The effect and mechanism of exosomes derived from human amniotic epithelial cells on the proliferation and migration of HaCaT in high glucose environment
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摘要:
目的 探讨人羊膜上皮细胞外泌体（hAEC-Exo）对高糖环境下HaCaT增殖和迁移的作用及其相关机制。 方法 采用实验研究方法。取2019年1—6月于福建医科大学附属协和医院妇产科10名足月分娩健康孕妇羊膜组织，分离原代人羊膜上皮细胞（hAEC）。观察培养第2、4、7天原代hAEC生长状态和形态改变，采用流式细胞术检测细胞表面标志物CD73、CD90、CD29、CD34及人白细胞抗原DR（HLA-DR）的表达，取第2~4代细胞用于后续实验。超速离心法分离hAEC-Exo。将HaCaT与hAEC-Exo共培养3 h，采用倒置荧光显微镜观察HaCaT对hAEC-Exo的摄取情况。取HaCaT，分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、hAEC-Exo组和二甲基亚砜（DMSO）+PBS组、DMSO+hAEC-Exo组、LY294002+hAEC-Exo组，每组3孔，并进行相应处理，采用细胞计数试剂盒8（CCK-8）法检测培养0（即刻）、12、24、36、48、60 h细胞增殖活力；划痕试验检测划痕后0、24、48、72 h划痕愈合情况，并计算划痕愈合率；Transwell实验检测培养48 h穿膜细胞数；蛋白质印迹法检测培养24 h后磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K-Akt-mTOR）通路相关的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、磷酸化mTOR（p-mTOR）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）的蛋白表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及独立样本t检验。 结果 原代hAEC培养第2天多数呈卵圆形，大小均一；培养第4、7天，细胞形态呈典型的鹅卵石样单层排列。原代hAEC高表达间充质干细胞表面标志物CD73、CD90及CD29，不表达或低表达造血干细胞相关表面标志物CD34及HLA-DR。培养3 h，hAEC-Exo成功被HaCaT内吞入细胞质，并聚集于细胞核周围。培养12、24、36、48、60 h，hAEC-Exo组HaCaT增殖活力明显高于PBS组（t=3.691、10.861、12.121、10.531、14.931，P<0.01）。划痕后24、48、72 h，PBS组HaCaT划痕愈合率明显低于hAEC-Exo组（t=3.342、6.427、5.485，P<0.05或P<0.01）。培养48 h，hAEC-Exo组HaCaT穿膜数显著多于PBS组（t=5.385，P<0.01）。培养24 h，hAEC-Exo组HaCaT中p-mTOR和p-Akt蛋白表达量明显高于PBS组（t=4.240、5.586，P<0.01），2组HaCaT中mTOR和Akt蛋白表达量相近（P>0.05）。培养24 h，DMSO+hAEC-Exo组HaCaT中p-mTOR和p-Akt的蛋白表达量明显高于DMSO+PBS组（t=6.155、8.338，P<0.01）和LY294002+hAEC-Exo组（t=5.030、3.960，P<0.01），3组HaCaT中mTOR和Akt蛋白表达量相近（P>0.05）。DMSO+hAEC-Exo组HaCaT培养12、24、36、48、60 h增殖活力为0.78±0.05、1.23±0.07、1.60±0.09、1.86±0.09、2.03±0.08，明显高于DMSO+PBS组的0.46±0.04、0.69±0.07、0.98±0.08、1.16±0.08、1.26±0.11（t=4.376、7.398、8.488、9.766、10.730，P<0.01）；DMSO+hAEC-Exo组HaCaT培养24、36、48、60 h增殖活力明显高于LY294002+hAEC-Exo组的0.96±0.09、1.20±0.08、1.39±0.08、1.55±0.10（t=3.639、5.447、6.605、6.693，P<0.05或P<0.01）。DMSO+hAEC-Exo组HaCaT划痕后24、48、72 h划痕愈合率明显高于DMSO+PBS组（t=4.003、6.349、7.714，P<0.01）和LY294002+hAEC-Exo组（t=3.805、4.676、4.067，P<0.05或P<0.01）。培养48 h，DMSO+hAEC-Exo组HaCaT穿膜数明显多于DMSO+PBS组和LY294002+hAEC-Exo组（t=7.464、1.232，P<0.01）。 结论 PI3K-Akt-mTOR通路介导hAEC-Exo促进高糖环境下HaCaT增殖和迁移。 Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of exosomes derived from human amniotic epithelial cells (hAEC-Exos) on the proliferation and migration of HaCaT in high glucose environment. Methods The experimental research method was adopted. The amniotic membrane tissue was collected from 10 healthy pregnant women at full term delivery in the Department of Obstetrics and Gynecology of Fujian Medical University Union Hospital from January to June 2019, and the primary human amniotic epithelial cells (hAECs) were isolated. The growth status and morphological changes of the primary hAECs on the 2nd, 4th, and 7th day of culture were observed, and the expressions of the cells surface markers of CD73, CD90, CD29, CD34, and human leukocyte antigen DR (HLA-DR). The 2nd to 4th passages of hAECs were used in the following experiments. The hAEC-Exos were separated by ultracentrifugation method. The HaCaT and hAEC-Exos were co-cultured for 3 h, and the uptake of hAEC-Exos by HaCaT was observed by inverted fluorescence microscopy. The HaCaT were divided into phosphate buffer solution (PBS) group and hAEC-Exos group or dimethyl sulfoxide (DMSO)+PBS group, DMSO+hAEC-Exos group, and LY294002+hAEC-Exos group, which were dealt correspondingly, with 3 wells in each group. Cell counting kit 8 (CCK-8) method was used to detect cell proliferation activity after 0 (immediately), 12, 24, 36, 48, and 60 h of culture. The scratch test was conducted to detect the scratch healing at 0, 24, 