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基于16S核糖体RNA高通量测序探讨加味四君子汤对严重烫伤兔肠道菌群多样性的影响

罗锦花 詹剑华 廖文强 程兴 黄凯

黎宁, 付青青, 罗月, 等. 基于个案管理模式的康复护理决策方案在严重烧伤患者中的应用效果[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(1): 78-86. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20230905-00078.
引用本文: 罗锦花, 詹剑华, 廖文强, 等. 基于16S核糖体RNA高通量测序探讨加味四君子汤对严重烫伤兔肠道菌群多样性的影响[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(3): 227-235. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200923-00421.
Li N,Fu QQ,Luo Y,et al.Application effects of rehabilitation care decision-making scheme based on case management model in severe burn patients[J].Chin J Burns Wounds,2024,40(1):78-86.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20230905-00078.
Citation: Luo JH,Zhan JH,Liao WQ,et al.Investigating the effects of Modified Sijunzi Decoction on the diversity of intestinal microflora of severe scald rabbits based on 16S ribosomal RNA high-throughput sequencing[J].Chin J Burns Wounds,2022,38(3):227-235.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20200923-00421.

基于16S核糖体RNA高通量测序探讨加味四君子汤对严重烫伤兔肠道菌群多样性的影响

doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20200923-00421
基金项目: 

江西省科技计划 20171BBG70061, 2020BBG73020

详细信息
    通讯作者:

    詹剑华,Email:zjhseasky@163.com

Investigating the effects of Modified Sijunzi Decoction on the diversity of intestinal microflora of severe scald rabbits based on 16S ribosomal RNA high-throughput sequencing

Funds: 

Science and Technology Program of Jiangxi Province of China 20171BBG70061, 2020BBG73020

More Information
    Corresponding author: Zhan Jianhua, Email: zjhseasky@163.com
  • 摘要:     目的   基于16S核糖体RNA(16S rRNA)高通量测序,探讨加味四君子汤对严重烫伤兔肠道菌群多样性的影响。    方法   采用实验研究方法。选取90只6~8个月龄雌雄不限日本大耳兔,按照随机数字表法分为正常对照组、单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组,每组18只。正常对照组兔自由饮食、饮水,单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组兔制作30%体表总面积Ⅲ度烫伤模型后分别给予生理盐水、0.2 g/mL加味四君子汤、1.0 g/mL加味四君子汤、5.0 g/mL加味四君子汤灌胃,持续给药7 d。于分组处理第1、3、7天,采用酶联免疫吸附测定法检测各组兔回肠黏膜组织中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-10水平,各组每个时间点的样本数为6。根据前述实验结果,另外选取9只兔分为正常对照组、单纯烫伤组、烫伤+中剂量组,每组3只,各组兔分组及处理方法同前。于分组处理第7天,采用高通量测序技术对3组兔回肠黏膜菌群的16S rRNA V3、V4区进行测序;采用QIIME软件统计菌群优质序列数目;使用RDP Classifier软件分析菌群的门、纲、目、科、属水平;采用Illumina MiSeq测序技术对菌群行α多样性(Ace、Chao1、Simpson、Shannon指数)和β多样性分析。对数据行析因设计方差分析、SNK检验及Bonferroni校正。    结果   与正常对照组相比,单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+中剂量组分组处理第1、3天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显升高(P<0.01),单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显升高(P<0.05或P<0.01),单纯烫伤组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均显著降低(P<0.01)。与单纯烫伤组相比,烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第3、7天及烫伤+中剂量组分组处理第1天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低(P<0.01),烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第3、7天及烫伤+中剂量组分组处理第1天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显降低(P<0.01),烫伤+低剂量组分组处理第7天和烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天以及烫伤+高剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。与烫伤+低剂量组相比,烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+高剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低(P<0.01),烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+高剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),烫伤+中剂量组分组处理第1、3、7天和烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)。与烫伤+中剂量组相比,烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显升高(P<0.01),烫伤+高剂量组分组处理第1、3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均明显降低(P<0.01),烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均显著降低(P<0.01)。与第1天比较,单纯烫伤组分组处理第3、7天以及正常对照组分组处理第3天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显升高(P<0.05或P<0.01),单纯烫伤组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显升高(P<0.01),烫伤+低剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第7天和烫伤中剂量组分组处理第3、7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均明显升高(P<0.05或P<0.01);烫伤+高剂量组分组处理第3、7天及烫伤+中剂量组分组处理第7天的兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),烫伤+中剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平明显降低(P<0.01),单纯烫伤组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平明显降低(P<0.01)。与第3天比较,单纯烫伤组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α、IL-1β水平及正常对照组、烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组和烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平均明显升高(P<0.05或P<0.01),烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的TNF-α水平均明显降低(P<0.05),烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-1β水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),单纯烫伤组分组处理第7天兔回肠黏膜组织中的IL-10水平明显降低(P<0.01)。分组处理第7天,正常对照组、单纯烫伤组、烫伤+中剂量组兔回肠黏膜中的菌群分别获96 023、107 365、95 921条优质序列。3组兔回肠黏膜中的菌群在门、纲、目、科、属的分类水平上均分别以拟杆菌门和厚壁菌门、梭菌纲和拟杆菌纲、梭菌目和拟杆菌目、瘤胃菌科和梭菌科及拟杆菌科、梭菌属和拟杆菌属及瘤胃菌属菌群为主,但各组菌群组成不同。3组兔回肠黏膜中菌群的Ace、Chao1、Simpson、Shannon指数均没有显著差异(P>0.05),β多样性无明显差异。    结论   严重烫伤后兔回肠黏膜炎症反应明显,并呈时间依赖性增加。加味四君子汤可减轻炎症反应,其治疗效果最佳质量浓度为1.0 g/mL。高通量测序法能够精准地反映肠道菌群的结构组成,加味四君子汤对严重烫伤后肠道菌群具有一定的调节作用。

