Epidemiological characteristics and treatment outcome analysis of 229 patients with hydrofluoric acid burns in hands
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摘要:
目的 探讨手部氢氟酸烧伤患者的流行病学特征及治疗结局。 方法 采用回顾性观察性研究方法。收集浙江衢化医院2008年1月—2020年12月收治的符合入选标准的229例手部氢氟酸烧伤患者的病历资料，统计患者的性别、年龄、所在企业类型、氢氟酸质量分数、烧伤部位、烧伤总面积、院前时间、住院天数、创面愈合天数、入院时是否有低钙血症和低镁血症、是否行手术治疗、有无瘢痕后遗症。采用单因素和多因素logistic回归分析筛选影响全部患者和氢氟酸质量分数已知的患者手术治疗和瘢痕后遗症的危险因素，采用单因素和多因素线性回归分析筛选影响全部患者和氢氟酸质量分数已知的患者创面愈合天数的危险因素。 结果 229例患者中男206例、女23例，年龄主要集中在30~50岁（139例），大部分患者的所在企业类型为非氟化工企业，仅91例患者的致伤氢氟酸质量分数已知（以中质量分数为主），常见的烧伤部位为手指中末节，烧伤总面积均≤1%体表总面积，院前时间为19（9，29）h，住院天数为2（1，7）d，创面愈合天数为12（8，18）d，入院时有低钙血症、低镁血症的比例分别为0.9%（2/229）、1.3%（3/229），36例患者行手术治疗，83例患者有瘢痕后遗症。针对229例患者，单因素logistic回归分析显示，所在企业类型、院前时间均是患者手术治疗（比值比分别为7.86、51.35，95%置信区间分别为1.83~33.76、11.89~221.78，P<0.01）和瘢痕后遗症（比值比分别为3.62、27.40，95%置信区间分别为1.76~7.43、13.25~56.68，P<0.01）的影响因素；多因素logistic回归分析显示，院前时间是影响患者手术治疗和瘢痕后遗症的独立危险因素（比值比分别为43.00、24.55，95%置信区间分别为9.89~187.03、11.78~51.16，P<0.01）；单因素线性回归分析显示，所在企业类型、院前时间均是患者创面愈合天数的影响因素（β值分别为6.16、12.83，95%置信区间分别为3.38~8.93、10.72~14.93，P<0.01）；多因素线性回归分析显示，所在企业类型、院前时间均是影响患者创面愈合天数的独立危险因素（β值分别为2.81、12.16，95%置信区间分别为0.50~5.13、10.00~14.31，P<0.05或P<0.01）。针对91例氢氟酸质量分数已知的患者，单因素logistic回归分析显示，所在企业类型、氢氟酸质量分数（低和高）、院前时间均是患者手术治疗的影响因素（比值比分别为9.10、11.25、10.69、0.04，95%置信区间分别为1.15~72.25、1.39~90.93、1.32~86.59、0.01~0.19，P<0.05或P<0.01），所在企业类型、氢氟酸质量分数、院前时间均是患者瘢痕后遗症的影响因素（比值比分别为0.32、0.21、36.80，95%置信区间分别为0.11~0.92、0.06~0.73、11.03~122.79，P<0.05或P<0.01）；多因素logistic回归分析显示，氢氟酸质量分数、院前时间均是影响患者手术治疗的独立危险因素（比值比分别为11.51、0.04，95%置信区间分别为1.22~108.26、0.01~0.25，P<0.05或P<0.01），院前时间是影响患者瘢痕后遗症的独立危险因素（比值比=37.71，95%置信区间为9.97~142.69，P<0.01）；单因素线性回归分析显示，所在企业类型、氢氟酸质量分数（低和高）、院前时间均是患者创面愈合天数的影响因素（β值分别为7.12、-5.63、-9.74、13.50，95%置信区间分别为2.43~11.81、-10.59~-0.68、-14.78~-4.70、10.14~16.86，P<0.05或P<0.01）；多因素线性回归分析显示，氢氟酸质量分数、院前时间均是影响患者创面愈合天数的独立危险因素（β值分别为-5.84、0.09，95%置信区间分别为-10.59~-1.08、0.05~0.12，P<0.05或P<0.01）。 结论 手部氢氟酸烧伤发病人群以中青年男性为主，所在企业类型、氢氟酸质量分数、院前时间是影响手部氢氟酸烧伤患者治疗结局的危险因素。 Abstract:Objective To explore the epidemiological characteristics and treatment outcomes of patients with hydrofluoric acid burns in hands. Methods A retrospective observational study was conducted. The medical records of 229 patients with hydrofluoric acid burns in hands who were admitted to Zhejiang Quhua Hospital from January 2008 to December 2020 and met the inclusion criteria were collected. The following statistical data of patients were collected, including gender, age, type of affiliated enterprise, hydrofluoric acid mass fraction, injury site, total burn area, prehospital time, length of hospital stay, length of wound healing, whether hypocalcemia and hypomagnesemia occurred or not on admission, whether surgery intervention was performed or not, and whether scar sequelae occurred or not. Single factor and multivariate logistic regression analysis were used to screen out the risk factors impacting surgery intervention and scar sequelae of all the patients and patients whose hydrofluoric acid mass fraction was known. Single factor and multivariate linear regression analysis were used to screen out the risk factors impacting the length of wound healing of all the patients and patients whose hydrofluoric acid mass fraction was known. Results The 229 patients included 206 males and 23 females, with the majority aged 30 to 50 years (139 patients). The type of affiliated enterprise of majority patients was non-fluorine chemical enterprise. The hydrofluoric acid mass fraction was known in only 91 patients, mainly medium. The majority injury site was in the middle and end of finger. The total burn area was below or equal to 1% total body surface area. The prehospital time was 19 (9, 29) h. The length of hospital stay was 2 (1, 7) d. The length of wound healing was 12 (8, 18) d. The proportions of hypocalcemia and hypomagnesemia were 0.9% (2/229) and 1.3% (3/229) on admission, respectively. Thirty-six patients had surgeries and 83 patients had scar sequelae. In 229 patients, single factor logistic regression analysis showed that both type of affiliated enterprise and prehospital time were the factors impacting surgery intervention (with odds