦道、干酪样坏死及骨质破坏［14, 15, 16］，且清创后容易形成局部无效腔［17, 18］。在结核性创面的修复过程中，采用清创、皮片移植、皮瓣转移修复等［16, 17, 18, 19, 20, 21］，存在复发率高、供区损伤大等问题［16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23］，修复效果仍不理想。解放军总医院第八医学中心烧伤整形科（现合并至解放军总医院第四医学中心烧伤整形医学部）2010年4月—2021年2月收治12例结核性胸壁缺损创面患者，采用部分去表皮局部皮瓣修复，取得较好效果。
1. 对象与方法
本回顾性观察性研究经解放军总医院第八医学中心伦理委员会审批通过，批号：2015ST008。
1.1 入选标准
纳入标准：（1）年龄18~65岁；（2）病变部位的病理切片证实为结核病变，或病变创面分泌物微生物培养结果为结核杆菌阳性；（3）未使用免疫抑制剂者；（4）在行外科手术前采用正规抗结核治疗至少1个月者；（5）坏死组织清创后，缺损面积>6 cm2；（6）均签署手术知情同意书者。排除标准：（1）有严重心肺肾并发症者；（2）患糖尿病、高血压者；（3）过敏体质及孕妇。
1.2 临床资料
患者中男9例、女3例，年龄（42±18）岁。创面位于左侧胸壁或右侧胸壁的患者分别有4例和5例，其余3例患者的创面位于胸骨柄或剑突。10例患者既往有肺结核和结核性脓胸，2例患者有结核性胸膜炎或纵隔淋巴结核病史。4例患者曾行胸腔脓肿清除术或胸廓成形术，其余患者均为脓肿切开后切口不愈合形成局部窦道或创面。术前胸部X线检查显示，4例患者存在局部包裹性积液，10例患者有肋骨或胸骨病变。
1.3 治疗方法
1.3.1 抗结核治疗及术区清创
采用常规抗结核治疗方案，口服异烟肼片，每日1次，每次0.3 g；乙胺丁醇片，每日1次，每次0.5 g；吡嗪酰胺，每日3次，每次0.25 g；利福喷丁，每周2次，每次0.45 g［16，21, 22, 23, 24, 25］。所有患者的修复手术均在全身麻醉下进行，常规消毒，手术前称取用于止血的纱布重量。用亚甲蓝标记病变范围，即经窦道外口向窦道注入2~4 mL亚甲蓝，浸染1 min后切除窦道及其周围被亚甲蓝染色的肉芽组织、手术线结、异物以及病变的骨组织和软骨组织。部分切除物常规送病理学检查，部分切除物做微生物培养检查抗酸杆菌的阳性情况。清创后用体积分数3%过氧化氢溶液、医用碘伏溶液及生理盐水按照体积比1∶1∶1混合后冲洗创面，测量缺损的面积和深度，为4 cm×3 cm×2 cm~16 cm×8 cm×5 cm。
1.3.2 设计部分去表皮局部皮瓣修复结核性胸壁缺损
根据术区清创后的缺损面积，设计局部皮瓣大小和去表皮的范围。皮瓣宽度等于缺损区的宽度，皮瓣长度超出缺损区长度2 cm左右；去表皮的宽度等于创面的深度，去表皮后的真皮脂肪筋膜组织翻转填充到缺损区的深部。为了保证皮瓣血运良好，皮瓣的长宽比≤2∶1。具体设计见图1。如果去表皮的皮瓣组织不能填满腔隙，可以根据需要再适当切除部分表皮。当缺损区域的长宽比>2∶1 时，可将皮瓣宽度设计得宽一些，此时的皮瓣相当于推进皮瓣；或者在缺损的两侧分别设计1个皮瓣，以保证皮瓣血供充足。手术后再次称取用于止血的纱布重量。
1 部分去表皮局部皮瓣修复结核性胸壁缺损的设计示意图。1A.ABCD围成区域为创面区，AEF围成区域为设计的局部皮瓣，BD=DF，AE稍长于AC；1B.皮瓣局部去表皮范围为AGE，GE的长度=创面的深度；1C.局部皮瓣AEF掀起后向上旋转修复创面，去表皮后的真皮脂肪筋膜组织AGE翻转填充到创面ABCD的深部，AG的皮肤边缘与ABC的皮肤相对缝合，G点与C点缝合，D点与F点缝合1.3.3 供区、受区处理及术后抗结核治疗
1例合并支气管瘘患者胸壁缺损面积达16 cm×8 cm，由于局部皮瓣切取面积过大导致供区不能直接缝合，采用自体背部游离中厚皮片修复；其余患者局部皮瓣切取面积均较小，供瓣区直接拉拢缝合。皮瓣与受区缺损缝合后，在皮瓣下放置硅胶引流管，每日引流量少于20 mL时拔除引流管。术后采取1.3.1中的抗结核治疗方案对患者行正规抗结核治疗6个月以上。
1.4 观察指标及数据处理