48, and 72 h after the scratch, and the scratch healing rate was calculated, respectively. The Transwell experiment was conducted to detect the number of transmembrane cells after 48 h of culture. The Western blotting was used to detect the protein expressions of mammalian target of rapamycin (mTOR), phosphorylated mTOR (p-mTOR), protein kinase B (Akt), and phosphorylated Akt (p-Akt) related to phosphatidylinositol 3-kinase-Akt-mTOR (PI3K-Akt-mTOR) pathway after 24 h of culture. Data were statistically analyzed with analysis of variance for repeated measurement, one-way analysis of variance, and independent sample t test. Results Most of the primary hAECs were oval and uniform in size on the 2nd day of culture. The hAECs were arranged in a typical cobblestone-like monolayer on the 4th and 7th day of culture. The primary hAECs highly expressed CD73, CD90, and CD29 of mesenchymal stem cell related surface markers, and were with no or low expressions of CD34 and HLA-DR of hematopoietic stem cell related surface markers. After 3 h of culture, hAEC-Exos were successfully endocytosed by HaCaT into the cytoplasm and gathered around the nucleus. After 12, 24, 36, 48, and 60 h of culture, the proliferation activity of HaCaT in hAEC-Exos group was significantly higher than that in PBS group (t=3.691, 10.861, 12.121, 10.531, 14.931, P<0.01). At 24, 48, and 72 h after scratch, the scratch healing rates of HaCaT in PBS group were significantly lower than those in hAEC-Exos group (t=3.342, 6.427, 5.485, P<0.05 or P<0.01). After 48 h of culture, the number of transmembrane HaCaT in hAEC-Exos group was significantly more than that in PBS group (t=5.385, P<0.01). After 24 h of culture, the protein expressions of p-mTOR and p-Akt in HaCaT of hAEC-Exos group were significantly higher than those in PBS group (t=4.240, 5.586, P<0.01), while the protein expressions of mTOR and Akt in HaCaT of the two groups were similar (P>0.05). After 24 h of culture, the protein expressions of p-mTOR and p-Akt in HaCaT of DMSO+hAEC-Exos group were significantly higher than those in DMSO+PBS group (t=6.155, 8.338, P<0.01) and LY294002+hAEC-Exos group (t=5.030, 3.960, P<0.01), while the protein expressions of mTOR and Akt in HaCaT of the three groups were similar (P>0.05). The proliferation activity of HaCaT in DMSO+hAEC-Exos group at 12, 24, 36, 48, and 60 h of culture was 0.78±0.05, 1.23±0.07, 1.60±0.09, 1.86±0.09, and 2.03±0.08, which was significantly higher than 0.46±0.04, 0.69±0.07, 0.98±0.08, 1.16±0.08, and 1.26±0.11 in DMSO+PBS group (t=4.376, 7.398, 8.488, 9.766, 10.730, P<0.01). The proliferation activity of HaCaT in DMSO+hAEC-Exos group at 24, 36, 48, and 60 h was significantly higher than 0.96±0.09, 1.20±0.08, 1.39±0.08, and 1.55±0.10 in LY294002+hAEC-Exos group (t=3.639, 5.447, 6.605, 6.693, P<0.05 or P<0.01). The scratch healing rates of HaCaT in DMSO+hAEC-Exos group at 24, 48, and 72 h after scratch were significantly higher than those in DMSO+PBS group (t=4.003, 6.349, 7.714, P<0.01) and LY294002+hAEC-Exos group (t=3.805, 4.676, 4.067, P<0.05 or P<0.01). After 48 h of culture, the number of transmembrane HaCaT in DMSO+hAEC-Exos group was significantly more than that in DMSO+PBS group and LY294002+hAEC-Exos group, respectively (t=7.464, 1.232, P<0.01). Conclusions PI3K-Akt-mTOR pathway can promote the proliferation and migration of HaCaT in high glucose environment by mediating hAEC-Exos. -
(1)证实连续性肾脏替代治疗（CRRT）可显著改善严重烧伤合并急性肾损伤（AKI）患者肾功能、缓解肾脏损伤等。
(2)筛选出肾前性AKI是导致严重烧伤合并AKI患者CRRT无效的主要独立影响因素。
Highlights:
(1)It was confirmed that the continuous renal replacement therapy (CRRT) could significantly improve renal function and alleviate renal injury in severe burn patients complicated with acute kidney injury (AKI).