     

  • (1)利用单细胞转录组测序技术检测到糖尿病足创缘皮肤组织成纤维细胞(Fb)中的趋化因子配体和角质形成细胞(KC)中的趋化因子受体相互作用明显减弱,这可能是糖尿病足创面愈合障碍的重要机制。

    (2)证实高糖抑制人皮肤Fb分泌CXC趋化因子配体12(CXCL12),高糖人皮肤Fb培养上清液刺激导致人皮肤KC迁移能力减弱及KC中CXC趋化因子受体4(CXCR4)表达水平降低。

    (3)外源性重组人CXCL12可通过上调CXCR4表达,增强人皮肤KC的迁移能力。

    Highlights:

    (1)Single-cell transcriptome sequencing detected that the interaction between chemokine ligands of fibroblasts (Fb) and chemokine receptors of keratinocytes (KC) was significantly decreased in the wound edge skin tissue of diabetic foot, which may be an important mechanism in the impairment of wound healing of diabetic foot.

    (2)It was proved that high glucose inhibited human skin Fb to secret the C-X-C motif chemokine ligand 12 (CXCL12). Stimulated by human skin Fb culture supernatant of high glucose, the migration ability of human skin KC weakened, and the expression level of C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4) decreased.

    (3)Exogenous recombinant human CXCL12 could enhance the migration ability of human skin KC by up-regulating CXCR4 expression.

    糖尿病足是非创伤性下肢截肢的主要原因[1]。据报道,全世界每年因糖尿病足溃疡导致不同程度截肢的人群超过100万[2]。在中国,因糖尿病足进行大截肢或小截肢的患者在手术后5年的病死率接近 40%,因此糖尿病足是一个严重的公共卫生问题[3, 4]。阐明糖尿病足创面愈合障碍的潜在机制具有重要意义[5]

    创面愈合是一个复杂的生物学过程[6, 7]。皮肤损伤后,创面愈合过程启动,通过募集免疫细胞、Fb、KC及间充质细胞,共同调控创面愈合过程[8, 9]。创面微环境由不同类型的细胞组成,各种类型细胞要在创面愈合过程中表现出适当的作用,必须进行细胞间通讯[10, 11, 12]。本课题组前期单细胞转录组测序结果显示,糖尿病足创缘皮肤组织中的Fb与KC间通讯明显减弱,但其具体机制尚未被阐明。因此,本研究进一步对上述2种细胞间的相互作用进行分析,观察高糖微环境下人包皮Fb(human foreskin fibroblast,HFF)培养上清液作为条件培养基(conditioned medium,CM)对HaCaT细胞迁移的影响,并初步探究可能的作用机制,以期为糖尿病足创面的临床治疗提供新的思路及理论依据。

