Investigating the effects of Modified Sijunzi Decoction on the diversity of intestinal microflora of severe scald rabbits based on 16S ribosomal RNA high-throughput sequencing
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摘要:
目的 基于16S核糖体RNA（16S rRNA）高通量测序，探讨加味四君子汤对严重烫伤兔肠道菌群多样性的影响。 方法 采用实验研究方法。选取90只6~8个月龄雌雄不限日本大耳兔，按照随机数字表法分为正常对照组、单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组，每组18只。正常对照组兔自由饮食、饮水，单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组兔制作30%体表总面积Ⅲ度烫伤模型后分别给予生理盐水、0.2 g/mL加味四君子汤、1.0 g/mL加味四君子汤、5.0 g/mL加味四君子汤灌胃，持续给药7 d。于分组处理第1、3、7天，采用酶联免疫吸附测定法检测各组兔回肠黏膜组织中的肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、IL-10水平，各组每个时间点的样本数为6。根据前述实验结果，另外选取9只兔分为正常对照组、单纯烫伤组、烫伤+中剂量组，每组3只，各组兔分组及处理方法同前。于分组处理第7天，采用高通量测序技术对3组兔回肠黏膜菌群的16S rRNA V3、V4区进行测序；采用QIIME软件统计菌群优质序列数目；使用RDP Classifier软件分析菌群的门、纲、目、科、属水平；采用Illumina MiSeq测序技术对菌群行α多样性（Ace、Chao1、Simpson、Shannon指数）和β多样性分析。对数据行析因设计方差分析、SNK检验及Bonferroni校正。 结果 与正常对照组相比，单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+中剂量组分组处理第1、3天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显升高（P<0.01），单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显升高（P<0.05或P<0.01），单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均显著降低（P<0.01）。与单纯烫伤组相比，烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第3、7天及烫伤+中剂量组分组处理第1天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低（P<0.01），烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第3、7天及烫伤+中剂量组分组处理第1天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显降低（P<0.01），烫伤+低剂量组分组处理第7天和烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天以及烫伤+高剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。与烫伤+低剂量组相比，烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+高剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低（P<0.01），烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+高剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均显著降低（P<0.05或P<0.01），烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。与烫伤+中剂量组相比，烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显升高（P<0.01），烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均明显降低（P<0.01），烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均显著降低（P<0.01）。与第1天比较，单纯烫伤组分组处理第3、7天以及正常对照组分组处理第3天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显升高（P<0.05或P<0.01），单纯烫伤组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显升高（P<0.01），烫伤+低剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第7天和烫伤中剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）；烫伤+高剂量组分组处理第3、7天及烫伤+中剂量组分组处理第7天的兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），烫伤+中剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平明显降低（P<0.01），单纯烫伤组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平明显降低（P<0.01）。与第3天比较，单纯烫伤组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α、IL-1β水平及正常对照组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组和烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均明显升高（P<0.05或P<0.01），烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低（P<0.05），烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），单纯烫伤组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平明显降低（P<0.01）。