Development of a risk assessment scale and test of its validity and reliability for venous thromboembolism in adult burn patients
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摘要:
目的 研制成年烧伤患者静脉血栓栓塞（VTE）风险评估量表并检验其信效度。 方法 采用量表研究法及多中心横断面调查法。以文献分析法和头脑风暴法结果为基础，制订专家函询问卷。对27名专家（烧伤科医师、血管外科医师、护士各9名）行2轮德尔菲法函询并分析专家可靠性，采用优序图法和专家重要性评价确定各条目的权重，形成成年烧伤患者VTE风险评估量表。采用便利抽样法，将2019年10月1日—2020年1月1日在西南医科大学附属医院、四川大学华西医院、川北医学院附属医院、南充市中心医院及宜宾市第二人民医院5所三级甲等综合医院住院的223例成年烧伤患者作为调查对象。在患者入院24 h内采用成年烧伤患者VTE风险评估量表进行首次评估，在患者病情、治疗变化时进行实时评估，结果取最高值。采用相关系数法和临界比法进行量表项目分析，采用克龙巴赫α系数检验量表的内部一致性，采用内容效度指数分析量表的内容效度，绘制受试者操作特征（ROC）曲线检验量表的预测效度。对数据行χ2检验、Pearson相关分析、独立样本t检验、Z检验。 结果 因第1轮函询中有4份问卷不合格予剔除，重新遴选4名专家进行2轮函询。27名专家年龄以41~50岁居多，绝大多数为研究生学历，均为副高级及以上专业技术职称，从事当前专业年限多在11~30年之间。通过文献分析、小组头脑风暴和2轮函询构建的量表包括3个一级条目、50个二级条目。第1轮函询的有效问卷回收率为85.2%（23/27）、专家提出意见比例为47.8%（11/23），第2轮函询的有效问卷回收率为100%（27/27），专家提出意见比例为11.1%（3/27）。专家集体权威程度均值在2轮函询中均为0.90。各条目重要性赋值均值、满分率均值、4分以上选择率均值在第1轮函询中分别为4.21、52.5%、77.2%，在第2轮函询中分别为4.28、45.2%、85.8%。各条目的变异系数均值、肯德尔和谐系数均值在第1轮函询中分别为0.21、0.30，在第2轮函询中分别为0.16、0.36。第1、2轮函询中，3个一级条目（年龄与基础疾病、烧伤伤情因素、烧伤救治因素）和总二级条目的肯德尔和谐系数检验均具有统计学意义（χ2值分别为121.46、107.09、116.00、331.97，169.97、152.12、141.54、471.70，P<0.01）。年龄与基础疾病、烧伤伤情因素、烧伤救治因素的一级条目权重分别为0.04、0.05和0.07，二级条目权重为0.71~0.99、赋值为3~6分。223例患者烧伤总面积为1%~89%体表总面积，年龄为19~96岁，风险评估得分为0~98分。9例患者有VTE形成，风险评估得分为41~90分。37个条目得分与量表总得分呈明显正相关（r值为0.14~0.61，P<0.05或P<0.01），予以保留。高分组和低分组患者有36个二级条目得分差异明显（Z值为-4.88~-2.09，t值为-11.63~-2.09，P<0.05或P<0.01），予以保留。本量表总的克龙巴赫α系数为0.88。该量表总的内容效度指数为0.95。该量表评分诊断VTE的最佳阀值为40分，此时敏感度为88.9%、特异度为87.4%、约登指数为0.87，ROC曲线下面积为0.96（95%置信区间为0.93~0.99，P<0.01）。 结论 年龄与基础疾病、烧伤伤情及烧伤救治因素是成年烧伤患者发生静脉血栓的危险因素，基于这些因素研制的成年烧伤患者VTE风险评估量表具有良好的信效度，对临床VTE风险评估具有较好的参考价值。 Abstract:Objective To develop a venous thromboembolism (VTE) risk assessment scale for adult burn patients and to test its reliability and validity. Methods The scale research method and multi-center cross-sectional survey method were used. Based on the results of literature analysis method and brain-storming method, the letter questionnaire for experts was formulated. Then 27 experts (9 doctors of burn department, 9 vascular surgeons, and 9 nurses) were performed with two rounds of correspondences by Delphi method, and the reliability of the experts was analyzed. The weight of each item was determined by optimal sequence diagram method and expert importance evaluation to form the VTE Risk Assessment Scale for Adult Burn Patients. A total of 223 adult burn inpatients, who were admitted to 5 tier Ⅲ grade A general hospitals including