(2)Prerenal AKI was screened out as the main independent influencing factor leading to ineffective CRRT in severe burn patients complicated with AKI.
休克、脓毒症、高肌红蛋白血症等引起的急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是烧伤患者最常见的并发症［1］。一篇包括20项研究的系统评价显示，合并AKI的烧伤患者病死率高达43%［2］。肾脏替代治疗（renal replacement therapy，RRT）可通过弥散、对流等原理平衡电解质、清除体内毒性物质和过多水分等，是针对AKI最有效、最常用的治疗手段。约8.34%的烧伤患者接受RRT，且约37.05%的烧伤合并AKI患者接受RRT［3］。根据持续时间不同，RRT可分为连续性RRT（continuous renal replacement therapy，CRRT）、间歇性RRT；根据治疗原理不同，CRRT可分为连续性静脉-静脉血液滤过、连续性静脉-静脉血液透析、连续性静脉-静脉血液透析滤过等模式［4, 5, 6］。随着RRT在重症领域的广泛应用，其适应证已从单纯的肾功能替代，拓展到炎症和应激因子清除、液体容量管理、内环境稳定等［7］。虽然RRT在治疗严重烧伤患者、合并脓毒症休克和AKI的烧伤患者、合并休克的烧伤患者中显示出临床获益，但接受RRT的烧伤合并AKI患者病死率仍较高［8, 9, 10］。这可能与RRT的启动时机、抗凝方式、模式选择等治疗细节方面尚无公认标准和共识有关。为此，本研究基于11年的临床经验和数据，回顾性分析CRRT在严重烧伤合并AKI患者中的应用效果，筛选出严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的影响因素，并对比分析不同AKI病因对CRRT临床疗效的影响，以期为CRRT在严重烧伤合并AKI患者中的应用提供参考。
1. 对象与方法
本回顾性病例系列研究获陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院伦理委员会批准，批号：KY2021122，并豁免知情同意。
1.1 入选标准
纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）因火焰、爆炸、热液、化学、电导致的烧伤；（3）住院期间接受CRRT；（4）根据2012版《改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease： Improving Global Outcomes，KDIGO）急性肾损伤临床实践指南》中制订的AKI诊断标准［11］诊断为AKI。排除标准：（1）有肾脏基础疾病史；（2）使用CRRT的原因为脓毒症、脓毒症休克等非AKI并发症；（3）临床资料不完整。
1.2 临床资料与分组统计
2010年1月—2020年12月，陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院收治79例符合入选标准的接受CRRT的严重烧伤合并AKI患者。主要观察指标为全部患者和不同AKI病因分组患者的CRRT整体效果。次要观察指标为全部患者和不同AKI病因分组患者的院内病死率和住院天数。
收集全部患者的一般资料，包括性别、年龄、体重指数、烧伤面积（烧伤总面积、Ⅲ度烧伤面积）、烧伤指数、致伤原因、是否合并吸入性损伤、入院时急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ）和脓毒症相关性器官功能衰竭评价（sepsis-related organ failure assessment，SOFA）评分、烧伤后入院时间和入院后发生AKI时间；CRRT整体效果，包括总体有效率、完全有效率、部分有效率、无效率、恶化率，治疗前后的肌酐、尿素、胱抑素C、液体超载率，院内病死率、基于Baux评分模型的预测病死率、最常见的死亡原因、住院天数。其中按照CRRT前后，以《KDIGO AKI临床实践指南》中的AKI诊断标准为依据的AKI分期变化，将患者肾功能改善情况分为完全有效、部分有效、无效和恶化4个等级，完全有效为治疗后AKI已完全恢复正常，部分有效为治疗后AKI已降期但未完全恢复正常，无效为治疗后AKI分期无变化，恶化为治疗后AKI分期升高［11, 12, 13］；液体超载以百分率表示，液体超载率=［每日入量（L）-每日出量（L）］÷入院时体重（kg）×100%［14］；Baux评分=年龄（岁）+烧伤总面积（%TBSA）+［17×是否合并吸入性损伤（是=1，否=0）］；基于Baux评分模型的预测病死率（%）=e-8.816 3+（0.077 5×Baux评分）÷（1+e-8.816 3+（0.077 5×Baux评分））［15］。