    本实验研究经华中科技大学同济医学院附属梨园医院医学伦理委员会批准,批号:[2020]IEC(SQ09)。

    人KC细胞株HaCaT、HFF细胞株由中国科学院上海细胞库提供。DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司,兔抗人GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、PCR引物、实时荧光定量RT-PCR试剂盒、化学发光检测试剂盒、蛋白定量测定试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司,重组人CXC趋化因子配体12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)蛋白、兔抗人CXC趋化因子受体4( C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)单克隆抗体购自英国Abcam公司。Multiskan FC型多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher公司,ChemiDoc XRS型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司,IX71型倒置相差显微镜购自日本Olympus公司。

    取华中科技大学同济医学院附属梨园医院创面修复科2021年8月收治的1例2型糖尿病患者(男,33岁)糖尿病足创缘皮肤组织和该院手外科2021年9月收治的1例足背部外伤患者(男,50岁)创缘皮肤组织,由南京新格元生物科技有限公司进行组织解离、单细胞悬液制备、文库构建、单细胞转录组测序。使用 CellphoneDB v2.1.0软件分析Fb亚群中趋化因子配体与KC亚群中趋化因子受体的相互作用。

    将1×106个HaCaT细胞接种至含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素混合液的DMEM培养基(以下称DMEM完全培养基)的培养瓶(底面积为25 cm2,下同)中,将1×106个HFF接种至含体积分数10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素混合液的DMEM/F12培养基(以下称DMEM/F12完全培养基)的培养瓶中,于37 ℃、含体积分数15%二氧化碳的细胞培养箱中培养(培养条件下同)。

    将1×106个HFF接种至装有含30 mmol/L D-葡萄糖的DMEM/F12完全培养基的培养瓶中培养7 d[13, 14],以1 000×g离心5 min收集细胞培养上清液,作为高糖CM。将1×106个HFF接种至仅含DMEM/F12完全培养基的培养瓶中培养7 d后,以1 000×g离心5 min收集细胞培养上清液,作为正常CM。用孔径0.2 μm的过滤器过滤2种CM后,将其置于-80 ℃冰箱中备用。

    取HaCaT细胞,用DMEM完全培养基调整细胞浓度为1×105个/mL后,接种于6孔板中,每孔2 mL。待细胞生长达90%以上融合时,用规格为200 μL的移液器枪头和直尺在HaCaT单细胞层上划1条直线。将细胞分为正常CM组和高糖CM组,每组3孔,吸弃原有培养基,加入PBS冲洗2遍,正常CM组每孔细胞加入2 mL正常CM,高糖CM组每孔细胞加入2 mL高糖CM。划痕后0(即刻)、24、48 h在倒置相差显微镜200倍放大倍数下观察细胞划痕愈合情况并计算划痕后24、48 h细胞迁移率。细胞迁移率=(划痕后0 h划痕面积-划痕后其他时间点划痕面积)÷划痕后0 h划痕面积×100%。本实验样本数为3。

    取正常CM和高糖CM,用人48因子液相悬浮芯片(美国Bio-Rad公司)和Bio-Plex 200系统(美国Luminex公司)检测细胞因子含量。读取仪器上表示2种CM中细胞因子含量的数值,对数据进行Zscore校正(均值为0、方差为1),使用热图展示2种CM中的细胞因子表达差异。此部分实验委托上海华盈生物医药科技有限公司完成。本实验样本数为5。

    将HFF接种到6孔板中,每孔1×105个细胞,分为高糖组和正常组,每组3孔,同1.4用含高浓度葡萄糖和不含葡萄糖的DMEM/F12完全培养基培养7 d。按照TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA,将RNA反转录为互补DNA。采用实时荧光定量RT-PCR法检测CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL12的mRNA表达,引物序列及产物大小见表1。以β肌动蛋白为内参照,基于Δ循环阈值计算mRNA的相对表达量。本实验样本数为6。