the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, West China Hospital of Sichuan University, the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College, Nanchong Central Hospital, and the Second People's Hospital of Yibin City from October 1st 2019 to January 1st 2020, were selected as respondents by convenience sampling method. The first assessment was performed with the VTE Risk Assessment Scale for Adult Burn Patients within 24 hours of admission of patients, and real-time assessment was performed as the patients' condition and treatment changed. The highest value was taken as the result. Correlation coefficient method and critical ratio method were used for item analysis; Cronbach's α coefficient was used to test the internal consistency of scale; content validity index was used to analyze the content validity of the scale, and receiver's operating characteristic (ROC) curve was drawn to test the predictive validity of the scale. Data were statistically analyzed with chi-square test, Pearson correlation analysis, independent sample t test, and Z test. Results As four questionnaires in the first round of correspondence were rejected as unqualified, and another 4 experts were selected for the 2 rounds of correspondence. Most of them were aged 41 to 50 years with postgraduate degrees, engaging in the current profession for 11 to 30 years, and all of them had professional titles of associate senior or above. The scale, constructed through literature analysis, group brainstorming, and two rounds of correspondence, includes 3 primary items and 50 secondary items. In the first round of correspondence, the recovery rate of valid questionnaires and the ratio with expert opinions were 85.2% (23/27) and 47.8% (11/23), respectively. In the second round of correspondence, the recovery rate of valid questionnaires and the ratio with expert opinions were 100% (27/27) and 11.1% (3/27), respectively. The average collective authority coefficients of experts were both 0.90 in the 2 rounds of correspondence. The mean values of importance assignment, full score rate, and selection rate above 4 were 4.21, 52.5%, and 77.2%, respectively, in the first round of correspondence, and 4.28, 45.2%, and 85.8%, respectively, in the second round of correspondence. The mean coefficients of variation and the mean value of Kendall's coefficient of harmony for each item were 0.21 and 0.30 in the first round of correspondence, respectively, and 0.16 and 0.36 in the second round of correspondence, respectively. In