ratio values of 7.86 and 51.35, respectively, 95% confidence intervals of 1.83-33.76 and 11.89-221.78, respectively, P<0.01) and scar sequelae of patients (with odds ratio values of 3.62 and 27.40, respectively, 95% confidence intervals of 1.76-7.43 and 13.25-56.68, respectively, P<0.01); multivariate logistic regression analysis showed that prehospital time was the independent risks factor impacting surgery intervention and scar sequelae of patients (with odds ratio values of 43.00 and 24.55, respectively, 95% confidence intervals of 9.89-187.03 and 11.78-51.16, respectively, P<0.01); single factor linear regression analysis showed that both type of affiliated enterprise and prehospital time were the factors impacting the length of wound healing of patients (with β values of 6.16 and 12.83, respectively, 95% confidence intervals of 3.38-8.93 and 10.72-14.93, respectively, P<0.01); multivariate linear regression analysis showed that both type of affiliated enterprise and prehospital time were the independent risk factors impacting the length of wound healing of patients (with β values of 2.81 and 12.16, respectively, 95% confidence intervals of 0.50-5.13 and 10.00-14.31, respectively, P<0.05 or P<0.01). In 91 patients whose hydrofluoric acid mass fraction was known, single factor logistic regression analysis showed that type of affiliated enterprise, hydrofluoric acid mass fraction (low and high), and prehospital time were all the factors impacting surgery intervention of patients (with odds ratio values of 9.10, 11.25, 10.69, and 0.04, respectively, 95% confidence intervals of 1.15-72.25, 1.39-90.93, 1.32-86.59, and 0.01-0.19, respectively, P<0.05 or P<0.01), type of affiliated enterprise, hydrofluoric acid mass fraction, and prehospital time were all the factors impacting scar sequelae of patients (with odds ratio values of 0.32, 0.21, and 36.80, respectively, 95% confidence intervals of 0.11-0.92, 0.06-0.73, and 11.03-122.79, respectively, P<0.05 or P<0.01); multivariate logistic regression analysis showed that both hydrofluoric acid mass fraction and prehospital time were the independent risk factors impacting surgery intervention of patients (with odds ratio values of 11.51 and 0.04, respectively, 95% confidence intervals of 1.22-108.26 and 0.01-0.25, respectively, P<0.05 or P<0.01), prehospital time was the independent risk factor impacting scar sequelae of patients (odds ratio=37.71, with 95% confidence interval of 9.97-142.69, P<0.01); single factor linear regression analysis showed that type of affiliated enterprise, hydrofluoric acid mass fraction (low and high), and prehospital time were all the factors impacting the length of wound healing of patients (with β values of 7.12, -5.63, -9.74, and 13.50, respectively, 95% confidence intervals of 2.43-11.81, -10.59--0.68, -14.78--4.70, and 10.14-16.86, respectively, P<0.05 or P<0.01); multivariate linear regression analysis showed that both hydrofluoric acid mass fraction and prehospital time were the independent risk factors impacting the length of wound healing of patients (with β values of -5.84 and 0.09, respectively, 95% confidence intervals of -10.59--1.08 and 0.05-0.12, respectively, P<0.05 or P<0.01). Conclusions The majority of patients with hydrofluoric acid burns in hands are young and middle-aged males. Type of affiliated enterprise, hydrofluoric acid mass fraction and prehospital time are the risk factors that affect the treatment outcomes of patients with hydrofluoric acid burns in hands. -
Key words:
- Burns, chemical /
- Hydrofluoric acid /
- Hand /
- Wound healing /
- Risk factors
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(1)证明了在LPS的刺激下，序列相似性家族134成员B（FAM134B）介导的内质网自噬于小鼠树突状细胞中活化明显，并对细胞凋亡有显著抑制作用，为脓毒症免疫治疗提供新靶点。
(2)在基因水平证实，干扰 FAM134B基因的表达可激活线粒体凋亡途径，进而影响小鼠树突状细胞的凋亡，为明确脓毒症时细胞免疫功能障碍的关键信号机制提供新思路。
Highlights:
(1)Proved that under the stimulation of LPS, family with sequence similarity 134, member B (FAM134B)-mediated reticulophagy was significantly activated in mouse dendritic cells and had a significant inhibitory effect on cell apoptosis, providing a new target for immunotherapy of sepsis.