分组处理第7天，正常对照组、单纯烫伤组、烫伤+中剂量组兔回肠黏膜中的菌群分别获96 023、107 365、95 921条优质序列。3组兔回肠黏膜中的菌群在门、纲、目、科、属的分类水平上均分别以拟杆菌门和厚壁菌门、梭菌纲和拟杆菌纲、梭菌目和拟杆菌目、瘤胃菌科和梭菌科及拟杆菌科、梭菌属和拟杆菌属及瘤胃菌属菌群为主，但各组菌群组成不同。3组兔回肠黏膜中菌群的Ace、Chao1、Simpson、Shannon指数均没有显著差异（P>0.05），β多样性无明显差异。 结论 严重烫伤后兔回肠黏膜炎症反应明显，并呈时间依赖性增加。加味四君子汤可减轻炎症反应，其治疗效果最佳质量浓度为1.0 g/mL。高通量测序法能够精准地反映肠道菌群的结构组成，加味四君子汤对严重烫伤后肠道菌群具有一定的调节作用。 Abstract:Objective To investigate the effects of Modified Sijunzi Decoction on the diversity of intestinal microflora of in severe scald rabbits based on 16S ribosomal RNA (16S rRNA) high-throughput sequencing. Methods The experimental research method was adopted. Ninety Japanese big-ear rabbits regardless gender, aged 6 to 8 months, were randomly divided into normal control group, scald alone group, scald+low-dose group, scald+medium-dose group, and scald+high-dose group, with 18 rabbits in each group. The rabbits in normal control group were free to eat and drink, and the rabbits in scald alone group, scald+low-dose group, scald+medium-dose group, and scald+high-dose group were intragastrically administered normal saline, 0.2 g/mL Modified Sijunzi Decoction, 1.0 g/mL Modified Sijunzi Decoction, and 5.0 g/mL Modified Sijunzi Decoction, respectively for 7 days after sustaining full-thickness scalding of 30% total body surface area. On the 1st, 3rd, and 7th day after grouping, the levels of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 1β (IL-1β), and IL-10 in ileal mucosa tissue of rabbits in each group were determined by enzyme-linked immunosorbent assay, and the number of samples in each group at each time point was 6. According to the above experimental results, another 9 rabbits were selected and divided into normal control group, scald alone group and scald+medium-dose group, with 3 rabbits in each group. The grouping and treatment methods of rabbits in each group were the same as before. On the 7th day after grouping, the V3, V4 region of 16S rRNA of ileum mucosa of rabbits in three groups were sequenced by high-throughput sequencing technology. The number of quality bacteria was counted by QIME software. The classifications of phylum, class, order, family and genus of microflora were analyzed by RDP Classifier software. The α diversity (Ace, Chao1, Simpson, and Shannon indexes) and β diversity were analyzed by Illumina MiSeq sequencing technology, and the number of experiment samples in each group was 3. Data were statistically analyzed with analysis for variance of factorial design, SNK test, and Bonferroni correction. Results Compared with that in normal control group, the levels of TNF-α of ileal mucosa tissue of rabbits in scald alone group, scald+low-dose group, and scald+high-dose group on the 1st, 3rd, and 7th day after grouping and