the first and second rounds of correspondence, the Kendall's coefficients of harmony of 3 primary items (age and underlying diseases, burn injury factors, and burn treatment factors) and total secondary items were statistically significant (with χ2 values of 121.46, 107.09, 116.00, 331.97, 169.97, 152.12, 141.54, and 471.70, P<0.01). The weights of primary items for age and underlying diseases, burn injury factors, and burn treatment factors were 0.04, 0.05, and 0.07, respectively. The weights of secondary items ranged from 0.71 to 0.99, with assigned values of 3 to 6. The total burn area of 223 patients ranged from 1% to 89% total body surface area, and the patients were aged from 19 to 96 years, with the risk assessment score from 0 to 98. Nine patients developed VTE, with a risk assessment score of 41 to 90. The scores of 37 items were significantly positively correlated with the total score of scale (with r values of 0.14 to 0.61, P<0.05 or P<0.01), and the items were retained. There were 36 secondary items with statistically significant differences between the patients in high-score group and low-score group (with Z values of -4.88 to -2.09, t values of -11.63 to -2.09, P<0.05 or P<0.01), and the items were retained. The total Cronbach's α coefficient of scale was 0.88. The total content validity index of scale was 0.95. The optimal threshold of the scale for the diagnosis of VTE was 40, at which the sensitivity was 88.9%, the specificity was 87.4%, the Youden index was 0.87, and the area under the ROC curve was 0.96 (with 95% confidence interval of 0.93 to 0.99, P<0.01). Conclusions The age and underlying diseases, burn injury factors, and burn treatment factors are the risk factors for VTE in adult burn patients. The VTE risk assessment scale for adult burn patients developed based on these factors has good reliability and validity, and provide good reference value for clinical VTE risk assessment. -
Key words:
- Burns /
- Venous thromboembolism /
- Risk assessment /
- Scale /
- Reliability /
- Validity
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创伤、烧伤或手术所导致的增生性瘢痕往往难以控制，可导致严重的生理和心理问题［1, 2］，但有效的预防和治疗措施仍然非常有限。皮肤Fb是创面修复的主要成分之一，其迁移和增殖等生物学行为有序而协调地进行有助于创面修复，而Fb生物学行为的异常可导致创面不愈合或者增生性瘢痕的形成。既往研究表明，在TGF-β等生长因子的刺激下，Fb被激活并过度增殖，合成并分泌胶原蛋白以致大量ECM沉积，从而促进增生性瘢痕的形成［3］。瘢痕组织中Fb异常增殖是瘢痕组织过度生长和持续存在的主要原因，而Fb运动能力的增强和排列的改变可导致挛缩畸形［4］。因此，干预Fb增殖及运动可能是寻求瘢痕治疗方法的重要途径。
