Effects of methacrylic anhydride gelatin hydrogel loaded with silver and recombinant human basic fibroblast growth factor on deep partial-thickness burn wounds in rabbits
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摘要:
目的 探讨负载银和重组人碱性成纤维细胞生长因子（rh-bFGF）的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶对兔深Ⅱ度烧伤创面的影响。 方法 采用实验研究方法。制备含不同浓度甲基丙烯酸酐（MA）的低浓度MA明胶（GelMA）材料、中浓度GelMA材料和高浓度GelMA材料，加入光引发剂后分别制得低浓度GelMA水凝胶、中浓度GelMA水凝胶和高浓度GelMA水凝胶。采用核磁共振波谱仪检测前述3种浓度GelMA材料的氢核磁共振谱并根据波谱图计算其取代度，采用场发射扫描电子显微镜（FESEM）检测前述3种浓度GelMA水凝胶的三维微观结构及孔径，样本数均为9。根据前述筛选出的MA浓度合成含10种浓度银的GelMA（含银GelMA）溶液，将每种浓度的含银GelMA溶液均分为3份，加入光引发剂后分别暴露于紫外光下持续20、25、35 s，制得相应的含银GelMA水凝胶。采用胶原酶降解法测定不同光交联时间含银GelMA水凝胶降解12、24、36、48 h的降解剩余率及彻底降解所需时长，样本数为5。测定前述筛选出光交联时间下含10种浓度银GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径反映其抑菌能力，样本数均为5。以与含最低浓度银（即不含银）GelMA水凝胶抑菌圈直径相比有统计学意义的含银GelMA水凝胶为有抑菌活性。选取具有抑菌活性的且载药浓度最低的含银GelMA水凝胶，采用FESEM检测其三维微观结构及孔径，采用能谱仪检测其内部银元素的存在情况，样本数均为9。将冻干单纯GelMA水凝胶和冻干含银GelMA水凝胶分别浸没于磷酸盐缓冲液中24 h，通过称重法计算并比较2种水凝胶的溶胀率，样本数为5。根据预实验及前述实验结果，制备含银和rh-bFGF的GelMA水凝胶（简称复合水凝胶）。大体观察复合水凝胶的外观，并采用FESEM检测其三维微观结构与孔径。取30只4~6个月龄、雌雄各半日本大耳兔，在其背部制作深Ⅱ度烧伤创面。以兔头侧为基准，将脊柱左侧创面作为复合水凝胶治疗组，右侧作为纱布对照组，2组创面分别作相应处理。观察伤后3、7、14、21、28 d创面愈合情况；记录伤后7、14、21、28 d创面愈合面积并计算其愈合率，样本数为30。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、独立样本t检验。 结果 低浓度GelMA材料、中浓度GelMA材料及高浓度GelMA材料的取代度，差异明显（F=1 628.00，P<0.01）。低浓度GelMA水凝胶存在疏松、不规则三维空间网状结构，孔径为（60±17）μm；中浓度GelMA水凝胶的三维空间网络、孔径大小均较均匀规则，孔径为（45±13）μm；高浓度GelMA水凝胶的三维空间网状结构致密、层次混乱，孔径为（25±15）μm。3种GelMA水凝胶孔径大小差异有统计学意义（F=12.20，P<0.01），选取（MA）中浓度为后续材料制作浓度。相同光交联时间下的含不同浓度银GelMA水凝胶的降解性基本一致；20、25、35 s光交联时间下含银GelMA水凝胶降解12 h的降解剩余率分别为（74.2±1.7）%、（85.3±0.9）%、（93.2±1.2）%，降解24 h的降解剩余率分别为（58.3±2.1）%、（65.2±1.8）%、（81.4±2.6）%，降解36 h的降解剩余率分别为（22.4±1.9）%、（45.2±1.7）%、（68.1±1.4）%，降解48 h的降解剩余率分别为（8.2±1.7）%、（32.4±1.3）%、（54.3±2.2）%；20、25、30 s光交联时间下含银GelMA水凝胶彻底降解所需时间分别为（50.2±2.4）、（62.4±1.4）、（72.2±3.2）h，差异有统计学意义（F=182.40，P<0.01），选取25 s作为后续光交联时间。低浓度至高浓度的10种含银GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径依次为（2.6±0.4）、（2.5±0.4）、（3.2±0.4）、（12.1±0.7）、（14.8±0.7）、（15.1±0.5）、（16.2±0.6）、（16.7±0.5）、（16.7±0.4）、（16.7±0.6）mm，基本呈浓度依赖性升高趋势，总体比较差异有统计学意义（F=428.70，P<0.01），与含最低浓度银GelMA水凝胶相比，其他有抑菌活性的含低浓度至高浓度银GelMA水凝胶的抑菌圈直径均明显增大（t值分别为26.35、33.84、43.65、42.17、49.24、55.74、43.72，P<0.01）。对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为（12.1±0.7）mm的含银GelMA水凝胶具有抑菌活性且载药浓度最低，选取该含银浓度为后续材料制作浓度。含银GelMA水凝胶的微观形貌为规律的趋于平行线性的条索状结构，孔径为（45±13）μm，且含有银元素。浸没24 h，含银GelMA水凝胶的溶胀率与单纯GelMA水凝胶相近（P>0.05）。复合水凝胶呈无色清亮透明状；其三维结构为规则、均匀的网格状，内部存在细丝网状结构，孔径为（40±21）μm。伤后3 d，复合水凝胶组兔创面可见大量坏死组织及渗出物；纱布对照组兔创面可见散在结痂，亦可见少量坏死组织及渗出物。伤后7 d，复合水凝胶组兔创面已明显缩小，纱布对照组兔出现创面存在与纱布粘连情况。伤后14 d，复合水凝胶组兔创面红润、可见肉芽组织生长；纱布对照组兔创面基底呈苍白色、血运差。伤后21 d，复合水凝胶组兔创面完全愈合，纱布对照组兔创面出现愈合趋势。伤后28 d，复合水凝胶组兔创面部位可见新生毛发，纱布对照组兔仍残存椭圆形创面。伤后7、14、21、28 d，复合水凝胶组兔创面愈合率均明显大于纱布对照组（t值分别为2.24、4.43、7.67、7.69，P<0.05或P<0.01）。 结论 中浓度GelMA水凝胶在溶胀性、可降解性方面具有良好的理化特性，筛选出的含银GelMA水凝胶具有抑菌活性且载药浓度最低，制得的复合水凝胶可明显缩短兔深Ⅱ度烧伤创面愈合时间。 