根据CRRT效果，将患者分为有效组（42例）和无效组（37例），其中完全有效和部分有效均被认定为CRRT有效，无效和恶化被认定为CRRT无效。比较2组患者一般资料和发生AKI后启动CRRT时间、CRRT持续时间、AKI病因、CRRT启动前AKI分期、CRRT模式、抗凝剂种类、院内病死率。
根据《中国AKI临床实践指南》和《脓毒症相关AKI共识》中AKI病因［16, 17］，将患者分为肾前性组（22例）和肾性组（57例），比较2组患者一般资料和发生AKI后启动CRRT时间、CRRT持续时间和CRRT整体效果（最常见的死亡原因除外）。
1.3 统计学处理
采用SPSS 26.0统计软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料数据以
2. 结果
2.1 总体一般资料
79例患者中，男73例、女6例，年龄（46±14）岁，体重指数（24.0±2.9）kg/m2，烧伤总面积（69±26）%TBSA，Ⅲ度烧伤面积（44±25）%TBSA，烧伤指数57（36，76）。火焰烧伤者36例、电烧伤者19例、热液烫伤者16例、爆炸伤者6例、化学烧伤者2例，39例患者合并吸入性损伤，入院时APACHE Ⅱ评分16（12，18）分、SOFA评分11（5，13）分，烧伤后0（0，2）d入院，入院后0（0，6）d发生AKI，47例（59.49%）患者在入院48 h内发生AKI。
2.2 CRRT整体效果
79例患者中，CRRT总体有效率53.16%（42/79）、完全有效率30.38%（24/79）、部分有效率22.78%（18/79）、无效率31.65%（25/79）、恶化率15.19%（12/79）。患者治疗后的肌酐和尿素分别为139.50（92.70，195.00）μmol/L和13.00（8.37，23.78）mmol/L，均明显低于治疗前的230.50（124.60，341.30）μmol/L和19.70（12.22，26.55）mmol/L（Z值分别为-3.26、-2.54，P值分别为0.001、0.011）；治疗后的胱抑素C和液体超载率分别为1.70（1.25，2.70）mg/L和4.58%（2.41%，6.63%），与治疗前的2.05（1.60，3.50）mg/L和5.24%（3.33%，8.71%）比较，差异均无统计学意义（Z值分别为-1.61、-1.37，P值分别为0.107、0.169）。患者院内病死率17.72%（14/79），基于Baux评分模型的预测病死率75.10%（18.94%，91.84%），最常见的死亡原因为MOF，住院天数39.43（11.52，110.58）d。
2.3 严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的影响因素分析
2.3.1 单因素分析
有效组和无效组患者Ⅲ度烧伤面积、CRRT持续时间、AKI病因比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。
表1 有效组和无效组严重烧伤合并AKI患者的一般资料和CRRT相关资料比较表1. Comparison of general data and CRRT-related data in the severe burn patients complicated with AKI between effective group and ineffective group组别 例数 性别（例） 年龄（岁， 体重指数（kg/m2， 烧伤总面积（%TBSA， Ⅲ度烧伤面积［%TBSA，M（Q1，Q3）］ 烧伤指数［M（Q1，Q3）］ 男 女 有效组 42 39 3 47±12 24.3±3.1 69±29 42（26，75） 58（36，82） 无效组 37 34 3 46±16 24.3±4.3 64±25 37（20，52） 51（34，73） 统计量值 — t=0.30 t=-0.01 t=1.22 Z=-1.99 Z=-1.59 P值 >0.999 0.761 0.993 0.225 0.046 0.111 注：有效组患者CRRT效果等级为完全有效或部分有效，无效组患者CRRT效果等级为无效或恶化；AKI为急性肾损伤，CRRT为连续性肾脏替代治疗，TBSA为体表总面积，APACHE Ⅱ为急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ，SOFA为脓毒症相关性器官功能衰竭评价，CVVH为连续性静脉-静脉血液滤过，CVVHDF为连续性静脉-静脉血液透析滤过；“—”表示无此项；CRRT模式中其他为混合使用CVVH和CVVHDF或单独使用连续性静脉-静脉血液透析，抗凝剂种类中其他为混合使用肝素或枸橼酸抗凝剂或使用除这2种抗凝剂之外的抗凝剂 2.3.2 多因素logistic回归分析