组蛋白是真核细胞染色体的重要构成成分，组蛋白乙酰化是其转录后修饰的一种重要形式［5］。正常生理条件下，组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱乙酰酶（HDAC）之间的活性竞争共同调节组蛋白乙酰化，进而调控染色质重组、基因转录、细胞分裂、血管新生、细胞分化及凋亡等一系列生物学行为［6, 7, 8］。HDAC6是Ⅱ型HDAC家族成员之一，在纤维化疾病的发生发展中发挥重要作用［9, 10］，但HDAC6在皮肤Fb中的作用鲜见报道。本研究通过将HDAC6高度选择性抑制剂Tubastatin A［11］作用于人皮肤Fb，观察其对Fb增殖及运动性的影响，以探讨其作为抗瘢痕药物的可能性及作用机制。
1. 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂与仪器来源
人皮肤Fb（HSF）株购自苏州北纳生物细胞库，胎牛血清购自美国Gibco公司，DMEM培养液购自美国HyClone公司，Tubastatin A粉剂及二甲基亚砜（DMSO）购自美国Selleck公司，细胞计数试剂盒8（CCK-8）购自海门市碧云天生物技术研究所，兔抗小鼠胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）单克隆抗体及磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗小鼠GAPDH单克隆抗体购自美国Proteintech公司，HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Click-it®5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷（EdU）成像检测试剂盒及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自美国Sigma公司。
Varioskan Flash型多功能酶标仪购自美国Thermo Scientific公司，TCS-SP5型激光扫描共聚焦显微镜购自德国Leica公司，LSM510 Meta型活细胞工作站购自德国Zeiss公司，ChemiDoc XRS型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2 实验方法
1.2.1 HSF的培养及Tubastatin A工作液的配制
采用含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养液（下称完全培养液）置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳与体积分数21%氧气、湿度95%的条件下培养（下称常规培养）HSF，隔天换液1次，取对数生长期细胞用于后续的实验。采用DMSO溶解并稀释Tubastatin A粉剂，获取浓度为5 mmol/L的母液，抽滤除菌，分装后于-20 ℃储存备用。处理细胞前解冻，并用完全培养液稀释成1、5、10 μmol/L。
1.2.2 CCK-8法检测不同浓度Tubastatin A对HSF增殖的影响
取HSF，用完全培养液调整细胞浓度为7.5×104个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL。细胞贴壁后弃去原培养液，PBS冲洗3次，按照随机数字表法分为阴性对照组及1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组，每组设6个复孔，3种浓度Tubastatin A组分别加入含相应终物质的量浓度的Tubastatin A的培养液，阴性对照组加入含终体积分数0.1%DMSO的完全培养液。各组细胞常规培养24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，常规培养2 h。采用多功能酶标仪检测波长450 nm处的吸光度值，以此代表细胞增殖活力。本实验重复3次，结果取均值。
1.2.3 EdU染色法检测不同浓度Tubastatin A对HSF增殖的影响
取HSF，用完全培养液调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于细胞爬片上，同1.2.2进行细胞分组及处理，每组设3个复孔。各组细胞常规培养24 h后，加入10 μmol/L EdU工作液1 mL，37 ℃常规培养2 h，经PBS漂洗、40 g/L多聚甲醛固定、体积分数10%山羊血清室温封闭1 h后，加入DAPI 25 μL染细胞核，PBS再次漂洗后封片、630倍激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞EdU阳性染色（绿色荧光）、细胞核阳性染色（蓝色荧光）任意情况，每组选取3个视野拍照。计算EdU阳性细胞率（以此代表细胞增殖活力），EdU阳性细胞率=绿色荧光细胞数÷蓝色荧光细胞数×100%［12］。本实验重复3次，结果取均值。
1.2.4 Tubastatin A对HSF运动性的影响
采用活细胞工作站检测。取HSF，用完全培养液调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于24孔板，每孔100 μL。细胞贴壁后弃去原培养液，用PBS冲洗3次，同1.2.2进行细胞分组及处理，每组设3个复孔。各组细胞常规培养24 h后，在活细胞工作站100倍倒置相差显微镜下观察并记录3 h内细胞运动轨迹，各组细胞观察数不少于30个。用ImageJ 1.8.0图像分析软件（美国国立卫生院）分析细胞运动性，以细胞核为参照点获取细胞运动轨迹，测算细胞运动的曲线距离，计算细胞曲线运动速度［13］。细胞曲线运动速度=细胞曲线运动距离÷细胞运动时间。本实验重复3次，结果取均值。
1.2.5 Tubastatin A对HSF ERK1/2活性的调节作用