(2)At the genetic level, it has been confirmed that interfering with the expression of FAM134Bgene can activate the mitochondrial apoptosis pathway, thereby affecting the apoptosis of mouse dendritic cells, providing a new idea for clarifying the key signaling mechanisms of cellular immune dysfunction in sepsis.
脓毒症的本质是因感染引起宿主反应失调，从而导致致命性器官功能障碍 ［ 1］ 。大量研究提示，免疫应答障碍系导致脓毒症预后不良的主要因素 ［ 2, 3］ 。然而，迄今为止，尚未能明确诱发和加重细胞免疫功能障碍的关键信号机制。树突状细胞（DC）是专职抗原呈递细胞，成熟DC可激活初始T淋巴细胞的增殖并启动适应性免疫应答 ［ 4］ 。许多资料表明，在脓毒症发生与发展过程中，DC数量锐减与机体免疫功能低下密切相关 ［ 5, 6］ 。但是，关于脓毒症状态下DC死亡的分子机制尚不明确。内质网自噬是维持细胞自身功能稳态的一种适应性反应，其能选择性吞噬受损内质网膜，进而对内质网进行质量控制 ［ 7］ 。序列相似性家族134成员B（FAM134B）是首个被发现可介导内质网自噬的受体；FAM134B可通过其微管相关蛋白1轻链3（LC3）结合结构域与LC3B结合，进而介导内质网自噬的发生 ［ 8］ 。业已明确，FAM134B介导的内质网自噬可抑制许多炎性疾病的发生与发展，且细胞器选择性自噬功能异常也是多种炎症疾病发病的重要因素 ［ 9, 10］ 。
本研究旨在探讨LPS刺激模拟脓毒症状态下DC中FAM134B介导内质网自噬的变化规律，并通过调控 FAM134B基因表达进一步探究该基因介导内质网自噬对DC凋亡的影响及其意义。
1. 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂与仪器来源
小鼠DC系DC2.4购自河北北纳生物科技有限公司。含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒和空载慢病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，LPS购自美国Sigma公司，兔抗小鼠FAM134B单克隆抗体、兔抗小鼠LC3B单克隆抗体、兔抗小鼠SEC61B单克隆抗体、Alexa Fluor 647标记的兔抗小鼠LC3B单克隆抗体、兔抗小鼠B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）单克隆抗体、兔抗小鼠Bcl-2相关X蛋白（Bax）单克隆抗体及兔抗小鼠剪切型胱天蛋白酶3（caspase-3）单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，Alexa Fluor 647标记的特异性溶酶体荧光染料和RPMI-1640培养基购自美国Thermo Fisher Scientific公司，膜联蛋白Ⅴ-别藻蓝蛋白/7-氨基放线菌素D-藻红蛋白检测试剂盒购自美国BioLegend公司，Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体购自北京金普来生物科技有限公司，小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体、Hoechst 33258购自北京普利莱基因技术有限公司。CANTO PLUS型流式细胞仪购自美国BD公司，DYY-7型电泳仪购自北京六一仪器厂，ImageQuant LAS 4000型化学发光成像分析仪购自美国GE通用电气公司，LEICA CTR4000型倒置荧光相差显微镜、Leica SP5型激光扫描共聚焦显微镜购自德国Leica公司，Spectra MR型多功能酶标仪购自美国DYNEX Technologies公司，JEM-1400 FLASH型透射电子显微镜购自日本电子株式会社。
1.2 细胞培养
采用T25培养瓶培育小鼠DC系DC2.4细胞，加入8 mL完全培养基（含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、5 958 mg/L 缓冲剂和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基），置于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳培养箱中进行常规培养。每1~2天行细胞换液，待细胞融合度达80%时进行传代，取第3~10代对数生长期的细胞进行实验。
1.3 LPS刺激后细胞中内质网自噬相关蛋白的蛋白表达
将DC分为LPS刺激0 h（不刺激）组、LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组，用1 μg/mL LPS（浓度下同）培养相应时间后，收集每组细胞约2×10 6个，提取细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法检测FAM134B、LC3B、SEC61B的蛋白表达。一抗分别为兔抗小鼠FAM134B单克隆抗体、兔抗小鼠LC3B单克隆抗体、兔抗小鼠SEC61B单克隆抗体和小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG单克隆抗体（稀释比均为1∶5 000，比例下同）。采用化学发光成像分析仪获取图像，采用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）分析各目的蛋白条带灰度值，以β肌动蛋白为内参照，计算相应蛋白的相对表达量，另计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值（以此表示LC3B蛋白表达）。本实验样本数为3。