（1）手术时长、术中出血量（称取术前术后的纱布重量，重量差值即为出血量）；（2）术后引流管累计引流量和留置时长；（3）术后2周皮瓣的存活情况、质地和颜色，受区有无皮下积液和皮肤破溃等以及供区愈合情况，包括有无切口裂开、局部感染、血肿发生；（4）术后1个月行胸部X线检查，必要时加做胸部其他检查，如CT或核磁共振成像，检查患者胸壁缺损创面及伴发的结核病部位有无新发的局部积液和骨质破坏；（5）术后1年内每3个月门诊复查1次，1年后改为每半年进行电话随访1次，记录患者胸壁缺损创面的手术切口有无瘢痕增生、红肿、窦道等。符合正态分布的计量资料数据以
2. 结果
患者手术时长为（104±18）min，术中出血量为（119±53）mL，引流管累计引流量为（134±49）mL，引流管留置时长为（5.3±1.7）d。术后2周，患者的局部皮瓣全部存活，皮瓣质地和颜色与周围正常皮肤接近。术后2周，1例患者胸壁缺损区切口有渗液，部分切口裂开，再次清创后用部分去表皮局部皮瓣填充，术后创面愈合良好；其余患者胸壁缺损区术后2周均无切口感染、皮下积液或切口裂开等情况发生。12例患者的供区切口均愈合，无切口裂开和局部感染以及血肿发生。术后1个月，患者胸部影像学检查未观察到术区存在新的积液或骨质破坏。患者随访时长为6~96个月。术后12个月，1例患者胸壁缺损创面的手术部位切口肿胀、破溃，出现窦道。该患者胸部CT显示，原发病灶附近有部分骨质破坏；再次手术修复时见肋骨周围有窦道与皮肤创面相通，切除部分组织常规行病理及病原学检测，清创后采用局部皮瓣填充，Ⅱ期术后创面愈合良好。其余患者随访显示，胸壁缺损创面愈合良好，无瘢痕、红肿、窦道等。见表1。
表1 12例结核性胸壁缺损患者行部分去表皮局部皮瓣修复术的相关情况患者编号 出血量（mL） 手术时间（min） 累计引流量（mL） 引流管留置时长（d） 随访时间（个月） 不良事件 病例1 80 100 95 4 54 无 病例2 105 80 155 6 31 无 病例3 95 110 187 7 35 远期窦道 病例4 112 120 166 8 22 无 病例5 90 75 120 5 30 无 病例6 89 120 150 7 18 无 病例7 155 90 246 6 20 切口裂开 病例8 125 100 90 4 30 无 病例9 50 120 113 5 92 无 病例10 85 80 72 3 12 无 病例11 205 130 115 5 96 无 病例12 240 120 95 4 6 无 例1 男，48岁，即病例7，主因间断发热、右胸壁包块1年，已经正规抗结核治疗3个月，在外院全身麻醉下行右侧胸壁结核病灶清除术、右侧陈旧脓胸病灶清除术、纤维板剥脱、局部胸廓成形手术，术后2周时切口部分裂开。体格检查显示患者右侧胸廓塌陷，右侧胸壁存在长约20 cm沿肋缘走行的手术切口和清创后范围为8 cm×3 cm×4 cm的缺损，有黄红色分泌物流出。胸部CT显示部分肋骨缺失或被破坏，局部胸廓成形术后部分肋骨缺失及胸腔部分塌陷。患者入院后完善术前检查，并继续抗结核治疗1周后，安排手术治疗。彻底清创后，设计创面周围局部皮瓣及拟去除皮瓣远端表皮，供瓣区直接拉拢缝合。去表皮的皮瓣翻转后填充胸壁组织缺损，关闭创面。术后2周胸壁缺损区部分切口愈合不良。立即安排再次手术，手术时见肋软骨有破溃，再次清创后用局部皮瓣修复。第2次手术后3周胸壁缺损区切口愈合良好。核磁共振成像检查显示，胸壁缺损处已被软组织填充，见图2。第2次手术后1年随访，胸壁缺损区未见复发。
2 采用部分去表皮局部皮瓣修复例1患者结核性胸壁缺损创面。2A.结核性脓胸清创后可见胸壁形成口小底大的胸壁缺损;2B.CT显示肋骨部分缺失（既往手术切除），并有包裹性积液和肋骨的感染破坏；2C.局部皮瓣切取并去除部分表皮;2D.供瓣区直接缝合，部分去表皮局部皮瓣填充清创后的胸壁缺损;2E.第2次手术后3周，切口愈合良好；2F.第2次手术后3周，胸部CT显示胸壁缺损已经被软组织填充修复例2 男，60岁，即病例9，主因左胸壁结核病灶扩大切除术后，胸壁缺损创面裂开1周入院。患者6个月前咳嗽、咯痰，伴有发热及左侧胸痛，诊断为肺脓肿，查痰涂片为抗酸杆菌阳性，以“肺结核、结核性脓胸、肺部感染”在外单位全身麻醉下行左胸壁探查、左胸壁病灶扩大切除清创术，术后16 d切口部分裂开，可见大量坏死组织（图3A）。患者收治入院后，在全身麻醉下切取创面周围局部皮瓣并去除皮瓣远端表皮后用于修复创面（图3B）及填充胸壁缺损。供瓣区直接拉拢缝合。术后1年随访，原手术切口无明显瘢痕增生、红肿、感染和皮下积液（图3C）。随访92个月，胸壁手术区域未见创面复发。