采用蛋白质印迹法检测。取HSF，用完全培养液调整细胞浓度为2×106个/mL，接种于6孔板，每孔1 mL。细胞同1.2.2进行分组及处理，每组设3个复孔。常规培养24 h后，于冰上裂解细胞，提取细胞总蛋白并定量，取20 μg蛋白样品，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜，50 g/L脱脂奶粉溶液室温封闭2 h。加入兔抗小鼠p-ERK1/2单克隆一抗（稀释比为1∶1 000）、兔抗小鼠ERK1/2单克隆一抗（稀释比为1∶1 000）、HRP标记的兔抗小鼠GAPDH单克隆一抗（稀释比为1∶5 000），4 ℃孵育过夜。次日以含吐温20的三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液洗膜3次，每次15 min，然后加入HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆二抗（稀释比为1∶5 000），室温孵育1 h。化学发光、显影，凝胶电泳仪获取图像，采用仪器自带的Quantity One软件分析目标条带，以GAPDH为内参照，对p-ERK1/2与ERK1/2的蛋白表达进行定量，并计算p-ERK1/2与ERK1/2比值，表示ERK1/2活性。将阴性对照组的p-ERK1/2与ERK1/2比值设定为1，其余各组p-ERK1/2与ERK1/2比值与阴性对照组的比值作为各组p-ERK1/2与ERK1/2比值的相对结果。本实验重复3次，结果取均值。
1.3 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行分析。所有计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 不同浓度Tubastatin A对HSF增殖的影响
2.1.1 CCK-8法
培养24 h后，阴性对照组及1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组细胞增殖活力分别为1.19±0.07、0.73±0.04、0.67±0.03、0.57±0.06，组间总体比较，差异有统计学意义（F=36.41，P<0.001）。培养24 h后，与阴性对照组比较，1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组细胞增殖活力均显著下降（P<0.001）；与1 μmol/L Tubastatin A组比较，5 μmol/L Tubastatin A组细胞增殖活力无明显变化（P=0.340），而10 μmol/L Tubastatin A组细胞增殖活力显著下降（P=0.018）；而5 μmol/L Tubastatin A组与10 μmol/L Tubastatin A组细胞增殖活力相近（P=0.129）。
2.1.2 EdU染色法
培养24 h后，与阴性对照组比较，1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组细胞EdU染色荧光强度减弱，见图1。培养24 h后，阴性对照组、1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组EdU阳性细胞率分别为1.00、0.76±0.04、0.66±0.04、0.57±0.03，组间总体比较，差异有统计学意义（F=38.83，P<0.001）。培养24 h后，与阴性对照组比较，1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组EdU阳性细胞率均显著下降（P<0.001）；与1 μmol/L Tubastatin A组比较，5 μmol/L Tubastatin A组及10 μmol/L Tubastatin A组EdU阳性细胞率显著下降（P=0.026、<0.001）； 5 μmol/L Tubastatin A组与10 μmol/L Tubastatin A组EdU阳性细胞率相近（P=0.053）。
1 EdU染色法检测阴性对照组及Tubastatin A处理3组HSF增殖活力 EdU-DAPI×630，图中标尺为25 μm。1A、1B、1C.分别为阴性对照组细胞EdU染色、细胞核染色、细胞EdU染色与细胞核染色重叠图片，细胞核完整，EdU阳性染色细胞较多；1D、1E、1F.分别为1 μmol/L Tubastatin A组细胞EdU染色、细胞核染色、细胞EdU染色与细胞核染色重叠图片，细胞核完整，EdU阳性染色细胞较阴性对照组明显减少；1G、1H、1I及1J、1K、1L.分别为5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组细胞EdU染色、细胞核染色、细胞EdU染色与细胞核染色重叠图片，EdU阳性染色细胞均较1 μmol/L Tubastatin A组减少注：HSF为人皮肤成纤维细胞，EdU为5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷，DAPI为4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；细胞EdU阳性染色为绿色，细胞核阳性染色为蓝色，绿色+蓝色双荧光染色为增殖的HSF2.2 Tubastatin A对HSF运动性的影响
2.2.1 细胞运动范围
观察3 h内，1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组细胞的运动范围与阴性对照组相比均明显缩小，并呈一定的浓度依赖性。见图2。