scald+medium-dose group on the 1st and 3rd day after grouping were all significantly increased (P<0.01), the levels of IL-1β in ileal mucosa tissue of rabbits in scald alone group, scald+low-dose group, scald+medium-dose group and scald+high-dose group on the 1st, 3rd, and 7th day after grouping were all significantly increased (P<0.05 or P<0.01), and the levels of IL-10 in ileal mucosa tissue of rabbits in scald alone group, scald+low-dose group, scald+medium-dose group, and scald+high-dose group on the 1st, 3rd, and 7th day after grouping were all significantly decreased (P<0.01). Compared with that in scald alone group, the levels of TNF-α in ileal mucosa tissue of rabbits in scald+low-dose group, scald+medium-dose group, and scald+high-dose group on the 3rd and 7th day after grouping, and scald+medium-dose group on the 1st day after grouping were all significantly decreased (P<0.01), and the levels of IL-1β in ileal mucosa tissue of rabbits in scald+low-dose group, scald+medium-dose group, and scald+high-dose group on the 3rd and 7th day after grouping and scald+medium-dose group on the 1st day after grouping were all significantly decreased (P<0.01), and the levels of IL-10 in ileal mucosa tissue of rabbits in scald+low-dose group on the 7th day after grouping and scald+medium-dose group on the 1st, 3rd, and 7th day after grouping and scald+high-dose group on the 3rd and 7th day after grouping were all significantly increased (P<0.05 or P<0.01). Compared with that in scald+low-dose group, the levels of TNF-α in ileal mucosa tissue of rabbits in medium-dose scald alone group on the 1st, 3rd, and 7th day after grouping and in high-dose scald alone group on the 3rd and 7th day after grouping were significantly decreased (P<0.01), and the levels of IL-1β in ileal mucosa tissue of rabbits in medium-dose scald alone group on the 1st, 3rd, and 7th day after grouping and in high-dose scald alone group on the 3rd and 7th day after grouping were all significantly decreased (P<0.05 or P<0.01), and the levels of IL-10 in ileal mucosa tissue of rabbits in scald+medium-dose group on the 1st, 3rd, and 7th day after grouping and in scald+high-dose group on the 7th day after grouping were all significantly increased (P<0.05 or P<0.01). Compared with that in scald medium-dose group, the levels of TNF-α in ileal mucosa tissue of rabbits in scald+high-dose group on the 1st, 3rd, and 7th day after grouping were all significantly increased (P<0.01), and the levels of IL-10 in ileal mucosa tissue of rabbits in scald+high-dose group on the 1st, 3rd, and 7th day after grouping were all significantly decreased (P<0.01), and the levels of IL-1β in ileal mucosa tissue of rabbits in scald+high-dose group on the 7th day after grouping was significantly decreased (P<0.01). Compared with that on the 1st day after grouping, the levels of TNF-α in ileal mucosa tissue of rabbits in scald alone group on