选取2.3.1单因素分析中P<0.1的4个因素，即AKI病因、Ⅲ度烧伤面积、发生AKI后启动CRRT时间、CRRT持续时间。将AKI病因进行变量赋值（肾前性=0、肾性=1），其余3个指标以原始值代入，进行多因素logistic回归分析。结果显示，AKI病因和Ⅲ度烧伤面积均是严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的独立影响因素（P<0.05）。见表2。
表2 影响79例严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的多因素logistic回归分析结果表2. Results of multivariate logistic regression analysis affecting the efficacy of CRRT in 79 severe burn patients complicated with AKI项目与分类 比值比 95%置信区间 P值 常量 0.07 — 0.002 AKI病因 肾性AKI（以肾前性AKI为参照） 4.21 1.20~14.80 0.025 Ⅲ度烧伤面积（%TBSA） 1.03 1.00~1.05 0.024 发生AKI后启动CRRT时间（h） 1.33 0.87~2.03 0.182 CRRT持续时间（h） 1.00 0.99~1.00 0.186 注：AKI为急性肾损伤，CRRT为连续性肾脏替代治疗，TBSA为体表总面积；“—”表示无此项 2.4 不同AKI病因患者的临床特征比较
肾前性组和肾性组患者的烧伤总面积、烧伤指数、致伤原因、烧伤后入院时间、入院后发生AKI时间、发生AKI后启动CRRT时间、CRRT总体有效率和基于Baux评分模型的预测病死率比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；肾性组患者治疗前的尿素和胱抑素C均明显高于肾前性组（P<0.05），液体超载率明显低于肾前性组（P<0.05）；肾性组患者治疗后的胱抑素C明显高于肾前性组（P<0.05）；其余指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3、4。
表3 肾前性组和肾性组严重烧伤合并AKI患者一般资料和CRRT相关时间参数比较表3. Comparison of general data and CRRT-related time indexes in the severe burn patients complicated with AKI between prerenal group and renal group组别 例数 性别（例） 年龄（岁， 体重指数（kg/m2， 烧伤总面积［%TBSA，M（Q1，Q3）］ Ⅲ度烧伤面积［%TBSA，M（Q1，Q3）］ 烧伤指数［M（Q1，Q3）］ 致伤原因（例） 男 女 火焰烧伤 电烧伤 爆炸伤 化学烧伤 热液烫伤 肾前性组 22 20 2 46±12 24.4±2.8 90（70，95） 54（34，70） 73（54，80） 13 0 2 1 6 肾性组 57 53 4 46±14 24.2±4.0 62（40，86） 34（20，59） 47（32，67） 23 19 4 1 10 统计量值 — t=-0.09 t=0.15 Z=2.46 Z=1.82 Z=2.43 χ2=12.59 P值 >0.999 0.924 0.877 0.016 0.072 0.017 0.007 注：肾前性和肾性为AKI病因；AKI为急性肾损伤，CRRT为连续性肾脏替代治疗，TBSA为体表总面积，APACHE Ⅱ为急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ，SOFA为脓毒症相关性器官功能衰竭评价；“—”表示无此项 表4 肾前性组和肾性组严重烧伤合并AKI患者CRRT效果比较表4. Comparison of efficacy of CRRT in the severe burn patients complicated with AKI between prerenal group and renal group组别 例数 总体有效情况［例（%）］ CRRT效果等级［例（%）］ 完全有效 部分有效 无效 恶化 肾前性组 22 7（31.82） 4（18.18） 3（13.64） 11（50.00） 4（18.18） 肾性组 57 35（61.40） 20（35.09） 15（26.32） 14（24.56） 8（14.04） 统计量值 χ2=5.58 χ2=-1.92 P值 0.024 0.054 注：肾前性和肾性为AKI病因；AKI为急性肾损伤，CRRT为连续性肾脏替代治疗 3. 讨论