Abstract:Objective To investigate the effects of methacrylic anhydride gelatin (GelMA) hydrogel loaded with silver and recombinant human basic fibroblast growth factor (rh-bFGF) on deep partial-thickness burn wounds in rabbits. Methods The experimental research method was adopted. Low-concentration GelMA materials, medium-concentration GelMA materials and high-concentration GelMA materials containing different concentrations of methacrylic anhydride (MA) were prepared, after adding photoinitiator, low-concentration GelMA hydrogels, medium-concentration GelMA hydrogels, and high-concentration GelMA hydrogels were obtained, respectively. The nuclear magnetic resonance spectroscopy was performed to detect the hydrogen nuclear magnetic resonance spectra of the above-mentioned three concentrations of GelMA materials, and to calculate the degree of substitution according to the spectrum diagram. The three-dimensional microstructure and pore size of 3 types of above-mentioned GelMA hydrogels were detected by field emission scanning electron microscopy (FESEM), with 9 samples measured. According to the selected concentration of MA, ten kinds of solutions of GelMA with different concentration of silver (silver-containing GelMA) were synthesized, and the silver-containing GelMA solution of each concentration was divided into three parts, and then exposed to ultraviolet light lasting for 20, 25, and 35 s, respectively. After adding photoinitiator,the corresponding silver-containing GelMA hydrogels were obtained. The residual degradation rate of silver-containing GelMA hydrogel with different photocrosslinking times was detected by collagenase degradation method at degradation of 12, 24, 36, and 48 h; and the time required for complete degradation was detected, and the sample number was 5. The inhibition zone diameter of GelMA hydrogel under above screened photocrosslinking times containing 10 concentrations of silver against Staphylococcus aureus was measured to reflect its antibacterial ability, and the sample numbers were all 5. The silver-containing GelMA hydrogel with statistical significance compared with the antibacterial circle diameter of the silver-containing GelMA hydrogel containing the lowest concentration (no silver) was considered as having antibacterial activity. The three-dimensional microstructure and pore size of the silver-containing GelMA hydrogels with antibacterial activity and the lowest drug concentration selected were detected by FESEM, and the sample numbers were all 9. The freeze-dried alone GelMA hydrogel and the freeze-dried silver-containing GelMA hydrogel were soaked in phosphate buffer solution for 24 h, respectively, then the swelling rate of the two GelMA hydrogel were calculated and compared by weighing method, and the sample number was 5. GelMA hydrogel containing silver and rh-bFGF, namely compound hydrogel for short, was