the 3rd and 7th day after grouping and in normal control group on the 3rd day after grouping were all significantly increased (P<0.05 or P<0.01), and the levels of IL-1β in ileal mucosa tissue of rabbits in scald alone group both on the 3rd and 7th day after grouping were significantly increased (P<0.01), and the levels of IL-10 in ileal mucosa tissue of rabbits in both scald+low-dose group and scald+high-dose group on the 7th day after grouping and scald+medium-dose group both on the 3rd and 7th day after grouping were significantly increased (P<0.05 or P<0.01), and the levels of TNF-α in ileal mucosa tissue of rabbits in scald+high-dose group on the 3rd and 7th day after grouping and in scald+medium-dose group on the 7th day after grouping were all significantly decreased (P<0.05 or P<0.01), and the level of IL-1β in ileal mucosa tissue of rabbits in scald+medium-dose group on the 7th day after grouping was significantly decreased (P<0.01), and the level of IL-10 in ileal mucosa tissue of rabbits in scald alone group on the 7th day after grouping was significantly decreased (P<0.01). Compared with that on the 3rd day after grouping, the levels of TNF-α and IL-1β in ileal mucosa tissue of rabbits in scald alone group and the levels of IL-10 in ileal mucosa tissue of rabbits in normal control group, scald+low-dose group, scald+medium-dose group, and scald+high-dose group on the 7th day after grouping were all significantly increased (P<0.05 or P<0.01); and the levels of TNF-α in ileal mucosa tissue of rabbits in scald+low-dose group, scald+medium-dose group, and scald+high-dose group on the 7th day after grouping were all significantly decreased (P<0.05), and the levels of IL-1β in ileal mucosa tissue of rabbits both in scald+medium-dose group and scald+high-dose group on the 7th day after grouping were significantly decreased (P<0.05 or P<0.01), and the levels of IL-10 in ileal mucosa tissue of rabbits in scald alone group on the 7th day after grouping was significantly decreased (P<0.01). On the 7th day after grouping, the high-quality sequences obtained from the microflora in ileum mucosa of rabbits in normal control group, scald alone group, and scald+medium-dose group were 96 023, 107 365, and 95 921, respectively. At the classification level of phylum, class, order, family, and genus of the microflora in ileum mucosa of rabbits in three groups were all Bacteroidetes and Firmicutes, Clostridium and Bacteroidetes, Clostridium and Bacteroidetes, Rumenobacteriaceae and Clostridium and Bacteroideaceae, Clostridium and Bacteroidetes and rumen bacteria mainly, while the percentage of microflora in each group was different. There were no significant differences in Ace, Chao1, Simpson, Shannon indices (P>0.05), and no obvious difference in β diversity of microflora in ileal mucosa tissue of rabbits among three groups. Conclusions After severe scalding, the inflammatory