AKI是严重烧伤患者常见的并发症之一，发病率和病死率分别高达30%和80%［18］，而CRRT是治疗AKI的最终有效手段。近年研究显示，CRRT不仅具有肾脏替代作用，而且可清除代谢物、降低炎症应激反应、精确控制容量等，进而改善患者预后。因此，CRRT适应证已扩展到横纹肌溶解、脓毒症休克、水电解质紊乱、自身免疫系统疾病甚至急性脑损伤［19, 20, 21］。治疗细节包括CRRT的不同模式、启动时机、剂量、抗凝剂选择等方面［22, 23, 24, 25, 26］，但目前均缺乏统一标准。本研究回顾性分析了CRRT在烧伤合并AKI患者中的应用效果，筛选出了可能影响CRRT效果的因素。
本研究显示，CRRT可明显降低严重烧伤合并AKI患者肌酐、尿素和液体超载率，这与前期多项研究结果［27, 28, 29, 30］较类似，进一步证实了CRRT可明显改善严重烧伤合并AKI患者肾功能、避免液体超载、缓解肾脏损伤。但是，本研究人群的病死率仍较高，其可能原因如下：（1）烧伤损伤机制和治疗的复杂性高，严重烧伤患者的成功救治几乎涉及机体每个系统，而造成死亡的原因常常是心脏、肺脏、肝脏、循环等多个功能障碍，而不单单是AKI，事实上本研究中1/2死亡人群的死亡原因为MOF。（2）入组患者年龄大、烧伤总面积大、烧伤病情危重，本身病死率就比较高；实际上基于Baux评分模型预测出本研究患者的病死率中位数为75.10%，明显高于实际病死率。（3）47例（59.49%）患者在入院48 h内发生AKI，提示大多数患者可能为外院并发AKI后转院过来，存在一定的病情延误。
本研究将肾脏改善情况和部分远期指标（院内病死率、住院天数等）作为结局指标，以便从多个维度反映CRRT的效果。其中考虑到远期治疗效果的混杂因素较多，本研究将肾功能改善作为主要观察指标。现有研究显示，肌酐、尿素、尿量等可能受到容量、代谢等影响，单一指标并不能准确评价肾损伤程度，而KDIGO标准（主要包括肌酐和尿量）为近年来反映肾损伤程度的公认指标，比单一指标更为准确。为了减少CRRT启动时肾脏损伤程度不同的影响，本研究将KDIGO分期的变化情况作为疗效评价指标，同时结合肌酐、尿素等绝对值的变化，从不同角度反映CRRT对AKI的效果。
本研究通过单因素分析和多因素logistic回归分析得出，AKI病因和Ⅲ度烧伤面积是严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的独立影响因素，其中肾前性AKI的比值比为4.21，而Ⅲ度烧伤面积的比值比仅为1.03，接近1，说明Ⅲ度烧伤面积对CRRT效果影响小，因此肾前性AKI是严重烧伤合并AKI患者CRRT无效的主要独立影响因素。亚组分析也支持，肾前性组患者的CRRT总体有效率明显低于肾性组的结论。可能原因为CRRT可代替肾性AKI患者受损的肾功能，而肾前性AKI患者除了需要CRRT进行肾功能替代外，更需要着重去除导致AKI的病因。严重烧伤患者由于创面体液的大量丢失，容易出现机体有效循环容量降低，肾脏血流灌注不足，这是引起肾前性AKI的常见病因。因此，需要在CRRT基础上，大量补液以尽快补充有效血容量是促进肾前性AKI恢复的关键手段。此外，液体超载也会加重肾脏负担，导致AKI。Ⅲ度烧伤面积越大，烧伤病情越重，可能使患者AKI的损伤程度更重，导致给予CRRT后患者KDIGO分期改善的幅度更为明显。
本研究也存在一定的局限性，样本量较少，但已纳入本单位近11年的数据，这可能与近年来严重烧伤发病率降低有关，后续仍然需要大规模、多中心、前瞻性临床研究来解决这一问题。
综上，本研究表明，CRRT可明显改善严重烧伤合并AKI患者肾功能、避免液体超载、缓解肾脏损伤等。肾前性AKI是严重烧伤合并AKI患者CRRT无效的独立影响因素。
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参考文献
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1 原代人羊膜上皮细胞（hAEC）培养第2、4、7天形态观察 倒置荧光显微镜×100。1A.培养第2天，hAEC贴壁生长，形态、大小均一；1B、1C.分别为培养第4、7天，hAEC增殖活跃，细胞密度增加，呈典型的鹅卵石样单层排列
2 人羊膜上皮细胞外泌体（hAEC-Exo）与HaCaT共培养3 h，hAEC-Exo被HaCaT内吞入细胞质，并聚集于细胞核周围 PKH26-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×200
注：红色指示外泌体，蓝色指示细胞核
3 2组HaCaT划痕后各时间点划痕面积 倒置荧光显微镜×100。3A、3B、3C、3D.分别为PBS组划痕后0（即刻）、24、48、72 h的划痕面积；3E、3F、3G、3H.分别为hAEC-Exo组划痕后0、24、48、72 h的划痕面积，图3F、3G、3H划痕面积分别明显小于图3B、3C、3D
注：PBS为磷酸盐缓冲液，hAEC-Exo为人羊膜上皮细胞外泌体
4 Transwell实验观察2组HaCaT培养48 h穿膜迁移情况 苏木精×50。4A、4B.分别为PBS组和hAEC-Exo组，图4B穿膜细胞数明显多于图4A