    表1 采用实时荧光定量反转录PCR法检测HFF中趋化因子配体mRNA表达的引物序列及产物大小

    Table 1 The primer sequences and product sizes of chemokine ligand mRNA expression in HFF

    detected by real-time fluorescence

    quantitative reverse transcription

    polymerase chain reaction

    引物名称引物序列(5'→3')产物大小(bp)
    CXCL1上游:GGGAATTCACCCCAAGAACATC121
    下游:GGATGCAGGATTGAGGCAAGC
    CXCL2上游:CAAACCGAAGTCATAGCCACA157
    下游:TCCTTCAGGAACAGCCACCA
    CXCL8上游:CATACTCCAAACCTTTCCACCC164
    下游:CATACTCCAAACCTTTCCACCC
    CXCL12上游:TGAGCTACAGATGCCCATGC103
    下游:ACAATCTGAAGGGCACAGTTTG
    β肌动蛋白上游:CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT317
    下游:CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC
    注:HFF为人包皮成纤维细胞,CXCL为CXC趋化因子配体
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    同1.5取HaCaT细胞分组及培养48 h,提取细胞总蛋白,采用蛋白质印迹法检测CXCR4的蛋白表达。一抗为兔抗人CXCR4单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体(稀释比均为1∶1 000),二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体(稀释比为1∶2 000)。使用Image J 1.48V图像分析软件(美国国立卫生研究院)分析条带灰度值。以GAPDH为内参照,计算CXCR4的蛋白表达量。本实验样本数为3。

    将HaCaT细胞接种到6孔板中,每孔1×105个细胞,分为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组、高糖CM+CXCL12组,每组3孔。正常CM组、高糖CM组细胞同1.5相同组别进行处理,正常CM+CXCL12组每孔细胞加入2 mL含100 ng/mL 重组人CXCL12的正常CM,高糖CM+CXCL12组每孔细胞加入2 mL含100 ng/mL 重组人CXCL12的高糖CM。同1.5检测细胞迁移情况,同1.8检测细胞中CXCR4的蛋白表达情况,2个实验样本数均为3。

    采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布,以x¯±s表示。单一时间点多组间总体比较行单因素方差分析,多个时间点多组间总体比较行重复测量方差分析,2组间比较行独立样本t检验,多组间两两比较行LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

    与急性足外伤创缘皮肤组织比较,糖尿病足创缘皮肤组织Fb亚群中的趋化因子配体(CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8)和KC亚群中的趋化因子受体CXCR2间、Fb亚群中的趋化因子配体CXCL12和KC亚群中的趋化因子受体CXCR4间的相互作用明显减弱。见图1

    图  1  基于单细胞转录组测序分析急性足外伤患者创缘皮肤组织和糖尿病足患者创缘皮肤组织Fb亚群中趋化因子配体与KC亚群中趋化因子受体的相互作用
    注:图中最左侧字母A表示急性足外伤创缘皮肤组织,D表示糖尿病足创缘皮肤组织;CXCL为CXC趋化因子配体,CXCR为CXC趋化因子受体,ACKR3为非典型趋化因子受体3,Fb为成纤维细胞,KC为角质形成细胞;从左至右各列依次为Fb亚群1与Fb亚群5、Fb亚群1与KC亚群2、Fb亚群1与KC亚群4、Fb亚群1与KC亚群6、Fb亚群2与Fb亚群5、Fb亚群2与KC亚群2、Fb亚群2与KC亚群4、Fb亚群2与KC亚群6、Fb亚群3与Fb亚群1、Fb亚群3与Fb亚群3、Fb亚群3与Fb亚群5、Fb亚群3与Fb亚群6、Fb亚群3与KC亚群2、Fb亚群3与KC亚群4、Fb亚群3与KC亚群6、Fb亚群4与Fb亚群5、Fb亚群4与KC亚群2、Fb亚群4与KC亚群4、Fb亚群4与KC亚群6、Fb亚群5与Fb亚群5、Fb亚群5与KC亚群2、Fb亚群5与KC亚群4、Fb亚群5与KC亚群6、Fb亚群6与Fb亚群5、Fb亚群6与KC亚群2、Fb亚群6与KC亚群4、Fb亚群6与KC亚群6