response of rabbit ileal mucosa tissue is obvious and increased in a time-dependent manner. Modified Sijunzi Decoction can reduce inflammation with optimal therapeutic concentration of 1.0 g/mL. The technology of high-throughput sequencing can reflect the structural composition of the intestinal microflora accurately. The ileal microflora of the severe scald rabbit can be regulated by the administration of Modified Sijunzi Decoction. -
(1)回顾分析显示，脉冲染料激光动态联合曲安奈德治疗瘢痕疙瘩可较单纯曲安奈德注射治疗缩短显效时间，减少曲安奈德注射次数，增加随访次数，提高患者依从性。
(2)通过与单纯曲安奈德注射治疗效果对比，为脉冲染料激光动态联合曲安奈德治疗瘢痕疙瘩的临床深入应用提供了参考依据。
瘢痕疙瘩是一种特殊的病理性瘢痕，不仅影响患者外观及功能，还对患者生活造成影响［1, 2］。目前瘢痕疙瘩治疗方法众多［3］，但单一治疗方式往往难以达到满意的疗效，个体化、综合性动态治疗已成为瘢痕疙瘩治疗的趋势［4, 5］。糖皮质激素类药物瘢痕内局部注射是瘢痕疙瘩综合性治疗的常用方法，曲安奈德则是使用最广泛的糖皮质类激素［6］。但单独注射糖皮质激素治疗瘢痕疙瘩的耗时较长，不良反应较多，且愈后瘢痕疙瘩的复发率较高［5］。近年来的研究表明，糖皮质激素类药物瘢痕内注射联合激光治疗模式，可提高治疗效果并减少不良反应［7］。目前，脉冲染料激光（PDL）已成为瘢痕疙瘩综合性治疗中的主要激光之一［8］。不同于皮肤血管性疾患，瘢痕疙瘩具有自身特殊性，如质地较硬且厚等；采用PDL治疗瘢痕疙瘩可能难以达到治疗深度而影响治疗效果，且不恰当的治疗时机以及过激的照射可能激发炎症反应反而加重病情。因此，PDL在瘢痕疙瘩综合动态治疗中的临床应用及疗效尚需进一步探索。本研究拟通过分析PDL动态联合曲安奈德在非手术瘢痕疙瘩患者治疗中的应用效果，探讨该动态疗法在瘢痕疙瘩的个体化综合治疗方案中的有效性。
1. 对象与方法
本回顾性观察性研究符合《赫尔辛基宣言》的基本原则。根据河南大学淮河医院伦理委员会的相关规定，可以在不泄露患者身份的前提下分析、使用相关临床资料。
1.1 入选标准
纳入标准：（1）接受非手术治疗的瘢痕疙瘩患者；（2）随访时间≥1年，临床资料数据完整的患者；（3）至少进行过1次PDL+曲安奈德联合治疗或者单纯曲安奈德注射治疗。排除标准：（1）免疫缺陷患者或6个月内接受过其他治疗患者；（2）合并心脏病、糖尿病等原发性基础性疾病患者。
1.2 临床资料与分组
2015年4月—2020年10月，河南大学淮河医院收治34例符合入选标准的瘢痕疙瘩患者，共46处瘢痕疙瘩，瘢痕疙瘩病程为2~240个月。根据采用的治疗方式，将患者分为曲安奈德组（18例）与动态治疗组（16例），前一组患者中男8例、女10例，年龄（30±12）岁，与后一组患者中男6例、女10例的性别分布（P=0.738）及（26±11）岁的年龄（t=0.89，P=0.382）相近。曲安奈德组、动态治疗组患者瘢痕疙瘩数分别为26、20个，病程分别为36.0（24.0，51.0）、42.0（19.5，120.0）个月（Z=-0.64，P=0.524），初诊体积分别为0.52（0.20，1.53）、0.66（0.17，1.54）cm3（Z=-0.06，P=0.956）；曲安奈德组患者瘢痕疙瘩分布在前胸（11个）与肩背、耳、下颌（各3个）以及颈、腹、四肢（各2个），与动态治疗组患者前胸（13个）、肩背（3个）、耳（2个）及颈与会阴（各1个）的部位分布相近（χ2=7.08，P=0.424）；曲安奈德组患者瘢痕疙瘩随访时间为26.0（15.0，37.8）个月，明显长于动态治疗组的15.0（12.0，24.5）个月（Z=-2.78，P=0.005）。
1.3 治疗方法
（1）曲安奈德组：将5 mL质量浓度为10 mg/mL的曲安奈德与5 mL质量浓度为20 g/L的利多卡因混合配制成注射混合液，根据瘢痕大小选择适当的注射范围。采用多点分层注射法，尽可能覆盖患处。边退针边注射，至瘢痕组织苍白充盈为止，注射量为2 mg/cm2，每次注射总量不高于40 mg。建议该组患者1个月治疗1次并行治疗前温哥华瘢痕量表（VSS）评分。（2）动态治疗组：每次治疗前，采用VSS评估瘢痕情况，据此选择治疗方式。若仅厚度和/或柔软度>2分，则仅同前给予曲安奈德注射治疗；若仅色泽和/或血管分布>2分，则仅给予PDL治疗；若厚度和/或柔软度>2分且色泽和/或血管分布>2分，则给予PDL+曲安奈德联合治疗［9］；若厚度、柔软度、色泽、血管分布各项评分均<2分，则不进行治疗。PDL治疗中使用595 nm PDL治疗仪，选择光斑直径7 mm、脉冲宽度1.5~30.0 ms、能量密度8.5~13.5 J/cm2，以出现轻度紫癜为治疗终点。PDL+曲安奈德联合治疗中先进行同前PDL治疗后，即刻冷敷30 min，之后继续行前述曲安奈德注射治疗。建议该组患者每个月就诊接受评估。
1.4 评估指标
1.4.1 瘢痕疙瘩评分
首次治疗前及首次治疗后（以下简称治疗前与治疗后）12个月，由2名未参与治疗的河南大学淮河医院整形修复外科医师使用同一台数码相机拍摄患者瘢痕疙瘩照片，并采用VSS、患者与观察者瘢痕评估量表（POSAS）评估瘢痕疙瘩情况［10］。VSS包含厚度、柔软度、色泽、血管分布条目，总分为0~15分［11］；POSAS包含观察者量表和患者量表，观察者量表包括血管分布、色泽、厚度、表面粗糙度、柔软度和表面积条目，患者量表包括疼痛程度、瘙痒程度、颜色、硬度、厚度及自我感受条目，总分为12~120分［10］。结果记录总评分及各量表中色泽和血管分布总分。总分越低越好。
1.4.2 生活质量评分
同1.4.1中时间，由1.4.1中医师采用皮肤病生活质量指数（DLQI）量表评估瘢痕疙瘩对患者生活质量的影响情况。DLQI量表共有10个问题，包括症状感受、日常活动、休闲娱乐、工作学习、人际关系及治疗维度，总分为0~30分［12］。总分越低越好。
1.4.3 疗效评价
治疗后12个月，依据VSS评分进行瘢痕疙瘩疗效评价并计算显效率。VSS总评分11~15分为无效，6~10分为好转，1~5分为显效，0分为痊愈［13］；显效率=（显效瘢痕疙瘩数+痊愈瘢痕疙瘩数）÷瘢痕疙瘩总数×100%。
1.4.4 首次显效时间及达到首次显效时曲安奈德累计注射次数