1.4 LPS刺激对细胞中内质网自噬的影响
1.4.1 FAM134B表达及其与溶酶体探针和LC3B共定位检测
将DC分为PBS组与LPS组，给予相应刺激并培养24 h，收集每组细胞约2×10 6个进行免疫荧光染色。一抗为兔抗小鼠FAM134B单克隆抗体（稀释比为1∶200）、Alexa Fluor 647标记的兔抗小鼠LC3B单克隆抗体（稀释比为1∶100），二抗为Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG单克隆抗体（稀释比为1∶1 000），溶酶体探针为Alexa Fluor 647标记的特异性溶酶体荧光染料（稀释比为1∶1 000）。采用含抗荧光淬灭封片剂封片后，于600倍激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞中FAM134B（阳性染色为绿色）表达及其分别与LC3B（阳性染色为红色）和溶酶体探针（阳性染色为红色）的共定位情况。
1.4.2 自噬溶酶体数量观察
取DC，同1.4.1分组处理，收集每组细胞2×10 7个，固定并制片，于1 000倍透射电子显微镜下观察细胞内自噬溶酶体数量。
1.5 敲减 FAM134B基因DC的修饰编辑及鉴定
1.5.1 修饰编辑
将DC按3×10 4个/mL重新悬浮于完全培养基中，按每孔2 mL接种于6孔板中，分为转染含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒的敲减FAM134B组和转染空载慢病毒的空载体组。参照文献［ 11］的基因转染方法，将DC与慢病毒共培养24 h后，更换新的完全培养基。另将仅常规培养的DC设为空白对照组。
1.5.2 鉴定
转染后72 h，于50倍倒置荧光相差显微镜下观察细胞内荧光表达情况，其中携带绿色荧光且活力较好的细胞为成功转染 FAM134B基因的细胞。
1.6 干扰 FAM134B基因表达对LPS诱导细胞凋亡的影响
1.6.1 FAM134B蛋白表达检测
将DC分为单纯PBS组、单纯LPS组，将成功转染含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒的DC分为敲减FAM134B+PBS组、敲减FAM134B+LPS组，将成功转染空载慢病毒的DC分为空载体+PBS组、空载体+LPS组，给予相应刺激并培养24 h，收集每组细胞约2×10 6个，提取细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法检测FAM134B的蛋白表达。一抗为兔抗小鼠FAM134B单克隆抗体和小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗及结果分析方法同1.3。本实验样本数为3。
1.6.2 细胞凋亡情况观测
（1）流式细胞术检测。将细胞按每孔2×10 5个接种于6孔板中，同1.6.1进行分组处理，收集各孔悬浮和贴壁细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。本实验样本数为3。（2）Hoechst染色观测。将细胞同1.6.1进行分组处理，收集每组细胞约2×10 6个，进行常规Hoechst染色及制片，于400倍倒置荧光相差显微镜下观察细胞荧光表达情况（凋亡细胞呈现亮蓝色，活细胞呈现暗蓝色），并计算细胞凋亡率。本实验样本数为5。
1.6.3 凋亡相关蛋白的蛋白表达检测
将细胞同1.6.1进行分组处理，收集每组细胞约2×10 6个，提取细胞总蛋白，采用蛋白质印迹法检测Bax、Bcl-2、剪切型caspase-3的蛋白表达。一抗为兔抗小鼠Bax单克隆抗体、兔抗小鼠Bcl-2单克隆抗体、兔抗小鼠剪切型caspase-3单克隆抗体和小鼠抗小鼠β肌动蛋白单克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗及结果分析方法同1.3，另计算Bax/Bcl-2比值。本实验样本数为5。
1.7 统计学处理
采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。计量资料数据均符合正态分布，用
2. 结果
2.1 内质网自噬相关蛋白的蛋白表达
与LPS刺激0 h组相比，LPS刺激12 h组和LPS刺激24 h组细胞中FAM134B蛋白表达均明显升高（ P<0.05），LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组细胞中SEC61B蛋白表达均明显降低（ P<0.05），LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值均明显升高（ P<0.05），其中LPS刺激24 h组细胞中3个蛋白的变化最显著。见 图1与 表1。将24 h作为后续LPS刺激时长。
注：FAM134B为序列相似性家族134成员B，LC3B为微管相关蛋白1轻链3B；条带上方1、2、3、4、5分别指示内毒素/脂多糖（LPS）刺激0 h（不刺激）组、LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组和LPS刺激72 h组表1 5组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4中内质网自噬相关蛋白的蛋白表达比较（组别 样本数 FAM134B SEC61B LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值 LPS刺激0 h（不刺激）组 3 0.51±0.10 1.67±0.05 0.79±0.26 LPS刺激6 h组 3 0.75±0.30 1.11±0.21 0.91±0.18 LPS刺激12 h组 3 1.00±0.16 0.94±0.13 0.94±0.09 LPS刺激24 h组 3 1.20±0.07 0.83±0.22 1.59±0.09 LPS刺激72 h组 3 0.80±0.08 1.22±0.26 1.29±0.08 F值 7.70 8.93 13.13 P值 <0.001 <0.001 <0.001 P 1值 0.099 0.004 0.371 P 2值 0.004 0.001 0.289 P 3值 <0.001 <0.001 <0.001 P 4值 0.530 0.016 0.003 注：LPS为内毒素/脂多糖，FAM134B为序列相似性家族134成员B，LC3B为微管相关蛋白1轻链3B； F值、 P值为组间各指标总体比较所得； P 1值、 P 2值、 P 3值、 P 4值分别为LPS刺激6 h组、LPS刺激12 h组、LPS刺激24 h组、LPS刺激72 h组与LPS刺激0 h组各指标比较所得 2.2 内质网自噬水平