    划痕后24、48 h,与正常CM组比较,高糖CM组HaCaT细胞迁移率均明显降低(P<0.05)。见图2表2

    图  2  2组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移情况 倒置相差显微镜×200。2A、2B、2C.分别为正常CM组细胞划痕后0(即刻)、24、48 h的划痕面积,划痕面积逐渐变小;2D、2E、2F.分别为高糖CM组细胞划痕后0、24、48 h的划痕面积,图2E和2F剩余划痕面积分别较图2B和2C明显增大
    注:CM为条件培养基;用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞
    Table  2.  2组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移率比较(%,x¯±s
    组别样本数24 h48 h
    正常CM组354.06±1.9582.66±2.75
    高糖CM组317.53±1.8547.72±2.71
    t23.5015.65
    P<0.001<0.001
    注:CM为条件培养基;用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞;时间因素主效应,F=4 592.04,P<0.001;处理因素主效应,F=363.46,P<0.001;两者交互作用,F=3.36,P=0.140
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    正常CM和高糖CM中共检出28个细胞因子。与正常CM比较,高糖CM中的CXCL1含量明显增多(P=0.015),CXCL2含量增多(P=0.510),CXCL8含量减少(P=0.597),CXCL12含量明显减少(P<0.001)。正常CM和高糖CM中均未检出CXCL3。见图3

    图  3  采用液相悬浮芯片检测常规培养人包皮成纤维细胞7 d的上清液(即正常CM)和用高浓度葡萄糖培养人包皮成纤维细胞 7 d的上清液(即高糖CM)中细胞因子含量
    注:第1~5列为正常CM,第6~10列为高糖CM;CM为条件培养基,IL为白细胞介素,CXCL为CXC趋化因子配体,CCL为CC趋化因子配体,TNF为肿瘤坏死因子,GM-CSF为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

    培养7 d,高糖组HFF中CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA表达分别为1.54±0.16、1.51±0.16、1.70±0.08,分别明显高于正常组的0.94±0.19、1.04±0.05、1.00±0.09(t值分别为4.25、4.98、10.04,P值分别为0.009、0.013、0.001)。培养7 d,高糖组HFF中CXCL12的mRNA表达为0.80±0.06,明显低于正常组的1.07±0.10(t=4.10,P=0.015)。

    培养48 h,正常CM组HaCaT细胞中CXCR4的蛋白表达为0.481±0.059,明显高于高糖CM组的0.267±0.006(t=5.13,P=0.007)。见图4

    图  4  蛋白质印迹法检测的2组HaCaT细胞培养48 h的CXCR4的蛋白表达
    注:用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞;CM为条件培养基,CXCR4为CXC趋化因子受体4,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条带图上方1和2分别表示正常CM组和高糖CM组

    划痕后24、48 h,高糖CM组HaCaT细胞迁移率较正常CM组和高糖CM+CXCL12组明显降低(P值均<0.05)。划痕后24 h,正常CM+CXCL12组HaCaT细胞迁移率较正常CM组明显降低(P<0.05);划痕后48 h,正常CM+CXCL12组HaCaT细胞迁移率较高糖CM+CXCL12组明显升高(P<0.05)。见图5表3

    图  5  4组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移情况 倒置相差显微镜×200。5A、5B、5C、5D.分别为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组划痕后0(即刻)h划痕面积;5E、5F、5G、5H.分别为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组划痕后24 h划痕面积,图5E剩余划痕面积最小,图5E、5F、5H剩余划痕面积小于图5G;5I、5J、5K、5L.分别为正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组划痕后48 h划痕面积,图5I、5J中基本未见划痕,图5K剩余划痕面积明显大于图5L
    注:用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞,分别在正常CM组和高糖CM组处理的基础上用重组人CXCL12处理正常CM+CXCL12组和高糖CM+CXCL12组细胞;CM为条件培养基,CXCL12为CXC趋化因子配体12
    Table  3.  4组HaCaT细胞划痕后各时间点迁移率比较(%,x¯±s
    组别样本数24 h48 h
    高糖CM组316.27±1.1026.33±3.02
    正常CM组355.95±5.73100
    高糖CM+CXCL12组342.05±0.5586.65±0.24
    正常CM+CXCL12组341.49±3.23100
    F73.221 622.80
    P<0.001<0.001
    P1<0.001<0.001
    P2<0.001<0.001
    P30.004>0.999
    P4>0.999<0.001
    注:用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞,分别在正常CM组和高糖CM组处理的基础上用重组人CXCL12处理正常CM+CXCL12组、高糖CM+CXCL12组细胞;CM为条件培养基,CXCL12为CXC趋化因子配体12;时间因素主效应,F=1 242.82,P<0.001;处理因素主效应,F=646.70,P<0.001;两者交互作用,F=85.46,P<0.001;F值、P值为组间各时间点总体比较所得;P1值、P2值分别为高糖CM组与正常CM组、高糖CM+CXCL12组比较所得,P3值、P4值分别为正常CM+CXCL12组与正常CM组、高糖CM+CXCL12组比较所得
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    培养48 h,正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达分别为0.509±0.055、0.522±0.082、0.247±0.010和0.446±0.050,组间总体比较,差异有统计学意义(F=15.82,P=0.001)。与正常CM组比较,高糖CM组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达明显减少(P<0.001),正常CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达无明显变化(P=0.784);与高糖CM组比较,高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达明显增加(P=0.002);正常CM+CXCL12组与高糖CM+CXCL12组HaCaT细胞中CXCR4蛋白表达相近(P=0.133)。见图6