记录瘢痕疙瘩首次达到显效所花的治疗时间、从治疗开始至首次达到显效期间所注射的曲安奈德次数。
1.4.5 随访次数及不良反应
记录瘢痕疙瘩治疗后12个月内随访次数（以此体现患者依从性）与不良反应发生情况并计算不良反应发生率。PDL治疗后可能出现水疱、紫癜、色素沉着等不良反应，曲安奈德治疗后可能出现皮质醇增多症、毛细血管扩张、局部凹陷、色素沉着或脱失、药物沉渣等不良反应。同一个瘢痕疙瘩多次发生同一种不良反应只计1次。不良反应发生率=不良反应发生次数÷瘢痕疙瘩总数×100%。
1.5 统计学处理
采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析。计量资料数据中符合正态分布者用
2. 结果
2.1 瘢痕疙瘩评分
曲安奈德组、动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月的VSS总评分均较治疗前明显降低（t值分别为7.53、8.09，P<0.001），VSS、POSAS中色泽和血管分布总分与POSAS总评分均较治疗前明显降低（Z值分别为-3.71、-4.04、-4.21，-3.76、-3.73、-3.92，P<0.001）。2组患者瘢痕疙瘩治疗前、治疗后12个月的VSS、POSAS总评分以及治疗前VSS、POSAS中色泽和血管分布总分均相近（P>0.05），动态治疗组患者治疗后12个月瘢痕疙瘩的VSS、POSAS中色泽和血管分布总分均明显低于曲安奈德组（P<0.05）。见表1。
表1 2组瘢痕疙瘩患者首次治疗前后瘢痕疙瘩评分比较（分）组别 瘢痕疙瘩数（个） VSS总评分（ VSS中色泽和血管分布总分［M（Q1，Q3）］ POSAS总评分［M（Q1，Q3）］ POSAS中色泽和血管分布总分［M（Q1，Q3）］ 治疗前 治疗后12个月 治疗前 治疗后12个月 治疗前 治疗后12个月 治疗前 治疗后12个月 曲安奈德组 26 9.1±1.2 5.3±2.7a 4.00（4.00，4.25） 3.00（1.00，3.25）a 60.5（54.0，65.0） 37.0（22.5，52.8）a 14.0（13.0，17.0） 11.0（6.8，12.5）a 动态治疗组 20 9.4±1.7 4.8±2.7a 4.00（4.00，5.00） 1.00（1.00，2.00）a 60.5（49.5，80.0） 30.0（22.8，38.8）a 14.0（14.0，16.8） 6.0（3.5，9.0）a 统计量值 t=-0.55 t=0.54 Z=-0.07 Z=-2.03 Z=-0.52 Z=-0.37 Z=-0.17 Z=-2.12 P值 0.587 0.593 0.941 0.042 0.602 0.593 0.866 0.034 注：动态治疗组疗法包括行曲安奈德注射、脉冲染料激光（PDL）或者PDL联合曲安奈德注射治疗；VSS为温哥华瘢痕量表，POSAS为患者与观察者瘢痕评估量表；与治疗前比较，aP<0.01 2.2 生活质量评分
曲安奈德组、动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月DLQI量表评分分别为4.0（0，10.0）、3.0（2.0，6.8）分，均明显低于治疗前的12.0（8.0，13.0）和10.0（9.0，11.0）分（Z值分别为-4.11、-3.93，P<0.001）。2组患者治疗前、治疗后12个月DLQI量表评分均相近（Z值分别为-1.02、-0.09，P值分别为0.309、0.930）。
2.3 疗效评价
治疗后12个月，曲安奈德组患者瘢痕疙瘩达到显效者12个（46.15%）、好转者12个（46.15%）、无效者2个（7.70%），显效率为46.15%（12/26）；动态治疗组患者瘢痕疙瘩达到痊愈者2个（10.00%）、显效者13个（65.00%）、好转者4个（20.00%）、无效者1个（5.00%），显效率为75.00%（15/20），明显高于曲安奈德组（Z=3.88，P=0.047）。
2.4 首次显效时间及达到首次显效时曲安奈德累计注射次数
动态治疗组患者瘢痕疙瘩首次显效时间为5.5（2.0，6.0）个月，明显短于曲安奈德组的6.0（2.3，10.3）个月（Z=4.02，P=0.045）。动态治疗组患者瘢痕疙瘩达到首次显效时曲安奈德累计注射次数为（3.2±1.7）次，明显少于曲安奈德组的（4.2±1.8）次（t=2.09，P=0.043）。
2.5 随访次数及不良反应
动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月内随访次数为（6.5±2.1）次，明显多于曲安奈德组的（5.0±1.4）次（t=-2.94，P=0.005）。
治疗后12个月内，2组患者均未出现皮质醇增多症等全身性不良反应，动态治疗组患者激光治疗后未出现水疱等不良反应。动态治疗组患者瘢痕疙瘩治疗后12个月内5种不良反应发生率及总不良反应发生率均低于曲安奈德组，但差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2 2组瘢痕疙瘩患者首次治疗后12个月内不良反应发生情况[次（%）]组别 瘢痕疙瘩数（个） 毛细血管扩张 色素沉着 局部凹陷 药物沉渣 色素脱失 总不良反应 曲安奈德组 26 7（26.92） 4（15.38） 2（7.69） 2（7.69） 2（7.69） 17（65.38） 动态治疗组 20 2（10.00） 2（10.00） 1（5.00） 1（5.00） 1（5.00） 7（35.00） P值 0.262 0.684 >0.999 >0.999 >0.999 0.073 注：动态治疗组疗法包括行曲安奈德注射、脉冲染料激光（PDL）或者PDL联合曲安奈德注射治疗 2.6 典型病例
例1
女，33岁，前胸部表面皮肤毛囊炎后形成瘢痕疙瘩14年余，瘢痕疙瘩体积约为2.40 cm3，偶伴瘙痒、疼痛等症状，因采用的治疗方式被纳入动态治疗组。治疗前VSS、POSAS总评分分别为10、64分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为4、13分，DLQI评分10分，行PDL联合曲安奈德注射治疗。治疗后1个月，瘢痕疙瘩质地有所软化，厚度变薄，基本平整，颜色得到改善，VSS总评分为6分，继续进行前述联合治疗。治疗后2个月，瘢痕疙瘩平整，质地柔软，颜色改善，VSS总评分为3分，此时首次达到显效（累计注射2次曲安奈德）。治疗后3~5个月随访未治疗，至治疗后6个月，瘢痕疙瘩稍突出皮面，色泽加深伴血管增生，VSS总评分为5分，再次给予联合治疗。之后随访（治疗后7、9个月未随访），至治疗后12个月，瘢痕疙瘩趋于平稳，VSS、POSAS总评分分别为4、20分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为2、5分，DLQI评分4分；治疗后12个月内，随访10次，未发生不良反应。治疗后24个月，VSS总评分为4分，瘢痕疙瘩趋于平稳，未见复发迹象。见图1。