注：蓝色指示穿膜细胞；PBS为磷酸盐缓冲液，hAEC-Exo为人羊膜上皮细胞外泌体
5 蛋白质印迹法检测2组HaCaT培养24 h PI3K-Akt-mTOR通路相关蛋白的表达水平
注：PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶，mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，p-mTOR为磷酸化mTOR，Akt为蛋白激酶B，p-Akt为磷酸化Akt，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；1、2分别为磷酸盐缓冲液组和人羊膜上皮细胞外泌体组
6 蛋白质印迹法检测3组HaCaT培养24 h PI3K-Akt-mTOR通路相关蛋白的表达量
注：PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶，mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，p-mTOR为磷酸化mTOR，Akt为蛋白激酶B，p-Akt为磷酸化Akt，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；1、2、3分别为二甲基亚砜（DMSO）+磷酸盐缓冲液组，DMSO+人羊膜上皮细胞外泌体（hAEC-Exo）组，LY294002+hAEC-Exo组
7 3组HaCaT划痕后各时间点划痕面积。7A、7B、7C、7D.分别为DMSO+PBS组划痕后0（即刻）、24、48、72 h的划痕面积；7E、7F、7G、7H.分别为DMSO+hAEC-Exo组划痕后0、24、48、72 h的划痕面积，图7F、7G、7H划痕面积明显小于图7B、7C、7D；7I、7J、7K、7L.分别为LY294002+hAEC-Exo组划痕后0、24、48、72 h的划痕面积，图7J、7K、7L划痕面积明显大于图7F、7G、7H
注：DMSO为二甲基亚砜，PBS为磷酸盐缓冲液，hAEC-Exo为人羊膜上皮细胞外泌体
8 Transwell实验观察3组HaCaT培养48 h穿膜迁移情况 苏木精×50。8A、8B、8C.分别为DMSO+PBS组、DMSO+hAEC-Exo组和LY294002+hAEC-Exo组，图8B穿膜迁移细胞数明显多于图8A、8C
注：图中蓝色指示穿膜细胞；DMSO为二甲基亚砜, PBS为磷酸盐缓冲液，hAEC-Exo为人羊膜上皮细胞外泌体
表 1 2组HaCaT培养各时间点增殖活力比较（
组别 样本数 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h PBS组 3 0.273±0.025 0.386±0.028 0.494±0.030 0.789±0.060 0.943±0.040 hAEC-Exo组 3 0.404±0.030 0.770±0.041 0.923±0.026 1.161±0.042 1.471±0.038 t值 3.691 10.861 12.121 10.531 14.931 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 注：PBS为磷酸盐缓冲液，hAEC-Exo为人羊膜上皮细胞外泌体；处理因素主效应，F=783.2，P<0.01；时间因素主效应，F=494.7，P<0.01；两者交互作用，F=27.0，P<0.01 
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表2 2组HaCaT划痕后各时间点划痕愈合率比较
表2. （%，x¯±s）
组别 样本数 24 h 48 h 72 h PBS组 3 22.6±2.4 42.8±4.0 74.5±4.5 hAEC-Exo组 3 34.7±4.9 66.1±4.8 94.4±4.1 t值 3.342 6.427 5.485 P值 <0.05 <0.01 <0.01 注：PBS为磷酸盐缓冲液，hAEC-Exo为人羊膜上皮细胞外泌体；处理因素主效应，F=692.7，P<0.01；时间因素主效应，F=25.4，P<0.01；两者交互作用，F=14.4，P<0.01
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表3 2组HaCaT培养24 h PI3K-Akt-mTOR通路相关蛋白的表达量比较（
组别 样本数 mTOR p-mTOR Akt p-Akt PBS组 3 0.517±0.045 0.267±0.066 0.823±0.068 0.333±0.050 hAEC-Exo组 3 0.537±0.049 0.437±0.046 0.787±0.025 0.610±0.029 t值 0.404 4.240 0.740 5.586 P值 >0.05 <0.01 >0.05 <0.01 注：PBS为磷酸盐缓冲液，hAEC-Exo为人羊膜上皮细胞外泌体；PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶，Akt为蛋白激酶B，p-Akt为磷酸化Akt，mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，p-mTOR为磷酸化mTOR