prepared according to the preliminary experiment and the above experimental results. The appearance of the composite hydrogel was observed in general, and its three-dimensional microstructure and pore size were detected by FESEM. The deep partial-thickness burn wound was made on the back of 30 rabbits (aged 4-6 months, female half and half). Meanwhile, with the rabbit head as the benchmark, the wounds on the left side of the spine were treated as composite hydrogel treatment group, and the wounds on the right side were treated as gauze control group, and which were treated accordingly. On post injury day (PID) 3, 7, 14, 21, and 28, the healing of wounds in the two groups was observed. On PID 7, 14, 21, and 28, the wound healing area was recorded and the healing rate was calculated, with a sample number of 30. Data were statistically analyzed with analysis of variance for repeated measurement, one-way analysis of variance, and independent sample t test. Results The substitution degree among low-concentration GelMA materials, medium-concentration GelMA materials, and high-concentration GelMA materials was significantly different (F=1 628.00, P<0.01). The low-concentration GelMA hydrogel had a loose and irregular three-dimensional spatial network structure with a pore size of (60±17) μm; the medium-concentration GelMA hydrogel had a relatively uniform three-dimensional spatial network and pore size with a pore size of (45±13) μm; the high-concentration GelMA hydrogel had the dense and disordered three-dimensional spatial network with a pore size of (25±15) μm, the pore sizes of 3 types of GelMA hydrogels were significantly differences (F=12.20, P<0.01), and medium concentration of MA was selected for the concentration of subsequent materials. The degradability of silver-containing GelMA hydrogels with different concentrations of the same photocrosslinking time was basically same. The degradation residual rates of silver-containing GelMA hydrogels with 20, 25, and 35 s crosslinking time at 12 h were (74.2±1.7)%, (85.3±0.9)%, and (93.2±1.2)%, respectively; the residual rates of degradation at 24 h were (58.3±2.1)%, (65.2±1.8)%, and (81.4±2.6)%, respectively; the residual rates of degradation at 36 h were (22.4±1.9)%, (45.2±1.7)%, and (68.1±1.4)%, respectively; the residual rates of degradation at 48 h were (8.2±1.7)%, (32.4±1.3)%, and (54.3±2.2)%, respectively, and 20, 25, and 30 s photocrosslinking time required for complete degradation of silver-containing GelMA hydrogels were (50.2±2.4), (62.4±1.4), and (72.2±3.2) h, and the difference was statistically significant (F=182.40, P<0.01), 25 s were selected as the subsequent photocrosslinking time. The antibacterial diameters of 10 types of silver-containing GelMA hydrogels against Staphylococcus aureus from low to high concentrations were (2.6±0.4), (2.5±0.4), (3.2±0.4), (12.1±0.7), (14.8±0.7), (15.1±0.5), (16.2±0.6), (16.7±0.5), (16.7±0.4), and (16.7±0.6) mm, respectively, and which basically showed a concentration-dependent increasing trend, and the overall difference was statistically significant (F=428.70, P<0.01). Compared with the silver-containing GelMA hydrogel with the lowest concentration, the antibacterial circle diameters of other silver-containing GelMA hydrogels with antibacterial ability from low to high concentration were significantly increased (with t values of 26.35, 33.84, 43.65, 42.17, 49.24, 55.74, and 43.72, respectively, P<0.01). The silver-containing GelMA hydrogel with the antibacterial diameter of (12.1±0.7) mm had the lowest antibacterial activity against Staphylococcus aureus and the lowest drug loading concentration, and the concentration of silver was selected for the concentration of subsequent materials. The microscopic morphology of the silver-containing GelMA hydrogel containing silver element with a pore size of (45±13) μm had a regular and linear strip-like structure. After soaking for 24 h, the swelling ratio of silver-containing GelMA hydrogel was similar to that of alone GelMA hydrogel. The composite hydrogel was colorless, clear and transparent, and its three-dimensional microstructure was a regular and uniform grid, with a filament network structure inside, and the pore size of (40±21) μm. On PID 3, a large amount of necrotic tissue and exudate of rabbit wound in composite hydrogel group were observed, and scattered scabs, a small amount of necrotic tissue and exudate of rabbit wound in gauze control group were observed. On PID 7, the area of rabbit wound in composite hydrogel group was significantly reduced, and adhesion of rabbit wound and gauze in gauze control group was observed. On PID 14, In composite hydrogel group, the rabbit wound surface was ruddy, and the growth of granulation tissue was observed, and in gauze control group, the rabbit wound base was pale, and the blood supply was poor. On PID 21, the rabbit wounds in composite hydrogel group healed completely, and rabbit wound in gauze control group had healing trend. On PID 28, new hair could be seen on rabbit wound surface in composite hydrogel group; oval wound of rabbit in gauze control group still remained. On PID 7, 14, 21, and 28, the wound healing areas of rabbit in composite hydrogel group were significantly larger than those in gauze control group (with t values of 2.24, 4.43, 7.67, and 7.69, respectively, P<0.05 or P<0.01). Conclusions The medium-concentration GelMA hydrogel has good physical and chemical properties in terms of swelling and degradability. The screened silver-containing GelMA hydrogels had the lowest antibacterial activity and the lowest drug loading concentration. Composite hydrogel can significantly shorten the healing time of deep partial-thickness burn wounds in rabbits. -
Key words:
- Bandages, hydrocolloid /