培养24 h，与PBS组相比，LPS组细胞中FAM134B的表达及其与LC3B及溶酶体探针的共定位均显著增强，见 图2。培养24 h，与PBS组相比，LPS组细胞中小空泡状的自噬溶酶体数量明显增多，见 图3。
注：各图中右上小图为细胞核染色（蓝色）图，右中小图为序列相似性家族134成员B（FAM134B）染色（绿色）图，右下小图为微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）或溶酶体探针染色（均为红色）图，各图中左侧大图为右侧3张小图的合成图；FAM134B与LC3B共定位代表其与自噬小体结合情况，FAM134B与溶酶体探针共定位代表其与溶酶体结合情况；图2A、2B为加入FAM134B与LC3B双抗后的染色，图2C、2D为加入FAM134B抗体与溶酶体探针后的染色2.3 细胞的修饰编辑情况
空载体组与敲减FAM134B组细胞转染后72 h均表现出高强度荧光，而空白对照组细胞在相应时间点无荧光表现，见 图4。
2.4 干扰 FAM134B基因表达对LPS诱导细胞凋亡的影响
2.4.1 FAM134B蛋白表达
培养24 h，单纯PBS组、单纯LPS组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组与敲减FAM134B+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达分别为0.290±0.026、1.107±0.091、0.343±0.045、1.060±0.106、0.117±0.038与0.126±0.025（刺激类型的主效应， F=287.56， P<0.001；细胞转染类型的主效应， F=164.52， P<0.001；二者交互作用， F=71.14， P<0.001）。与单纯PBS组和空载体+PBS组相比，敲减FAM134B+PBS组细胞中FAM134B蛋白表达明显降低（ P值分别为0.006、0.001）；与单纯LPS组和空载体+LPS组相比，敲减FAM134B+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达显著降低（ P值均<0.001）；单纯LPS组细胞中FAM134B蛋白表达较单纯PBS组明显升高（ P<0.001），空载体+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达较空载体+PBS组明显升高（ P<0.001），敲减FAM134B+PBS组与敲减FAM134B+LPS组细胞中FAM134B蛋白表达相近（ P=0.852）。见 图5。
注：FAM134B为序列相似性家族134成员B；条带上方1、2、3、4、5、6分别指示单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯内毒素/脂多糖（LPS）组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组、敲减FAM134B+LPS组；2个空载体组转染空载慢病毒，2个敲减组转染含FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒2.4.2 细胞凋亡情况
2.4.2 .1 流式细胞术检测的细胞凋亡率
培养24 h，单纯PBS组、单纯LPS组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组与敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率分别为（13.3±0.8）%、（32.6±4.3）%、（17.0±1.5）%、（51.7±3.3）%、（52.4±3.1）%与（62.3±2.6）%（刺激类型的主效应， F=106.47， P<0.001；细胞转染类型的主效应， F=162.73， P<0.001；二者交互作用， F=3.99， P=0.048）。与单纯LPS组和空载体+LPS组相比，敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率明显升高（ P值分别为<0.001、0.001）；与对应的PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组相比，单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率分别明显升高（ P值分别为<0.001、<0.001、0.001）。
2.4.2 .2 Hoechst染色观测的细胞凋亡情况
培养24 h，单纯PBS组、单纯LPS组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+PBS组与敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率分别为（3.6±1.4）%、（45.7±2.9）%、（6.4±0.5）%、（54.2±6.4）%、（28.6±1.0）%与（86.2±1.4）%（刺激类型的主效应， F=1 986.67， P<0.001；细胞转染类型的主效应， F=335.72， P<0.001；二者交互作用， F=16.53， P<0.001）。与单纯LPS组和空载体+LPS组相比，敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率明显升高（ P值均<0.001）；与对应的PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组相比，单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组细胞凋亡率分别明显升高（ P<0.001）。见 图6。