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表4 3组HaCaT中培养24 h PI3K-Akt-mTOR通路相关蛋白的表达量比较（
组别 样本数 mTOR p-mTOR Akt p-Akt DMSO+PBS组 3 0.716±0.017 0.395±0.038 0.859±0.033 0.228±0.028 DMSO+hAEC-Exo组 3 0.716±0.026 0.600±0.054 0.847±0.029 0.505±0.034 LY294002+hAEC-Exo组 3 0.699±0.027 0.433±0.029 0.865±0.039 0.374±0.033 F值 0.4 13.8 0.1 38.3 P值 >0.05 <0.01 >0.05 <0.01 t1值 0.024 6.155 0.353 8.338 P1值 >0.05 <0.01 >0.05 <0.01 t2值 0.501 5.030 0.517 3.960 P2值 >0.05 <0.01 >0.05 <0.01 注：DMSO为二甲基亚砜，PBS为磷酸盐缓冲液，hAEC-Exo为人羊膜上皮细胞外泌体，PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶，Akt为蛋白激酶B，p-Akt为磷酸化Akt，mTOR为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，p-mTOR为磷酸化mTOR；t1值、P1值，t2值、P2值分别DMSO+hAEC-Exo组与DMSO+PBS组、LY294002+hAEC-Exo组比较所得
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表5 3组HaCaT培养各时间点增殖活力比较（
组别 样本数 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h DMSO+PBS组 3 0.46±0.04 0.69±0.07 0.98±0.08 1.16±0.08 1.26±0.11 DMSO+hAEC-Exo组 3 0.78±0.05 1.23±0.07 1.60±0.09 1.86±0.09 2.03±0.08 LY294002+hAEC-Exo组 3 0.59±0.03 0.96±0.09 1.20±0.08 1.39±0.08 1.55±0.10 t1值 4.376 7.398 8.488 9.766 10.730 P1值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 t2值 2.691 3.639 5.447 6.605 6.693 P2值 >0.05 <0.05 <0.01 <0.01 <0.01 注：DMSO为二甲基亚砜，PBS为磷酸盐缓冲液，hAEC-Exo为人羊膜上皮细胞外泌体；处理因素主效应，F=141.3，P<0.01；时间因素主效应，F=279.1，P<0.01；两者交互作用，F=8.2，P<0.01；t1值、P1值，t2值、P2值分别DMSO+hAEC-Exo组与DMSO+PBS组、LY294002+hAEC-Exo组比较所得
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表6 3组HaCaT培养各时间点划痕愈合率比较（%，
组别 样本数 24 h 48 h 72 h DMSO+PBS组 3 11.2±1.5 35.2±4.4 71.2±3.4 DMSO+hAEC-Exo组 3 23.0±2.0 54.0±3.9 94.0±2.9 LY294002+hAEC-Exo组 3 11.8±1.8 40.1±2.5 82.0±2.9 t1值 4.003 6.349 7.714 P1值 <0.01 <0.01 <0.01 t2值 3.805 4.676 4.067 P2值 <0.05 <0.01 <0.01 注：DMSO为二甲基亚砜，PBS为磷酸盐缓冲液，hAEC-Exo为人羊膜上皮细胞外泌体；处理因素主效应，F=779.4，P<0.01；时间因素主效应，F=57.1，P<0.01；两者交互作用，F=2.2，P=0.11；t1值、P1值，t2值、P2值分别DMSO+hAEC-Exo组与DMSO+PBS组、LY294002+hAEC-Exo组比较所得
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