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阿魏酸钠对人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的调控作用及其信号机制

王畅 陈炜 王宝家

王畅, 陈炜, 王宝家. 阿魏酸钠对人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的调控作用及其信号机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(5): 471-480. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20201120-00484.
引用本文: 王畅, 陈炜, 王宝家. 阿魏酸钠对人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的调控作用及其信号机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(5): 471-480. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20201120-00484.
Wang C,Chen W,Wang BJ.Regulatory effects and signaling mechanism of sodium ferulate on the proliferation and apoptosis of human skin hypertrophic scar fibroblasts[J].Chin J Burns Wounds,2022,38(5):471-480.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20201120-00484.
Citation: Wang C,Chen W,Wang BJ.Regulatory effects and signaling mechanism of sodium ferulate on the proliferation and apoptosis of human skin hypertrophic scar fibroblasts[J].Chin J Burns Wounds,2022,38(5):471-480.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20201120-00484.

阿魏酸钠对人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞增殖和凋亡的调控作用及其信号机制

doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20201120-00484
基金项目: 

四川省教育厅自然科学重点项目 18ZA0184

成都中医药大学科技发展基金 ZRQN1760

详细信息
    通讯作者:

    王宝家,Email:381697749@qq.com

Regulatory effects and signaling mechanism of sodium ferulate on the proliferation and apoptosis of human skin hypertrophic scar fibroblasts

Funds: 

Key Natural Science Project of Sichuan Provincial Department of Education 18ZA0184

Science and Technology Development Fund of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine ZRQN1760

More Information
  • 摘要:   目的  探讨阿魏酸钠对人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)增殖、凋亡的调控作用和信号机制。  方法  采用实验研究方法。取第4~6代人皮肤HSFb用于后续实验。将HSFb分别与终质量浓度1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6 mg/mL阿魏酸钠共培养48 h,采用噻唑蓝法测定细胞吸光度值并采用线性回归法分析阿魏酸钠的半数致死浓度(LC50),样本数为6。将HSFb分别与终质量浓度0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的阿魏酸钠共培养24、48、72、96 h后,采用噻唑蓝法测定细胞吸光度值并计算细胞增殖抑制率(样本数为3)。取细胞,按随机数字表法分为采用相应终质量浓度阿魏酸钠处理的0.300 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.003 mg/mL阿魏酸钠组和不进行任何处理的阴性对照组。培养72 h后,采用噻唑蓝法测定细胞吸光度值(样本数为5),采用透射电子显微镜观察细胞微观形态(样本数为3),采用原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡情况并计算凋亡指数(样本数为4),采用免疫组织化学法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达(样本数为4),采用蛋白质印迹法检测转化生长因子β1(TGF-β1)、磷酸化Smad2/3、磷酸化Smad4、磷酸化Smad7的蛋白表达(样本数为4)。对数据行单因素方差分析、Dunnett检验。  结果  阿魏酸钠的LC50为0.307 5 mg/mL。培养24~96 h,4个质量浓度阿魏酸钠处理的细胞增殖抑制率均呈先升高后降低的趋势,于培养72 h达到最高,选择72 h作为后续实验的处理时间。培养72 h后,0.003 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组细胞吸光度值分别为0.57±0.06、0.53±0.04、0.45±0.05,均明显低于阴性对照组的0.69±0.06(P<0. 01)。培养72 h后,与阴性对照组比较,用阿魏酸钠处理的3组细胞出现不同程度的核固缩或断裂、裂解,染色质丢失,胞质中可见线粒体肿胀、粗面内质网扩张,局部逐渐空泡化。培养72 h后,与阴性对照组比较,0.003 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组细胞凋亡指数均显著升高(P<0. 05或P<0. 01)。培养72 h后,与阴性对照组比较,0.300 mg/mL阿魏酸钠组细胞Bcl-2蛋白表达量明显减少(P<0. 01),0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组细胞Bax蛋白表达量均明显增加(P<0. 05),0.300 mg/mL阿魏酸钠组细胞caspase-3蛋白表达量显著增加(P<0.01)。培养72 h后,与阴性对照组比较,0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组细胞TGF-β1、磷酸化Smad2/3、磷酸化Smad4蛋白表达量均明显减少(P<0. 05或P<0. 01),0.003 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组细胞磷酸化Smad7蛋白表达量均显著增加(P<0.01)。  结论  阿魏酸钠可通过阻断TGF-β/Smad信号通路上的关键蛋白的表达,协同激活线粒体凋亡途径共同发挥抑制人皮肤HSFb增殖和促进人皮肤HSFb凋亡的作用。

     

  • 1  4个质量浓度阿魏酸钠处理人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞96 h内增殖抑制率比较(样本数为3,x¯±s

    2  4组人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养72 h后吸光度值比较(样本数为5,x¯±s

    注:横坐标下1、2、3、4分别指阴性对照组、0.003 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组;与阴性对照组比较,aP<0.01