    图  6  蛋白质印迹法检测的4组HaCaT细胞培养48 h的CXCR4的蛋白表达
    注:用常规培养人包皮成纤维细胞的上清液培养正常CM组细胞,用高浓度葡萄糖培养的人包皮成纤维细胞的上清液培养高糖CM组细胞,分别在正常CM组和高糖CM组处理的基础上用重组人CXCL12处理正常CM+CXCL12组、高糖CM+CXCL12组细胞;CM为条件培养基,CXCL12为CXC趋化因子配体12,CXCR4为CXC趋化因子受体4,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条带图上方1、2、3、4分别表示正常CM组、正常CM+CXCL12组、高糖CM组和高糖CM+CXCL12组

    Fb能够通过自分泌或旁分泌方式释放信号分子(细胞因子和生长因子等)感知和应答组织损伤[15, 16],与创面愈合中的KC、血管内皮细胞、巨噬细胞之间形成连接网[17, 18, 19],在创面愈合的4个阶段(炎症反应期、肉芽组织形成期、再上皮化期和重塑期)中发挥重要调控作用[20, 21]。深入阐明细胞间通讯机制对创面修复策略研究具有重要的理论指导意义。再上皮化是创面愈合过程中的重要环节[22, 23],受KC迁移和增殖的调控。相关研究主要探讨了糖尿病高糖微环境下KC功能障碍的作用机制[24],而对KC与其他细胞间的相互调控机制探索较少。

    随着测序技术不断发展,单细胞转录组测序不仅能鉴定出组织细胞异质性、推测细胞分化轨迹,还能进一步分析细胞与细胞间的相互作用[25, 26, 27, 28]。本研究对细胞中的趋化因子受体和趋化因子配体间的相互作用进行了进一步分析,结果显示与急性足外伤患者创缘皮肤组织比较,糖尿病足患者创缘皮肤组织Fb亚群中的趋化因子配体(CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8和CXCL12)和KC亚群中的趋化因子受体(CXCR2和CXCR4)的相互作用明显减弱。研究表明,CXCR2拮抗剂可以通过减轻炎症反应,促进再上皮化,有效促进糖尿病小鼠创面愈合[29]。CXCR4激动剂UCUF-728可以加速糖尿病小鼠创面愈合,使创面愈合时间较未采用CXCR4激动剂治疗的糖尿病小鼠缩短了36%[30]。这提示,CXCR2与CXCR4在创面愈合中发挥重要调节作用[31, 32],靶向抑制CXCR2或激活CXCR4可有效加速糖尿病创面愈合。因此,揭示CXC类趋化因子及其受体在糖尿病创面愈合中的作用机制具有重要的科学意义,可为探究新的糖尿病创面治疗靶点提供方向。

    本研究用高浓度葡萄糖培养HFF,收集细胞培养上清液作为高糖CM;同时常规培养HFF,收集细胞培养上清液作为正常CM。用2种CM处理HaCaT细胞,结果显示高糖CM组HaCaT细胞迁移能力较正常CM组减弱。CM中某种趋化因子含量的多少与细胞分泌此趋化因子的能力相关。为进一步明确何种趋化因子抑制KC迁移,本研究团队利用液相悬浮芯片检测HFF的CM中趋化因子含量,利用实时荧光定量RT-PCR技术检测HFF中趋化因子配体的mRNA表达水平。结果显示,与正常CM比较,高糖CM中的CXCL1和CXCL2含量增多,CXCL8和CXCL12含量减少,2种CM中均未检出CXCL3;与正常组比较,高糖组HFF中CXCL12的 mRNA表达显著下调,CXCL1、CXCL2和CXCL8的mRNA表达显著上调。据报道,糖尿病小鼠创面组织中CXCL12的mRNA表达较非糖尿病小鼠创面下调[33],与本研究结果一致。本研究团队推测,高糖组HFF中CXCL12表达与分泌减少,可能是导致HaCaT细胞迁移障碍的重要原因。