1 例1动态治疗组患者前胸部表面皮肤毛囊炎后形成瘢痕疙瘩首次治疗前后情况。1A.治疗前，瘢痕疙瘩明显高于体表，充血明显；1B.行脉冲染料激光联合曲安奈德注射治疗后1个月，瘢痕疙瘩厚度变薄，颜色得到改善；1C.治疗后2个月，瘢痕疙瘩平整，颜色改善，达到显效例2
女，45岁，不明原因导致肩背部形成瘢痕疙瘩10年余，瘢痕疙瘩体积约为10.18 cm3，偶伴瘙痒，无疼痛等症状，因采用的治疗方式被纳入曲安奈德组。治疗前VSS、POSAS总评分分别为11、71分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为5、14分，DLQI评分13分，患者拒绝激光治疗，仅接受局部曲安奈德注射治疗。治疗后1个月，瘢痕疙瘩颜色加深，厚度变厚，硬度变硬，VSS总评分为12分，继续给予注射治疗。治疗后2~7个月，瘢痕疙瘩逐渐趋于平整，质地逐渐变软，颜色逐渐改善，但VSS总评分均>5分，在此期间继续每个月给予1次曲安奈德注射治疗。治疗后8、9个月未随访。治疗后10个月，瘢痕疙瘩变平整，质地软，颜色变淡，VSS总评分为5分，此时首次达到显效（累计注射7次曲安奈德）。治疗后11个月随访未治疗，至治疗后12个月，瘢痕疙瘩趋于平稳，未见复发迹象，VSS、POSAS总评分分别为5、26分，VSS、POSAS中色泽和血管分布总分分别为2、5分，DLQI评分5分；治疗后12个月内，随访10次，出现毛细血管扩张不良反应。治疗后24个月，瘢痕疙瘩突出皮面，VSS总评分为7分，再次给予曲安奈德注射治疗。之后几个月随访未治疗，至治疗后27个月，VSS总评分为4分，瘢痕疙瘩趋于平稳，未见复发迹象。见图2。
2 例2曲安奈德组患者肩背部不明原因所致瘢痕疙瘩首次治疗前后情况。2A.治疗前，瘢痕疙瘩明显高出体表，色泽较深；2B.行曲安奈德注射治疗后1个月，瘢痕疙瘩色泽加深，厚度变厚；2C.治疗后2个月，瘢痕疙瘩稍平整，颜色改善；2D.治疗后7个月，瘢痕疙瘩颜色改善；2E.治疗后10个月，瘢痕疙瘩变平整，颜色淡，达到显效3. 讨论
瘢痕疙瘩是一种纤维化疾病［14］，全球发生率为0.09%~16%［15］，其临床特征为超出原始损伤范围，突出皮肤表面，呈侵袭性生长且无自发消退性［16］。90%瘢痕疙瘩组织中存在线性并且相对平行于皮肤表面的血管结构［17］。瘢痕疙瘩组织中持续存在增多的微血管、Fb及炎症细胞［18］，且由边缘到中心区域逐渐减少，提示瘢痕疙瘩组织内持续存在炎症反应［19］。曲安奈德是目前最为常用的瘢痕疙瘩局部注射药物，其作用机制主要是干扰炎症细胞的迁移与吞噬，并通过抑制血管再形成，造成瘢痕疙瘩区域营养供给障碍［20］。Ogawa和Akaishi［19］认为，在创面愈合的炎症反应阶段，局部因素（如高张力、遗传因素等）导致血管内皮细胞功能障碍，致使血管通透性增高，进而加速炎症细胞及炎症因子聚集，最终使Fb聚集，ECM增多。因此，在瘢痕疙瘩的炎症反应期局部注射曲安奈德可有效抑制局部炎症反应，减少胶原合成及ECM沉积。但糖皮质激素产生的全身性及局部不良反应不容忽视，这也限制了其应用。
近年来，PDL越来越多地被应用于瘢痕疙瘩治疗中［5，21, 22］，其治疗瘢痕疙瘩的效果亦逐渐被认可，相关机制主要有以下几个方面：（1）PDL可被血管中血红蛋白选择性吸收，从而引起血管受热闭塞［23, 24］。（2）PDL可促使G0/G1期的细胞比例升高，抑制组织中Fb增殖，减少ECM沉积［25］；（3）PDL可降低TGF-β1分泌量，增加TGF-β3分泌量，进而抑制胶原生成［26, 27］。PDL治疗瘢痕疙瘩不仅效果显著，且能有效减少激素注射后的不良反应［5］。因局部激素注射后，组织内压增加，毛细血管不充盈，无法特异性吸收激光能量，因此有学者研究提出PDL治疗后联合曲安奈德注射治疗的模式［28］。Blanco de Tord等［21］治疗1例难治性耳郭瘢痕疙瘩患者时，应用PDL治疗后局部注射0.5 mL曲安奈德，6个月后疗效显著且未见复发。本研究中，根据首次显效时间及达到首次显效时曲安奈德累计注射次数的对比分析可见，相对于单纯曲安奈德治疗，PDL动态联合曲安奈德治疗可缩短瘢痕疙瘩治疗时间，减少激素注射次数。VSS、POSAS中色泽和血管分布总分统计结果显示，动态治疗优于单纯曲安奈德治疗，提示PDL可能是通过对局部血管的治疗作用而提高瘢痕疙瘩的临床疗效的。这与Khattab等［22］的研究结果一致，其研究结果表明，PDL联合局部注射维拉帕米较单独注射维拉帕米治疗瘢痕疙瘩，可显著减少局部血管分布。
瘢痕的发生发展是一个渐进和长期的病理过程，需要对其进行持续、充分的治疗。易复发性是瘢痕疙瘩的特点，瘢痕疙瘩的综合动态治疗是目前的趋势，而定期随访、动态评估、及时干预是综合动态治疗的核心［9］。本研究中采用动态治疗模式，根据VSS评估结果及瘢痕疙瘩临床症状制订不同的随访及治疗计划。与传统PDL+曲安奈德联合治疗模式［21，29］相比，本研究中的动态治疗模式根据患者实际病情，决定其治疗内容，避免了因不恰当时机的激光照射刺激而加重临床症状的发生。Muneuchi等［30］采用曲安奈德注射治疗94例瘢痕疙瘩患者，治疗间隔≥4周，结果显示31例患者在10次注射治疗内放弃治疗，原因是患者难以忍受注射时的疼痛，以及在短期内没有看到明显疗效。本研究结果显示，接受动态治疗的患者依从性高于仅接受曲安奈德注射治疗的患者；且本课题组临床研究显示仅接受曲安奈德注射治疗患者的放弃治疗率为43.75%（14/32），高于动态治疗组的20.00%（4/20），另文发表。这可能与接受动态治疗的患者曲安奈德注射次数减少从而减轻了注射痛苦，短时间治疗有明显的症状改善增加了患者信心，使得患者更易接受治疗有关。患者依从性提高可使随访率增高，便于及时评估病情选择适当治疗方式，进一步提高患者临床疗效，从而达到良性循环。本研究结果提示了PDL动态联合曲安奈德注射治疗在综合性动态治疗中的优势。
本研究纳入的瘢痕疙瘩患者在接受不同方式治疗后，均未出现全身性不良反应如皮质醇增多症等。动态治疗组患者的5种不良反应、总不良反应发生率低于曲安奈德组，其原因可能与接受动态治疗的患者曲安奈德注射次数减少、曲安奈德注射总量减少有关。动态治疗组患者瘢痕疙瘩毛细血管扩张的发生率亦低于曲安奈德组，且此并发症可通过PDL治疗得以改善，提示了PDL动态联合曲安奈德治疗的优势。然而该不良反应结果缺乏统计学意义，可能与本研究样本量较少有关，尚需进一步研究验证。