2 活细胞工作站观察阴性对照组及Tubastatin A处理3组人皮肤成纤维细胞3 h内的运动范围 倒置相差显微镜×100。2A.阴性对照组细胞运动范围较大；2B、2C、2D.分别为1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组细胞运动范围，均较图2A明显缩小注：细胞运动起点均为坐标（0，0），运动终点为位于4个象限中的圆点，连接两者之间的曲线为细胞运动轨迹，数据前“-”表示相应轴线上的方向2.2.2 细胞运动速度
观察3 h内，阴性对照组及1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组细胞的曲线运动速度分别为（0.780±0.028）、（0.594±0.023）、（0.469±0.028）、（0.391±0.021）μm/min，组间总体比较，差异有统计学意义（F=44.55，P<0.001）。观察3 h内，与阴性对照组比较，1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组细胞曲线运动速度均显著下降（P<0.001）；与1 μmol/L Tubastatin A组比较，5 μmol/L Tubastatin A组和10 μmol/L Tubastatin A组细胞曲线运动速度显著下降（P=0.002、<0.001）；与5 μmol/L Tubastatin A组比较，10 μmol/L Tubastatin A组细胞曲线运动速度明显下降（P=0.042）。
2.3 Tubastatin A对HSF ERK1/2活性的调节作用
培养24 h后，阴性对照组、1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组细胞ERK1/2的活性分别为1.00、0.70±0.03、0.49±0.05、0.37±0.05，组间总体比较，差异有统计学意义（F=52.84，P<0.001）。培养24 h后，与阴性对照组比较，1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组细胞ERK1/2的活性显著下降（P<0.001）；与1 μmol/L Tubastatin A组比较，5 μmol/L Tubastatin A组和10 μmol/L Tubastatin A组细胞ERK1/2的活性显著下降（P=0.001、<0.001）；与5 μmol/L Tubastatin A组比较，10 μmol/L Tubastatin A组细胞ERK1/2的活性显著下降（P=0.044）。见图3。
3 蛋白质印迹法检测阴性对照组及Tubastatin A处理3组人皮肤成纤维细胞中ERK1/2及p-ERK1/2的蛋白表达水平注：ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2，p-ERK1/2为磷酸化ERK1/2，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；1.阴性对照组，2、3、4.分别为1 μmol/L Tubastatin A组、5 μmol/L Tubastatin A组、10 μmol/L Tubastatin A组3. 讨论
哺乳动物细胞中HDAC主要包括4种类型，其中Ⅰ型有HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8，Ⅱ型有HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10，Ⅲ型有SIRT1-7，Ⅳ型有HDAC11［14, 15］。HDAC6主要分布于胞质，而其他HDAC主要定位于细胞核中，因而HDAC6具有不同于其他家族成员的分子特征与功能。从结构上看，HDAC6羧基端的去乙酰化酶同源区后紧跟1个特定的泛素化结合位点，可使组蛋白以外的蛋白质发生去乙酰化［16］。因此，HDAC6是一种独特的去乙酰化酶。
瘢痕增生的基本过程是Fb大量增殖，导致组织过度纤维化［17, 18］。HDAC参与多种组织和器官纤维化的发生和发展，包括心脏、肾脏、肝脏和肺等［19, 20, 21］。研究表明，HDAC抑制剂可下调信号转导及转录激活因子3、TGF-β1等信号通路［22, 23, 24］，抑制Fb合成胶原蛋白，减少ECM沉积，从而抑制组织纤维化，提示HDAC活性增高可促进组织器官纤维化的发生。近期研究表明，HDAC广谱抑制剂曲古抑菌素A（TSA）通过抑制Smads和Sp1的蛋白表达来抑制TGF-β作用下皮肤Fb的胶原合成与分泌［25］。此外，有研究表明，TSA具有抑制人角膜Fb合成和分泌ECM的作用［26］。这些研究提示，HDAC的活性增加可能是瘢痕形成过程中一个新的促纤维化机制。Tubastatin A是一种选择性HDAC6抑制剂，其对HDAC6的选择性抑制作用远远大于其他HDAC［27］。HDAC6可通过调节Notch1信号通路，促进细胞存活及增殖，而抑制HDAC6可诱导细胞凋亡，抑制细胞周期［28, 29］。然而，HDAC6在HSF增殖及运动中的作用尚鲜见报道。本研究采用HDAC6选择性抑制剂Tubastatin A刺激HSF，通过CCK-8法及EdU染色检测细胞增殖活力，采用活细胞工作站记录细胞运动轨迹并分析细胞运动范围和曲线运动速度，结果表明，不同浓度的Tubastatin A作用后HSF增殖活力下降、运动范围缩小、曲线运动速度下降，并呈现一定的Tubastatin A浓度依赖性，即Tubastatin A浓度越高，HSF增殖和运动性下降越明显。本研究表明，Tubastatin A可显著下调HSF的增殖和运动性。