    本研究利用蛋白质印迹法检测HaCaT细胞中CXCR4(CXCL12受体)蛋白表达,结果显示高糖CM组HaCaT细胞中CXCR4表达较正常CM组下降,与高糖组HFF中的CXCL12变化趋势一致。这提示,HFF分泌CXCL12能力下降可能是导致HaCaT细胞中CXCR4表达下调的原因。本研究针对高糖CM中CXCL12含量减少的情况,利用重组人CXCL12蛋白干预不同CM处理的HaCaT细胞,划痕试验结果显示,高糖CM+CXCL12组细胞迁移率较高糖CM组显著升高;蛋白质印迹法检测结果显示,高糖CM+CXCL12组细胞CXCR4蛋白表达量也较高糖CM组显著升高,提示CXCL12蛋白可能通过上调CXCR4来改善高糖CM处理的HaCaT细胞的迁移能力。文献报道,利用CXCL12拮抗剂可以明显延长糖尿病小鼠创面愈合时间,过表达CXCL12则可将创面愈合时间从55 d(未干预的糖尿病小鼠创面愈合时间)缩短至23 d[33, 34, 35],这一研究结果与本研究中外源性重组人CXCL12蛋白加速高糖CM处理的HaCaT细胞迁移的实验结果一致。

    综上,本研究证实高糖抑制HFF分泌CXCL12,高糖CM导致HaCaT细胞迁移能力减弱、细胞中CXCR4表达降低,外源性重组人CXCL12可通过上调CXCR4表达增强HaCaT细胞的迁移能力,这在一定程度上揭示了CXCL12在糖尿病创面愈合中的作用,为将其作为难愈性创面治疗靶点提供了理论依据。后续本研究团队将进一步明确CXCL1-CXCR2调控糖尿病创面愈合的机制,及CXCL1与CXCR2、CXCL12与CXCR4间的相互作用,以期为探究多种趋化因子联合治疗难愈性创面的临床方案提供更为可靠的依据。

    罗锦花:直接参与酝酿和设计实验、实施研究、分析数据、起草文章;詹剑华:酝酿和设计实验,行政、技术或材料支持,指导实验;廖文强:参与文章的数据采集、分析、解释及文章的撰写;程兴:参与文章的数据分析及解释;黄凯:支持性贡献
    所有作者均声明不存在利益冲突
    患者烧伤后,具有较高的死亡风险。烧伤后机体的免疫和炎症反应模式是否与患者预后相关,尚不清楚。该研究的目的是探讨重症烧伤患者的全身免疫和炎症反应与预后之间的关系。选取重度烧伤患者为研究对象,在入院即刻及第2、7、14和28天收集血液标本,通过流式细胞术进行细胞计数和细胞因子分析。结果显示,烧伤患者入院时外周血中恒定自然杀伤T细胞(iNKT)、γδT细胞和黏膜相关恒定T细胞的数量明显下降,这些细胞发挥着对抗抗原应激和维持内环境稳态的重要作用。同时,单核细胞表达人类白细胞抗原DR(HLA-DR)、自然杀伤(NK)细胞表达NKG2D受体和中性粒细胞表达CD16的水平均显著降低。入院时,外周血中CD8 T细胞、γδT细胞、B细胞和iNKT计数较低的患者更易发生细菌感染,而HLA-DR/单核细胞的延迟恢复和晚期细胞因子分泌失调则与脓毒症休克的发生有关。患者早期(第1周)的免疫反应模式与90 d内病死率没有显著相关性;然而延迟、持续的细胞因子谱改变和后期低HLA-DR/单核细胞水平在死亡患者中更加明显。
    刘双庆,编译自《Front Immunol》,2021,12:586195;姚咏明,审校
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  • 1  3组兔分组处理第7天的回肠黏膜菌群在属分类水平的构成差异