3 采用部分去表皮局部皮瓣修复例2患者结核性胸壁缺损创面。3A.术前胸壁切口下可见有大量坏死组织；3B.设计的2个局部皮瓣部分去表皮后放置到胸壁缺损区待固定；3C.术后1年随访，可见创面愈合良好，无瘢痕增生、红肿、积液3. 讨论
胸壁结核可能由肺结核或结核性胸膜炎的直接侵袭、胸壁淋巴结核的扩散及其他部位结核的血源性播散导致［16，26, 27］。本组病例均有胸壁附近的结核病变，提示胸壁结核可能是由胸壁附近的原发结核病扩散导致的。但本研究中的病例数量较少，基于病历资料还不能说明胸壁结核和肺结核的确定关系，需要进一步研究。
早期诊断结核性创面及预防性抗结核治疗是十分必要的。胸壁结核患者往往没有典型结核病症状，容易误诊［16，27, 28, 29］。本研究采取部分去表皮局部皮瓣修复12例患者的结核性胸壁缺损，其中部分患者于第八医学中心烧伤整形科就诊前往往存在误诊，时间最长的达2年，在诊断不明和未采取正规抗结核治疗的情况下行反复清创，可能是治疗效果不理想甚至创面恶化的原因之一。因此，对于迁延不愈的胸壁脓肿，重点是增强临床医师对结核性胸壁的意识，及时对患者行病理及病原学检测，也可取病变组织行免疫学或PCR诊断［27, 28, 29］。对于有结核病史的疑似感染患者，排除全身及局部因素且经常规抗生素和外科创面治疗30 d以上无效者，要综合检查结果，对其行诊断性预防性抗结核治疗［16，26］。
胸壁结核确诊后，需行正规的抗结核治疗，但局部手术治疗也不可轻视。由于结核杆菌感染的病灶多有干酪样坏死及骨质破坏，容易形成多发窦道［26, 27］，手术易造成切口不愈合甚至其周围出现寒性脓肿。有报道显示，应严格掌握体表组织器官结核的手术适应证，在病变尚未形成明显脓肿时，一般应先采用抗结核治疗；对于脓肿形成或者出现坏死及创面者，应在有效的抗结核治疗下开展外科手术［16］。本组病例均是在正规抗结核治疗的基础上进行手术。
病灶清除不彻底和有无效腔形成是胸壁结核复发的重要原因［14, 15, 16］。本组术后胸壁结核复发患者行第2次手术时，均在肋软骨或肋骨处显示存在结核病灶。术后早期复发患者的渗出液较多，病原微生物培养检测显示存在结核杆菌，推测术区复发可能与清创不彻底或结核杆菌大量繁殖有关。为了较彻底地清创，手术时应仔细检查创面周围有无窦道及脓肿。如果存在窦道，可经窦道注入适量的亚甲蓝，手术时尽可能切除已被亚甲蓝浸染的软组织、骨组织、肋软骨。
为了避免清创后深腔创面形成无效腔，往往需要各种外科方法修复创面。采用肌皮瓣修复是填充深腔创面的常用方法，然而肌皮瓣对供区损伤大，转移的内肌肉可能随时间推移萎缩，且肌肉组织比较脆弱、不易固定。而局部皮片移植，往往因为创基有骨质外露和局部炎症导致皮片存活不良。本研究团队在2010年首次将局部皮瓣切除部分表皮后形成的真皮瓣用于修复支气管瘘和填充胸壁缺损，取得良好效果［21］，至今已经完成12例患者此类手术。部分去表皮局部皮瓣具有以下优点：（1）设计灵活，尤其适合小的深腔创面的填充；（2）较强的渗液吸收能力；（3）填充的真皮脂肪筋膜组织有较好的张力，便于固定；（4）供、受区颜色、厚度、质地相近；（5）无须显微操作，不需要分离血管，解剖层次浅，不累及深层组织，减少了术中出血；（6）不会损伤肌肉或导致肌肉萎缩［20, 21］。采用局部皮瓣修复创面只要保证皮瓣长宽比<2∶1，整个皮瓣的血供就有保证。对于去表皮的范围，可以根据腔隙的大小适当调整，较深的腔隙可以适当扩创后再填充，保证填充皮瓣的顺利成活。本组所有皮瓣均存活良好，复发患者二次手术时可见已填充的去表皮组织均存活良好。
综上所述，部分去表皮局部皮瓣具有无须分离血管，对供区破坏较小，皮瓣设计灵活、切取方便等优点，可以用来修复胸壁结核导致的深腔，也可以用于其他部位深部无效腔的填充。但是本组病例数较少，研究深度有限，需要进一步研究填充组织的远期转归和预后。