综上所述，与单纯曲安奈德注射治疗比较，PDL动态联合曲安奈德治疗瘢痕疙瘩可减少曲安奈德注射次数，缩短疗程，提高患者依从性，进而提高瘢痕疙瘩治疗效果。然而本研究是基于现有样本量的回顾性研究，样本量较少，结果存在一定的局限性，且动态治疗中2种疗法如何相互作用尚不明确，还需要进一步研究。未来，本研究团队拟加大样本量并且以更加客观的指标对疗效进行评价，以提高研究结果的准确性。
罗锦花：直接参与酝酿和设计实验、实施研究、分析数据、起草文章；詹剑华：酝酿和设计实验，行政、技术或材料支持，指导实验；廖文强：参与文章的数据采集、分析、解释及文章的撰写；程兴：参与文章的数据分析及解释；黄凯：支持性贡献所有作者均声明不存在利益冲突患者烧伤后，具有较高的死亡风险。烧伤后机体的免疫和炎症反应模式是否与患者预后相关，尚不清楚。该研究的目的是探讨重症烧伤患者的全身免疫和炎症反应与预后之间的关系。选取重度烧伤患者为研究对象，在入院即刻及第2、7、14和28天收集血液标本，通过流式细胞术进行细胞计数和细胞因子分析。结果显示，烧伤患者入院时外周血中恒定自然杀伤T细胞（iNKT）、γδT细胞和黏膜相关恒定T细胞的数量明显下降，这些细胞发挥着对抗抗原应激和维持内环境稳态的重要作用。同时，单核细胞表达人类白细胞抗原DR（HLA-DR）、自然杀伤（NK）细胞表达NKG2D受体和中性粒细胞表达CD16的水平均显著降低。入院时，外周血中CD8 T细胞、γδT细胞、B细胞和iNKT计数较低的患者更易发生细菌感染，而HLA-DR/单核细胞的延迟恢复和晚期细胞因子分泌失调则与脓毒症休克的发生有关。患者早期（第1周）的免疫反应模式与90 d内病死率没有显著相关性；然而延迟、持续的细胞因子谱改变和后期低HLA-DR/单核细胞水平在死亡患者中更加明显。刘双庆，编译自《Front Immunol》,2021,12:586195；姚咏明，审校 -
参考文献
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1 3组兔分组处理第7天的回肠黏膜菌群在属分类水平的构成差异
注：烫伤+中剂量组兔烫伤后，给予终质量浓度1.0 g/mL加味四君子汤灌胃；A1、A2、A3为正常对照组3只兔样本，B1、B2、B3为单纯烫伤组3只兔样本，C1、C2、C3为烫伤+中剂量组3只兔样本
2 3组兔分组处理第7天的回肠黏膜中菌群等级丰度曲线
注：烫伤+中剂量组兔烫伤后，给予终质量浓度1.0 g/mL加味四君子汤灌胃；图中纵坐标为经过log2处理的数据；A1、A2、A3为正常对照组3只兔样本，B1、B2、B3为单纯烫伤组3只兔样本，C1、C2、C3为烫伤+中剂量组3只兔样本
3 3组兔分组处理第7天的回肠黏膜菌群β多样性分析
注：烫伤+中剂量组兔烫伤后，给予终质量浓度1.0 g/mL加味四君子汤灌胃；A1、A2、A3为正常对照组3只兔样本，B1、B2、B3为单纯烫伤组3只兔样本，C1、C2、C3为烫伤+中剂量组3只兔样本；主坐标成分表示菌群分布距离相对集中结果的解释度
表1 5组兔分组处理第1、3、7天回肠黏膜组织的炎症水平（pg/mL，
组别 兔数（只） 第1天 第3天 第7天 TNF‐α IL‐1β IL‐10 TNF‐α IL‐1β IL‐10 TNF‐α IL‐1β IL‐10 正常对照组 18 108.2±13.2 13.24±0.10 923±4 128.8±3.6f 11.37±0.72 909±17 114.2±1.9j 12.10±1.51 937±16k 单纯烫伤组 18 254.1±26.3a 33.41±1.96a 638±28a 321.5±15.8ag 42.91±2.74ag 602±80a 344.7±10.5agk 53.25±2.45agj 447±30agj 烫伤+低剂量组 18 256.0±28.7a 31.55±2.93a 660±27a 260.4±10.7ab 30.64±3.99ab 658±13a 242.6±11.8abk 34.72±2.29ab 696±26abgj 烫伤+中剂量组 18 187.4±17.9abc 26.26±2.08abc 774±38abc 174.3±19.9abc 20.53±6.78abh 816±27abci 130.8±40.0bcfk 16.14±2.18abcgk 843±28abcgk 烫伤+高剂量组 18 240.7±18.0ad 30.05±12.02e 663±27ad 209.8±11.6abcdf 26.51±1.61abh 692±38adi 201.0±12.4abcdgk 23.76±0.53abcgj 749±33abdghk F值 152.84 36.38 341.86 555.94 171.24 153.22 387.98 1325.73 833.79 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组兔烫伤后，分别给予等体积终质量浓度0.2 g/mL、1.0 g/mL、5.0 g/mL加味四君子汤灌胃；TNF为肿瘤坏死因子，IL为白细胞介素；各组各时间点的样本数均为6；TNF-α处理因素主效应，F=716.67，P<0.001；时间因素主效应，F=17.42，P<0.001；两者交互作用，F=21.16，P<0.001；IL-1β处理因素主效应，F=349.68，P<0.001；时间因素主效应，F=8.19，P<0.001；两者交互作用，F=15.97，P<0.001；IL-10处理因素主效应，F=819.03，P<0.001；时间因素主效应F=0.58，P=0.560；两者交互作用，F=21.82，P<0.001；与正常对照组相比，aP<0.01、eP<0.05；与单纯烫伤组相比，bP<0.01、iP<0.05；与烫伤+低剂量组相比，cP<0.01、hP<0.05；与烫伤+中剂量组相比，dP<0.01；与组内第1天相比，fP<0.05、gP<0.01；与组内第3天相比，jP<0.01、kP<0.05 
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表2 3组兔分组处理第7天的回肠黏膜中菌群α多样性分析（
组别 兔数（只） Ace指数 Chao1指数 Simpson指数 Shannon指数 正常对照组 3 2 536 ± 2 396 ± 0.991± 9.78± 661 518 0.011 0.22 单纯烫伤组 3 2 205 ± 2 040 ± 0.923± 8.26± 532 519 0.140 2.38 烫伤+中剂量组 3 2 490 ± 2 303 ± 0.992± 9.69± 169 142 0.012 0.23 F值 0.78 1.10 1.48 2.27 P值 0.478 0.359 0.258 0.138 注：烫伤+中剂量组兔烫伤后，给予终质量浓度1.0 g/mL加味四君子汤灌胃
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