    3  4组人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养72 h后微观形态的变化 透射电子显微镜×20 000,图中标尺为1 μm。3A.阴性对照组细胞核较大,核膜清晰完整,染色质分布较均匀,线粒体、粗面内质网等细胞器结构完整清晰;3B.0.003 mg/mL阿魏酸钠组细胞核染色质凝聚,出现线粒体轻微肿胀、粗面内质网扩展;3C.0.030 mg/mL阿魏酸钠组细胞核染色质凝聚,粗面内质网出现扩张并呈囊泡状;3D.0.300 mg/mL阿魏酸钠组细胞核染色质溶解、胞质凝聚,粗面内质网扩张、线粒体肿胀较图3B、3C更为明显,局部出现空泡化

    4  4组人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养72 h后凋亡情况 二氨基联苯胺-苏木精×200,图中标尺为100 μm。4A、4B、4C、4D.分别为阴性对照组、0.003 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组细胞凋亡情况,图4B、4C、4D凋亡细胞数均较图4A明显增加

    注:凋亡细胞核染色为不均匀浅黄色或棕黄色

    5  4组人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养72 h后凋亡指数比较(样本数为4,x¯±s

    注:横坐标下1、2、3、4分别指阴性对照组、0.003 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组;与阴性对照组比较,aP<0.05,bP<0.01

    6  4组人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养72 h后凋亡相关蛋白表达 二氨基联苯胺-苏木精×200,图中标尺为100 μm。6A、6B、6C、6D.分别为阴性对照组、0.003 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组Bcl-2蛋白表达,图6B、6C中Bcl-2蛋白表达均与图6A相近,图6D中Bcl-2蛋白表达较图6A明显减少;6E、6F、6G、6H.分别为阴性对照组、0.003 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组Bax蛋白表达,图6F中Bax蛋白表达与图6E相近,图6G、6H中Bax蛋白表达均较图6E明显增加;6I、6J、6K、6L.分别为阴性对照组、0.003 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组caspase-3蛋白表达,图6J、6K中caspase-3蛋白表达均与图6I相近,图6L中caspase-3蛋白表达较图6I明显增加

    注:细胞核染色为棕色或棕黄色示B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)阳性表达,细胞质染色为棕色或棕黄色示Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶3 (caspase-3)阳性表达

    7  蛋白质印迹法检测 4组人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养72 h后TGF-β/Smad信号通路蛋白表达

    注:TGF-β1为转化生长因子β1;条带上方的 1、2、3、4分别指阴性对照组、0.003 mg/mL阿魏酸钠组、0.030 mg/mL阿魏酸钠组、0.300 mg/mL阿魏酸钠组

    表1  4组人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养72 h后凋亡相关蛋白表达量比较(x¯±s

    组别样本数Bcl-2Baxcaspase-3
    阴性对照组40.157 1±0.002 30.214±0.0100.152 8±0.002 7
    0.003 mg/mL阿魏酸钠组40.154 2±0.002 80.214±0.0070.155 1±0.002 3
    0.030 mg/mL阿魏酸钠组40.154 8±0.002 70.230±0.006b0.159 2±0.005 8
    0.300 mg/mL阿魏酸钠组40.149 9±0.002 6a0.237±0.012b0.163 8±0.001 2a
    F5.286.807.81
    P0.0150.0060.004
    注:Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2,Bax为 Bcl-2相关X蛋白,caspase-3为胱天蛋白酶3;与阴性对照组比较, aP<0.01,bP<0.05
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    表2  4组人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养72 h后TGF-β/Smad信号通路蛋白表达比较(x¯±s

    组别样本数TGF-β1磷酸化Smad2/3磷酸化Smad4磷酸化Smad7
    阴性对照组41.001.001.001.00
    0.003 mg/mL阿魏酸钠组40.93±0.070.97±0.030.98±0.061.24±0.06b
    0.030 mg/mL阿魏酸钠组40.84±0.07a0.89±0.03b0.86±0.10a1.22±0.03b
    0.300 mg/mL阿魏酸钠组40.82±0.06b0.85±0.07b0.81±0.07a1.17±0.04b
    F8.3610.797.7434.89
    P0.0030.0010.004<0.001
    注:TGF-β1为转化生长因子β1;与阴性对照组比较,aP<0.05,bP<0.01
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    2022年1期烧伤缺血缺氧性损害与休克的防治组稿专家:申传安(已组稿完成)
    2022年2期烧伤后炎症与免疫组稿专家:孙炳伟、贺伟峰(已组稿完成)
    2022年3期烧伤感染、脓毒症组稿专家:姚咏明、袁志强(已组稿完成)
    2022年4期扩张术与瘢痕修复组稿专家:马显杰(已组稿完成)
    2022年5期烧伤后脏器功能损害组稿专家:郇京宁(已组稿完成)
    2022年6期特殊原因创面(冻伤、自身免疫病创面等)组稿专家:于家傲(已组稿完成)
    2022年7期生长因子调控创面修复组稿专家:肖健
    2022年8期烧伤营养组稿专家:韩春茂
    2022年9期瘢痕的光电治疗组稿专家:章一新
    2022年10期生物材料在创面修复中的应用组稿专家:罗高兴
    2022年11期创面修复中的细胞与干细胞治疗组稿专家:史春梦
    2022年12期烧伤康复组稿专家:谢卫国
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  • 收稿日期:  2020-11-20

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