所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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4 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后各时间点大体情况。4A、4B、4C.分别为磷酸盐缓冲液组术后1、3、7 d皮瓣情况，3 d时皮瓣中远段变黑明显且远段开始结痂坏死；4D、4E、4F.分别为单纯季铵化壳聚糖组术后1、3、7 d皮瓣情况，1 d时皮瓣远段变黑明显，3 d时皮瓣远段开始结痂；4G、4H、4I.分别为单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组术后1、3、7 d皮瓣情况，皮瓣远段结痂坏死情况分别较图4A、4B、4C与图4D、4E、4F轻；4J、4K、4L.分别为季铵化壳聚糖-rTFPI组术后1、3、7 d皮瓣情况，皮瓣结痂坏死情况最轻，坏死范围最小
5 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d皮瓣血流灌注情况。5A.磷酸盐缓冲液组皮瓣血流灌注区域相对较少；5B.单纯季铵化壳聚糖组皮瓣血流灌注区域与图5A相近；5C.单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组皮瓣血流灌注区域较图5A、5B扩大；5D.季铵化壳聚糖-rTFPI组皮瓣大部分区域有血流灌注
注：图中紫红色表示有血流灌注，蓝色表示血流灌注少，黑色表示无血流灌注
6 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d皮瓣中段组织病理情况 苏木精-伊红×100。6A.磷酸盐缓冲液组细胞水肿明显；6B.单纯季铵化壳聚糖组炎症细胞浸润较多，可见细胞水肿；6C.单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组炎症细胞浸润减少，可见新生毛细血管；6D.季铵化壳聚糖-rTFPI组新生毛细血管较图6C增多
注：蓝色箭头标记水肿细胞，黑色箭头标记炎症细胞，红色箭头标记新生血管
表1 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d各部分组织血流灌注情况比较（
组别 鼠数（只） 近段 中段 远段 PBS组 6 138±33 122±11 94±23 单纯季铵化壳聚糖组 6 176±17a 134±36 80±42 单纯rTFPI组 6 182±42a 154±17 b 130±26be 季铵化壳聚糖-rTFPI组 6 189±24b 190±22 bcd 162±44bc F值 3.889 11.432 7.808 P值 <0.05 <0.01 0.01 注：与磷酸盐缓冲液（PBS）组比较，aP<0.05，bP<0.01；与单纯季铵化壳聚糖组比较，cP<0.01，eP<0.05；与单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组比较，dP<0.01 
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表2 4组大鼠碾压撕脱皮瓣术后7 d中段组织中每100倍视野下血管情况比较（根，
组别 鼠数（只） 栓塞血管数 新生血管数 PBS组 6 16.2±4.3 7.4±1.7 单纯季铵化壳聚糖组 6 15.6±3.0 6.8±1.9 单纯rTFPI组 6 9.8±3.8ab 10.6±2.1cd 季铵化壳聚糖-rTFPI组 6 7.6±1.1ac 14.0±2.2ace F值 8.248 13.924 P值 0.002 0.000 注：与磷酸盐缓冲液（PBS）组比较，aP<0.01，dP<0.05；与单纯季铵化壳聚糖组比较，bP<0.05，cP<0.01；与单纯重组组织因子途径抑制物（rTFPI）组比较，eP<0.05
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