2.4.3 凋亡相关蛋白的蛋白表达
培养24 h，与单纯LPS组和空载体+LPS组相比，敲减FAM134B+LPS组细胞中剪切型caspase-3蛋白表达、Bax/Bcl-2比值均明显升高（ P<0.001）。与对应的PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组相比，单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组细胞中剪切型caspase-3蛋白表达、Bax/Bcl-2比值均明显升高（ P值分别为0.032、0.021、<0.001与0.033、0.002、<0.001）。见 图7与 表2。
注：caspase-3为胱天蛋白酶3，Bcl-2为B细胞淋巴瘤2，Bax为Bcl-2相关X蛋白；条带上方1、2、3、4、5、6分别指单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯内毒素/脂多糖（LPS）组、空载体+PBS组、空载体+LPS组、敲减序列相似性家族134成员B（FAM134B）+PBS组、敲减FAM134B+LPS组；2个空载体组转染空载慢病毒，2个敲减组转染含FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒表2 6组小鼠树突状细胞（DC）系DC2.4培养24 h凋亡相关蛋白的蛋白表达比较（组别 样本数 剪切型caspase-3 Bax/Bcl-2比值 单纯PBS组 5 0.37±0.04 0.70±0.26 单纯LPS组 5 0.60±0.08 1.45±0.18 空载体+PBS组 5 0.37±0.11 1.18±0.12 空载体+LPS组 5 0.62±0.07 2.35±0.82 敲减FAM134B+PBS组 5 0.62±0.30 2.32±0.79 敲减FAM134B+LPS组 5 1.29±0.18 14.10±0.47 P 1值 0.032 0.033 P 2值 0.021 0.002 P 3值 <0.001 <0.001 P 4值 <0.001 <0.001 P 5值 <0.001 <0.001 注：PBS为磷酸盐缓冲液，LPS为内毒素/脂多糖，FAM134B为序列相似性家族134成员B，caspase-3为胱天蛋白酶3，Bcl-2为细胞淋巴瘤2，Bax为Bcl-2相关X蛋白；2个空载体组转染空载慢病毒，2个敲减组转染含 FAM134B基因小干扰RNA序列的慢病毒；剪切型caspase-3、Bax/Bcl-2比值的刺激类型的主效应， F值分别为44.27、575.43， P值均<0.001；细胞转染类型的主效应， F值分别为28.98、569.95， P值均<0.001；二者交互作用， F值分别为6.41、358.95， P值分别为0.006、<0.001； P 1值、 P 2值、 P 3值分别为单纯LPS组、空载体+LPS组、敲减FAM134B+LPS组与对应PBS处理组即单纯PBS组、空载体+PBS组、敲减FAM134B+PBS组各指标比较所得； P 4值、 P 5值分别为单纯LPS组、空载体+LPS组与敲减FAM134B+LPS组各指标比较所得 3. 讨论
业已明确，脓毒症患者免疫功能低下与患者晚期病死率上升及继发感染事件增加密切相关 ［ 2］ 。因此，了解脓毒症状态下不同免疫细胞数量改变，将有助于更好地理解脓毒症发病及进展过程，同时也为未来设计临床干预靶点提供理论依据 ［ 2］ 。研究证实，脓毒症患者血液中以及脓毒症小鼠脾脏中DC数量减少是造成免疫抑制的重要原因 ［ 2， 12］ ，且脓毒症状态下DC减少是机体处于免疫抑制状态的诊断标准之一 ［ 2， 13］ 。因此有理由相信，通过针对DC凋亡进行调控进而逆转脓毒症免疫异常状态可能成为治疗脓毒症的新途径。
最近有研究显示，FAM134B介导的内质网自噬可缓和脓毒症状态下小鼠心肌细胞炎症反应并减少心肌细胞的凋亡 ［ 14］ 。Luo等 ［ 15］ 观察到，FAM134B介导的内质网自噬可通过缓解内质网应激，进而抑制心肌细胞死亡。另据报道，FAM134B介导内质网自噬还可通过调控内质网内钙离子稳态，进而调节细胞死亡 ［ 16］ 。干扰素基因刺激因子（STING）是一种定位于内质网上的模式识别受体，其过度激活已被证实与细胞死亡密不可分 ［ 17］ 。Moretti等 ［ 18］ 观察到，相关的内质网自噬受体可感知STING的过度激活，进而靶向降解STING，以达到维持细胞活性的目的。这些资料均提示，内质网自噬可通过多种途径调节细胞稳态，进而缓解细胞死亡。然而，研究显示，内质网自噬还可诱导细胞死亡。例如，在Ⅱ型遗传性感觉和自主神经病变患者中，FAM134B突变可引发过度的内质网自噬，最终导致细胞稳态失衡与细胞死亡 ［ 19］ 。目前看来，FAM134B介导内质网自噬对细胞不同死亡方式有着更为复杂的影响。鉴于内质网自噬在维持细胞内蛋白质稳态中的重要意义及其与人类重大疾病的相关性，本研究率先探讨了FAM134B介导内质网自噬在模拟脓毒症状态下DC凋亡中的潜在作用及其意义，旨在揭示其免疫学效应，并为免疫调理提供新线索。