ERK1/2是MAPK家族成员之一，其发生磷酸化修饰后活性增加，对细胞增殖和运动有重要调节作用［30, 31］，ERK1/2活性通常以p-ERK1/2与ERK1/2比值表示。既往研究表明，ERK1/2可通过诱导c-Myc和缺氧诱导因子1α，激活增殖相关信号转导［32］。新近研究表明，皮肤瘢痕组织及缺氧处理的皮肤Fb中p-ERK1/2水平增加［33］，ΕΡΚ1/2信号通路参与调节Fb的增殖、迁移、侵袭等生物学行为［34］。有关肿瘤侵袭转移的研究表明，HDAC6过表达激活ERK1/2信号通路，从而促进肿瘤的生长［35］。本研究结果表明，在HDAC6的选择性抑制剂Tubastatin A作用下，HSF中ERK1/2磷酸化水平显著下降，并呈一定的Tubastatin A浓度依赖性，即Tubastatin A浓度越高，HSF中ERK1/2活性下降越明显。这表明HDAC6的选择性抑制剂Tubastatin A可显著抑制HSF中ERK1/2的活性。
综上，在HSF中，ERK1/2信号通路对HDAC6选择性抑制剂Tubastatin A敏感，ERK1/2活性降低可能参与介导了Tubastatin A对HSF增殖及运动性的抑制效应。这在一定程度上揭示了Tubastatin A在抗HSF增殖和运动中的作用，为Tubastatin A作为抗瘢痕辅助用药提供了理论依据。
黄敏、黄厚强：研究设计、研究实施、数据采集、数据分析/解释、论文撰写；熊爱兵：专家函询、对文章内容进行审阅；王剑雄、郑思琳：研究指导、经费支持；陈琪、郭声敏：统计分析、论文修改所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 成年烧伤患者静脉血栓栓塞风险评估量表预测223例成年烧伤患者发生静脉血栓栓塞的受试者操作特征曲线
注：图中红色线为参考线，曲线下面积为成年烧伤患者静脉血栓栓塞风险评估量表预测发生静脉血栓栓塞的准确性
表1 27名专家对成年烧伤患者静脉血栓栓塞风险评估量表的函询意见协调程度
类别 第1轮函询 第2轮函询 条目数（个） 肯德尔和谐系数 χ 2值 P值 条目数（个） 肯德尔和谐系数 χ 2值 P值 年龄与基础疾病 19 0.29 121.46 <0.001 18 0.37 169.97 <0.001 烧伤伤情因素 12 0.42 107.09 <0.001 14 0.43 152.12 <0.001 烧伤救治因素 19 0.28 116.00 <0.001 18 0.31 141.54 <0.001 总二级条目 50 0.30 331.97 <0.001 50 0.36 471.70 <0.001 
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一级与二级条目 二级条目权重 组合权重系数 赋值（分） 年龄与基础疾病 （1）年龄为60~74岁 0.82 0.03 3 （2）年龄≥75岁 0.93 0.04 4 （3）24 kg/m2≤身体质量指数<28 kg/m2 0.74 0.03 3 （4）身体质量指数≥28 kg/m2 0.89 0.04 4 （5）有吸烟史 0.82 0.03 3 （6）有如激素、避孕药等药物（长期、滥用）史或吸毒史 0.89 0.04 4 （7）有血糖增高或糖尿病 0.84 0.03 3 （8）有高血脂 0.84 0.03 3 （9）有2级高血压（中度） 0.79 0.03 3 （10）有3级高血压（重度） 0.85 0.03 3 （11）有高尿酸、痛风 0.76 0.03 3 （12）有静脉血管性疾病 0.93 0.04 4 （13）截瘫或其他原因造成伤前长期卧床 0.98 0.04 4 （14）有心肌梗死（1个月内） 0.92 0.04 4 （15）有脑卒中（1个月内） 0.94 0.04 4 （16）有VTE病史或有VTE家族史 0.99 0.04 4 （17）有肺功能异常（如慢性阻塞性肺疾病） 0.85 0.03 3 （18）有恶性肿瘤 0.96 0.04 4 烧伤伤情因素 （1）烧伤总面积为10%~29%TBSA或Ⅲ度烧伤面积<10%TBSA 0.73 0.03 3 （2）烧伤总面积为30%~49%TBSA或Ⅲ度烧伤面积10%~19%TBSA 0.91 0.04 4 （3）烧伤总面积≥50%TBSA或Ⅲ度烧伤面积≥20%TBSA 0.96 0.04 4 （4）烧伤深度为深Ⅱ度 0.80 0.04 4 （5）烧伤深度为Ⅲ度 0.93 0.04 4 （6）骨折合并软组织严重损伤或骨折的广泛损伤 0.93 0.04 4 （7）烧伤部位包含下肢 0.88 0.04 4 （8）有吸入性损伤 0.79 0.04 4 （9）有肢体电烧伤 0.93 0.04 4 （10）有烧伤延迟复苏 0.87 0.04 4 （11）有全身感染或脓毒血症 0.93 0.04 4 （12）血小板计数升高 0.95 0.04 4 （13）有凝血功能及D-二聚体异常（凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间缩短，纤维蛋白原、D-二聚体升高） 0.95 0.04 4 （14）连续卧床时间≥72 h 0.93 0.04 4 烧伤救治因素 （1）深静脉反复穿刺次数≥2次 0.91 0.06 6 （2）有股静脉置管 0.93 0.06 6 （3）有其他部位深静脉置管 0.82 0.06 6 （4）深静脉置管留置时间1周之内 0.71 0.05 5 （5）深静脉置管留置时间超过1周 0.91 0.06 6 （6）机械通气时间≥24 h 0.82 0.06 6 （7）静脉大量高渗液体输入（≥2 000 mL/d） 0.84 0.06 6 （8）大量输血（>4 U/d） 0.79 0.05 5 （9）使用镇静镇痛药时长≥24 h 0.80 0.05 5 （10）使用翻身床 0.79 0.05 5 （11）行焦痂切除术或筋膜切开术 0.82 0.06 6 （12）行切痂术或切痂植皮术 0.81 0.06 6 （13）行削痂术或削痂植皮术 0.82 0.06 6 （14）位于下肢部位的手术 0.86 0.06 6 （15）行手术≥3次 0.92 0.06 6 （16）行烧伤三、四级手术 0.90 0.06 6 （17）使用止血药（包括手术中） 0.90 0.06 6 （18）行肢体术后加压包扎时长≥24 h 0.93 0.06 6 注：VTE为静脉血栓栓塞，TBSA为体表总面积