    注:烫伤+中剂量组兔烫伤后,给予终质量浓度1.0 g/mL加味四君子汤灌胃;A1、A2、A3为正常对照组3只兔样本,B1、B2、B3为单纯烫伤组3只兔样本,C1、C2、C3为烫伤+中剂量组3只兔样本

    2  3组兔分组处理第7天的回肠黏膜中菌群等级丰度曲线

    注:烫伤+中剂量组兔烫伤后,给予终质量浓度1.0 g/mL加味四君子汤灌胃;图中纵坐标为经过log2处理的数据;A1、A2、A3为正常对照组3只兔样本,B1、B2、B3为单纯烫伤组3只兔样本,C1、C2、C3为烫伤+中剂量组3只兔样本

    3  3组兔分组处理第7天的回肠黏膜菌群β多样性分析

    注:烫伤+中剂量组兔烫伤后,给予终质量浓度1.0 g/mL加味四君子汤灌胃;A1、A2、A3为正常对照组3只兔样本,B1、B2、B3为单纯烫伤组3只兔样本,C1、C2、C3为烫伤+中剂量组3只兔样本;主坐标成分表示菌群分布距离相对集中结果的解释度

    表1  5组兔分组处理第1、3、7天回肠黏膜组织的炎症水平(pg/mL,x¯±s

    组别兔数(只)第1天第3天第7天
    TNF‐αIL‐1βIL‐10TNF‐αIL‐1βIL‐10TNF‐αIL‐1βIL‐10
    正常对照组18108.2±13.213.24±0.10923±4128.8±3.6f11.37±0.72909±17114.2±1.9j12.10±1.51937±16k
    单纯烫伤组18254.1±26.3a33.41±1.96a638±28a321.5±15.8ag42.91±2.74ag602±80a344.7±10.5agk53.25±2.45agj447±30agj
    烫伤+低剂量组18256.0±28.7a31.55±2.93a660±27a260.4±10.7ab30.64±3.99ab658±13a242.6±11.8abk34.72±2.29ab696±26abgj
    烫伤+中剂量组18187.4±17.9abc26.26±2.08abc774±38abc174.3±19.9abc20.53±6.78abh816±27abci130.8±40.0bcfk16.14±2.18abcgk843±28abcgk
    烫伤+高剂量组18240.7±18.0ad30.05±12.02e663±27ad209.8±11.6abcdf26.51±1.61abh692±38adi201.0±12.4abcdgk23.76±0.53abcgj749±33abdghk
    F152.8436.38341.86555.94171.24153.22387.981325.73833.79
    P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001
    注:烫伤+低剂量组、烫伤+中剂量组、烫伤+高剂量组兔烫伤后,分别给予等体积终质量浓度0.2 g/mL、1.0 g/mL、5.0 g/mL加味四君子汤灌胃;TNF为肿瘤坏死因子,IL为白细胞介素;各组各时间点的样本数均为6;TNF-α处理因素主效应,F=716.67,P<0.001;时间因素主效应,F=17.42,P<0.001;两者交互作用,F=21.16,P<0.001;IL-1β处理因素主效应,F=349.68,P<0.001;时间因素主效应,F=8.19,P<0.001;两者交互作用,F=15.97,P<0.001;IL-10处理因素主效应,F=819.03,P<0.001;时间因素主效应F=0.58,P=0.560;两者交互作用,F=21.82,P<0.001;与正常对照组相比,aP<0.01、eP<0.05;与单纯烫伤组相比,bP<0.01、iP<0.05;与烫伤+低剂量组相比,cP<0.01、hP<0.05;与烫伤+中剂量组相比,dP<0.01;与组内第1天相比,fP<0.05、gP<0.01;与组内第3天相比,jP<0.01、kP<0.05
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    表2  3组兔分组处理第7天的回肠黏膜中菌群α多样性分析(x¯±s

    组别兔数(只)Ace指数Chao1指数Simpson指数Shannon指数
    正常对照组32 536±2 396±0.991±9.78±
    6615180.0110.22
    单纯烫伤组32 205±2 040±0.923±8.26±
    5325190.1402.38
    烫伤+中剂量组32 490±2 303±0.992±9.69±
    1691420.0120.23
    F0.781.101.482.27
    P0.4780.3590.2580.138
    注:烫伤+中剂量组兔烫伤后,给予终质量浓度1.0 g/mL加味四君子汤灌胃
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图(3) / 表(2)
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  • 收稿日期:  2020-09-23

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