在本实验中，采用1 μg/mL LPS刺激DC，可观察到FAM134B表达水平显著上调，其中以刺激24 h最为明显，因此将24 h作为后续LPS刺激时长。内质网自噬水平研究显示，LPS刺激24 h后细胞中FAM134B的表达及其与溶酶体探针及LC3B的共定位均明显增强，且自噬溶酶体数量明显增多。以上结果均提示，在LPS作用下细胞中内质网自噬活性显著上调，且在刺激24 h达峰值。基于此，本实验重点分析了在LPS刺激24 h状态下干预FAM134B表达对细胞凋亡的影响。本课题组采用慢病毒转染技术对DC转染带有 FAM134B基因干扰病毒载体及相应的空载体，荧光观察结果提示病毒转染成功。同时，对相应细胞进行蛋白层面的检测，结果显示，单纯LPS刺激后细胞中FAM134B蛋白表达较单纯PBS刺激明显升高；敲减 FAM134B后，无论是LPS刺激还是PBS刺激后细胞中FAM134B蛋白表达均较未敲减 FAM134B细胞显著下降；但敲减 FAM134B后，经LPS刺激与PBS刺激细胞中FAM134B蛋白表达相近。虽未能通过PCR技术进一步验证，但该结果可提示病毒载体已经结合到细胞基因组中，并能有效地抑制细胞中 FAM134B基因的转录与表达。同时，FAM134B蛋白作为介导内质网自噬的关键受体，干扰其表达即可影响细胞中内质网自噬的活化，因此本研究选择给予敲减 FAM134B基因细胞相应刺激后，直接观察细胞的凋亡情况。Hoechst33258染色与流式细胞术结果提示，敲减 FAM134B的表达可进一步加剧LPS诱导的细胞凋亡。上述结果表明，FAM134B介导内质网自噬对LPS诱导细胞凋亡具有潜在抑制效应。但于此过程中观察到在干扰 FAM134B表达后，细胞在未受LPS刺激下即存在凋亡增多的现象，因此仍需进一步探究细胞正常状态下FAM134B介导的内质网自噬对细胞凋亡的影响。此外，敲减 FAM134B并经LPS刺激后，细胞中凋亡相关蛋白剪切型caspase-3与Bax/Bcl-2比值显著升高，提示脓毒症时内质网自噬功能受损，可激活线粒体凋亡途径，进而促进细胞的死亡 ［ 20］ 。
值得说明的是，本研究未深入探究FAM134B介导内质网自噬缓解DC凋亡的确切信号途径，存在一定局限性。但本研究仅为阶段性工作，之后将进一步聚焦FAM134B调控DC凋亡的具体分子机制，深入探讨FAM134B介导内质网自噬与内质网应激、内质网钙离子稳态和STING信号通路之间的关系，以及内质网应激、内质网钙离子稳态和STING信号通路对DC凋亡发生的潜在影响，并进一步了解FAM134B作为调控脓毒症免疫抑制状态的潜在干预靶点的可能性。
本研究表明，脓毒症早期DC中FAM134B介导的内质网自噬明显活化，并可显著抑制细胞凋亡的发生，但其确切信号通路和关键调控环节尚待澄清。深刻认识脓毒症状态下FAM134B介导内质网自噬对免疫细胞，特别是DC凋亡的影响，将为丰富脓毒症免疫调理策略开辟新途径。
张曼佳：数据整理、论文撰写；毛书雷、张建芬：采集数据、分析数据；王新刚、张元海：撰写指导、论文修改；倪良方：数据整理、统计分析所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 例1右手第1~5指中质量分数氢氟酸烧伤患者情况。1A、1B.分别为伤后30 h，右手背侧、掌侧，第1~5指有水疱，第2~4指指甲呈暗紫色；1C、1D.分别为伤后31 h，右手背侧、掌侧，剪除水疱，拔除受累指甲后，基底呈灰褐色，指尖发黑；1E、1F.分别为伤后7 d，右手背侧、掌侧，第2~4指末节呈黑色干性坏死；1G.伤后20 d，带蒂腹部皮瓣血运良好；1H.伤后35 d，遗留第2~5指短缩
2 例2左手示指高质量分数氢氟酸烧伤患者情况。2A.伤后5 h，左手示指表皮呈苍白色；2B.伤后12 h，剪除水疱皮后，创面基底红润；2C.伤后5 d，创面部分愈合；2D.伤后30 d，创面未遗留瘢痕
表1 229例手部氢氟酸烧伤患者按是否行手术治疗和有无瘢痕后遗症分类的一般资料
项目与类别 例数 手术治疗 瘢痕后遗症 是 否 有 无 性别 男 206 30（14.6） 176（85.4） 74（35.9） 132（64.1） 女 23 6（26.1） 17（73.9） 9（39.1） 14（60.9） 年龄（岁） <45 127 20（15.7） 107（84.3） 48（37.8） 79（62.2） ≥45 102 16（15.7） 86（84.3） 35（34.3） 67（65.7） 所在企业类型 氟化工 63 1（1.6） 62（98.4） 11（17.5） 52（82.5） 非氟化工 166 35（21.1） 131（78.9） 72（43.4） 94（56.6） 氢氟酸质量分数 低 21 1（4.8） 20（95.2） 9（42.9） 12（57.1） 中 50 18（36.0） 32（64.0） 26（52.0） 24（48.0） 高 20 1（5.0） 19（95.0） 4（20.0） 16（80.0） 不详 138 16（11.6） 122（88.4） 44（31.9） 94（68.1） 院前时间（h） <24 147 2（1.4） 145（98.6） 18（12.2） 129（87.8） ≥24 82 34（41.5） 48（58.5） 65（79.3） 17（20.7） 低钙血症 有 2 1/2 1/2 2/2 0 无 227 35（15.4） 192（84.6） 81（35.7） 146（64.3） 低镁血症 有 3 0 3/3 0 3/3 无 226 36（15.9） 190（84.1） 83（36.7） 143（63.3） 注：除有低钙血症、有低镁血症患者的数据外，其余数据表达形式为例（%）；氢氟酸质量分数低为<20%、中为20%~50%、高为>50% 
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表2 影响229例手部氢氟酸烧伤患者手术治疗的单因素和多因素logistic回归分析结果
因素与分类 单因素分析 多因素分析 比值比 95%置信区间 P值 比值比 95%置信区间 P值 性别 男 1.00 — — — — — 女 2.07 0.76~5.67 0.157 — — — 年龄（岁） <45 1.00 — — — — — ≥45 1.06 0.52~2.17 0.873 — — — 所在企业类型 氟化工 1.00 — — 1.00 — — 非氟化工 7.86 1.83~33.76 0.006 3.85 0.80~18.54 0.093 院前时间（h） <24 1.00 — — 1.00 — — ≥24 51.35 11.89~221.78 <0.001 43.00 9.89~187.03 <0.001 注：比值比为1.00表示参照组；“—”表示无此项