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表3 223例成年烧伤患者采用成年烧伤患者静脉血栓栓塞风险评估量表评估后各条目得分与量表总得分相关分析
一级与二级条目 r值 P值 年龄与基础疾病因素 （1）年龄 0.17 0.012 （2）身体质量指数 0.15 0.044 （3）有吸烟史 0.17 0.010 （4）有如激素、避孕药等药物（长期、滥用）史或吸毒史 0.12 0.080 （5）有血糖增高或糖尿病 0.23 0.001 （6）有高血脂 0.06 0.341 （7）有高血压 0.16 0.019 （8）有高尿酸、痛风 0.14 0.034 （9）有静脉血管性疾病 0.13 0.053 （10）截瘫或其他原因造成伤前长期卧床 0.22 0.001 （11）有心肌梗死（1个月内） 0.13 0.061 （12）有脑卒中（1个月内） 0.22 0.001 （13）有VTE病史或有VTE家族史 0.29 0.007 （14）有肺功能异常（如慢性阻塞性肺疾病） 0.20 0.002 （15）有恶性肿瘤 0.20 0.032 烧伤伤情因素 （1）烧伤总面积 0.61 <0.001 （2）烧伤深度 0.56 <0.001 （3）骨折合并软组织严重损伤或骨折的广泛损伤 0.12 0.115 （4）烧伤部位包含下肢 0.48 <0.001 （5）有吸入性损伤 0.35 <0.001 （6）有肢体电烧伤 0.20 0.020 （7）有烧伤延迟复苏 0.17 0.011 （8）有全身感染或脓毒血症 0.26 <0.001 （9）血小板计数升高 0.26 <0.001 （10）有凝血功能及D-二聚体异常（凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间缩短，纤维蛋白原、D-二聚体升高） 0.41 <0.001 （11）连续卧床时间≥72 h 0.58 <0.001 烧伤救治因素 （1）深静脉反复穿刺次数≥2次 0.37 <0.001 （2）有股静脉置管 0.40 <0.001 （3）有其他部位深静脉置管 0.26 <0.001 （4）深静脉置管留置时间 0.43 <0.001 （5）机械通气时间≥24 h 0.21 0.001 （6）静脉大量高渗液体输入（≥2 000 mL/d） 0.33 <0.001 （7）大量输血（>4 U/d） 0.38 <0.001 （8）使用镇静镇痛药时长≥24 h 0.30 <0.001 （9）使用翻身床 0.22 0.001 （10）行焦痂切除术或筋膜切开术 0.27 <0.001 （11）行切痂削痂术或切削痂植皮术 0.51 <0.001 （12）位于下肢部位的手术 0.43 <0.001 （13）行手术≥3次 0.41 <0.001 （14）行烧伤三、四级手术 0.54 <0.001 （15）使用止血药（包括手术中） 0.50 <0.001 （16）行肢体术后加压包扎时长≥24 h 0.41 <0.001 注：VTE为静脉血栓栓塞
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表4 2组成年烧伤患者采用成年烧伤患者静脉血栓栓塞风险评估量表评估后各条目得分比较（分）
组别 例数 二级条目1 二级条目2 二级条目3 二级条目4 二级条目5 二级条目6 二级条目7 二级条目8 二级条目9 二级条目10 高分组 60 0（0，3.00） 0（0，3.00） 0（0，3.00） 0（0，3.00） 0（0，2.25） 0（0，0） 1.37±0.53 1.37±0.53 1.90±0.52 1.03±0.34 低分组 60 0（0，0） 0（0，0） 0（0，0） 0（0，0） 0（0，0） 0（0，0） 0 0 0.87±0.31 0 统计量值 Z=-4.88 Z=-2.09 Z=-2.19 Z=-2.55 Z=-2.52 Z=-1.78 t=-3.06 t=-3.06 t=-2.76 t=-3.06 P值 <0.001 0.019 0.030 0.011 0.012 0.076 0.003 0.003 0.027 0.003 注：二级条目1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37分别为年龄，身体质量指数，有吸烟史，有血糖增高或糖尿病，有高血压，有高尿酸、痛风，截瘫或其他原因造成伤前长期卧床，有脑卒中（1个月内），有静脉血栓栓塞（VTE）病史或有VTE家族史，有肺功能异常（如慢性阻塞性肺疾病），有恶性肿瘤，烧伤总面积，烧伤深度，烧伤部位包含下肢，有吸入性损伤，有肢体电烧伤，有烧伤延迟复苏，有全身感染或脓毒血症，血小板计数升高，有凝血功能及D-二聚体异常（凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间缩短，纤维蛋白原、D-二聚体升高），连续卧床时间≥72 h，深静脉反复穿刺次数≥2次，有股静脉置管，有其他部位深静脉置管，深静脉置管留置时间，机械通气时间≥24 h，静脉大量高渗液体输入（≥2 000 mL/d），大量输血（>4 U/d），使用镇静镇痛药时长≥24 h，使用翻身床，行焦痂切除术或筋膜切开术，行切痂削痂术或切削痂植皮术，位于下肢部位的手术，行手术≥3次，行烧伤三、四级手术，使用止血药（包括手术中），行肢体术后加压包扎时长≥24 h；一级条目1、2、3分别为年龄与基础疾病因素、烧伤伤情因素、烧伤救治因素；除二级条目1~6得分以M（Q 1,Q 3）表示外，其余条目得分以 -
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