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表3 影响91例氢氟酸质量分数已知的手部氢氟酸烧伤患者手术治疗的单因素和多因素logistic回归分析结果
因素与分类 单因素分析 多因素分析 比值比 95%置信区间 P值 比值比 95%置信区间 P值 性别 男 1.00 — — — — — 女 1.20 0.22~6.48 0.829 — — — 年龄（岁） <45 1.00 — — — — — ≥45 1.33 0.49~3.64 0.574 — — — 所在企业类型 氟化工 1.00 — — 1.00 — — 非氟化工 9.10 1.15~72.25 0.037 2.06 0.18~23.43 0.561 氢氟酸质量分数 中 1.00 — — 1.00 — — 低 11.25 1.39~90.93 0.023 11.51 1.22~108.26 0.033 高 10.69 1.32~86.59 0.026 1.79 0.14~22.84 0.654 院前时间（h） <24 1.00 — — 1.00 — — ≥24 0.04 0.01~0.19 <0.001 0.04 0.01~0.25 <0.001 注：氢氟酸质量分数低为<20%、中为20%~50%、高为>50%；比值比为1.00表示参照组；“—”表示无此项
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表4 影响229例手部氢氟酸烧伤患者瘢痕后遗症的单因素和多因素logistic回归分析结果
因素与分类 单因素分析 多因素分析 比值比 95%置信区间 P值 比值比 95%置信区间 P值 性别 男 1.00 — — — — — 女 1.15 0.47~2.78 0.762 — — — 年龄（岁） <45 1.00 — — — — — ≥45 0.93 0.54~1.61 0.807 — — — 所在企业类型 氟化工 1.00 — — 1.00 — — 非氟化工 3.62 1.76~7.43 <0.001 1.99 0.81~4.91 0.133 院前时间（h） <24 1.00 — — 1.00 — — ≥24 27.40 13.25~56.68 <0.001 24.55 11.78~51.16 <0.001 注：比值比为1.00表示参照组；“—”表示无此项
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表5 影响91例氢氟酸质量分数已知的手部氢氟酸烧伤患者瘢痕后遗症的单因素和多因素logistic回归分析结果
因素与分类 单因素分析 多因素分析 比值比 95%置信区间 P值 比值比 95%置信区间 P值 性别 男 1.00 — — — — — 女 0.77 0.18~3.27 0.719 — — — 年龄（岁） <45 1.00 — — — — — ≥45 0.97 0.42~2.26 0.939 — — — 所在企业类型 氟化工 1.00 — — 1.00 — — 非氟化工 0.32 0.11~0.92 0.034 0.80 0.18~3.51 0.766 氢氟酸质量分数 中 1.00 — — 1.00 — — 低 0.64 0.23~1.79 0.393 0.82 0.18~3.81 0.800 高 0.21 0.06~0.73 0.014 1.21 0.23~6.43 0.820 院前时间（h） <24 1.00 — — 1.00 — — ≥24 36.80 11.03~122.79 <0.001 37.71 9.97~142.69 <0.001 注：氢氟酸质量分数低为<20%、中为20%~50%、高为>50%；比值比为1.00表示参照组；“—”表示无此项
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表6 影响229例手部氢氟酸烧伤患者创面愈合天数的单因素和多因素线性回归分析结果
因素与分类 单因素分析 多因素分析 β值 95%置信区间 P值 β值 95%置信区间 P值 性别 男 0 — — — — — 女 0.81 -3.49~5.10 0.712 — — — 年龄（岁） <45 0 — — — — — ≥45 1.61 -0.98~4.21 0.222 — — — 所在企业类型 氟化工 0 — — 0 — — 非氟化工 6.16 3.38~8.93 <0.001 2.81 0.50~5.13 0.018 院前时间（h） <24 0 — — 0 — — ≥24 12.83 10.72~14.93 <0.001 12.16 10.00~14.31 <0.001 注：β值为0表示参照组；“—”表示无此项
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表7 影响91例氢氟酸质量分数已知的患者的手部氢氟酸烧伤患者创面愈合天数的单因素和多因素线性回归分析结果
因素与分类 单因素分析 多因素分析 β值 95%置信区间 P值 β值 95%置信区间 P值 性别 男 0 — — — — — 女 -2.09 -9.75~5.56 0.589 — — — 年龄（岁） <45 0 — — 0 — — ≥45 3.85 -0.54~8.24 0.085 3.16 -0.46~6.78 0.086 所在企业类型 氟化工 0 — — 0 — — 非氟化工 7.12 2.43~11.81 0.003 2.47 -1.97~6.91 0.273 氢氟酸质量分数 中 0 — — 0 — — 低 -5.63 -10.59~-0.68 0.026 -4.11 -8.54~-0.32 0.068 高 -9.74 -14.78~-4.70 <0.001 -5.84 -10.59~-1.08 0.017 院前时间（h） <24 0 — — 0 — — ≥24 13.50 10.14~16.86 <0.001 0.09 0.05~0.12 <0.001 注：氢氟酸质量分数低为<20%、中为20%~50%、高为>50%；β值为0表示参照组；“—”表示无此项
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