- Fibroblast growth factors /
- Wound healing /
- Skin /
- Methacrylic anhydride gelatin /
- Nanosilver
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(1)重点关注创面修复中细胞治疗的新方法、新技术、新材料、新应用，跟进其从实验室到临床前研究的最新进展。
(2)解析现阶段将细胞治疗应用于临床创面修复的困境，探讨细胞制品制备与质量标准体系建设的重点与难点，期待实现细胞治疗的有效临床转化。
Highlights:
(1)This article focused on new methods, technologies, materials, and applications of cell therapy in wound repair, and followed up the latest progress from laboratory to preclinical research.
(2)It analyzed the current dilemma in applying cell therapy to wound repair at clinical settings, discussed the key points and difficulties in the preparation and quality standard system construction of cell products, and expected to realize the clinical translation of cell therapy.
皮肤是人体最大的器官，由多种细胞和ECM构成，并通过细胞间以及细胞与ECM间的相互调控实现皮肤复杂的生理功能。烧创伤创面等急性创面可导致皮肤组织细胞群丢失、皮肤结构和功能的完整性破坏，糖尿病足溃疡、下肢静脉溃疡、压力性溃疡等慢性创面可致干/祖细胞、Fb和KC等创面愈合中的关键细胞群生物学功能异常。细胞治疗指将具有某些特定功能的自体或同种异体细胞以及细胞活性成分递送到患者体内，利用其多种生物学功能修复和重建由外伤或疾病引起的组织和器官结构损害或缺损，从而恢复机体生理功能的治疗方式。1975年Rheinwald和Green ［ 1］ 成功从人皮肤组织中分离培养出KC，而后有学者将培养的人KC膜片作为表皮替代物用于治疗严重烧伤患者创面，开创了创面修复领域细胞治疗的时代 ［ 2, 3］ 。近年来，细胞生物学、免疫学、材料科学等学科的迅速发展，为加速细胞治疗进入临床应用带来了机遇。
1. 用于创面治疗的细胞类型
细胞治疗的本质是通过自体细胞增殖、迁移、分化等功能发挥“替代”受损细胞和组织作用，或是利用自体或同种异体细胞在机体内的“旁分泌”作用，即通过分泌的生长因子、炎症介质、ECM等活性成分发挥调控作用。创面愈合过程中，中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞通过改变创面微环境，发挥协助、启动创面愈合和调控后续修复过程的作用；KC和Fb等创面修复细胞以及处于体液循环的干/祖细胞则是在组织形成阶段完成皮肤组织修复和功能重建。
1.1 KC
KC约占表皮细胞总数的80%。培养自体表皮移植（cultured epithelial autograft，CEA）膜片在20世纪80年代就已开始应用于临床。有研究者将CEA膜片用于大面积烧伤创面的治疗，结果显示膜片成活率可达72.7%，从而使得患者生存率达91% ［ 4］ 。该研究还显示，由于缺乏真皮成分和结构的支持，移植单纯CEA膜片后创面基底膜结构形成不良，并且创面易出现水疱、破溃等。以纤维蛋白作为培养表皮支架的方法可在一定程度上改善创面的愈合质量，但其效果远不如移植自体刃厚皮（网状）。故移植CEA膜片时，需联合刃厚微小皮片、刃厚网状自体皮片等以满足愈合皮肤的生理功能需要。此外，较长的体外培养周期和高昂的培养成本亦限制了CEA膜片的临床应用 ［ 5］ 。
为解决自体细胞体外培养周期长的问题，一项收集、处理和输送自体皮肤细胞用以创面治疗的技术——ReCell技术，近年面世并被用于临床，现已用于烧伤创面、瘢痕、色素异常性皮肤疾病的治疗。ReCell技术可在术中收集患者约4 cm 2大小正常皮肤，经过消化、分离获得以KC为主且同时含有Fb、朗格汉斯细胞和黑色素细胞等的细胞悬液，用于约320 cm 2大小创面的治疗。ReCell技术可单独用于烧伤创面，加速浅Ⅱ度烧伤创面愈合 ［ 6］ ，也可以作为自体皮肤移植的辅助手段。一项评估ReCell技术联合网状自体皮片移植在创面治疗中的安全性和有效性的随机对照研究（临床试验注册号：NCT04091672）显示，该技术可明显改善创面愈合质量 ［ 7］ 。基于前述研究结果，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）已将ReCell技术的适用范围扩大到全层皮肤缺损创面的治疗。笔者在临床实践中观察到，利用ReCell技术结合网状自体皮片移植修复深Ⅱ度烧伤创面后，皮肤的弹性、瘢痕增生程度等均优于单纯使用网状自体皮片移植。
相较于自体KC，同种异体KC有较强的抗原性，移植后会引发排异反应 ［ 8］ 。KC移植后可分泌VEGF、TGF、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等多种生长因子，诱导创面再上皮化、调节免疫应答，发挥促愈作用。近年来，有较多以自体或同种异体KC来修复创面的细胞制品问世，例如用自体毛囊外根鞘来源的KC制作的细胞膜片EpiDex ®已被美国FDA批准用于治疗静脉溃疡 ［ 9］ ，其促愈机制多为细胞制品通过旁分泌组分发挥作用。
1.2 Fb
Fb可分泌VEGF、PDGF、TGF-β 1和IL-8等生长因子和炎症介质，参与调节细胞与细胞以及细胞与ECM间的相互作用。体外培养的真皮Fb经长期低温保存仍可保持相当高的细胞活性和产生多种细胞因子的能力，使其在细胞治疗中具有独特优势。培养的自体Fb已被用于治疗烧伤创面 ［ 10］ 、大疱性表皮松解症 ［ 11］ 以及整形外科创面 ［ 12］ 等。自体Fb鲜有感染或免疫反应风险，但较长的培养期限制了其临床应用。目前利用Fb或其衍生物促进创面愈合的细胞制品的来源多为同种异体冷冻细胞。同种异体真皮Fb和KC联合培养的细胞膜片StrataGraft ®已被应用于临床研究。有研究显示，该膜片与自体皮片移植修复创面的效果相当，且前者用于创面后无明显免疫排斥反应 ［ 13］ 。目前该膜片已获美国FDA批准，用于治疗成人深Ⅱ度烧伤创面。鉴于创面微环境的复杂性，采用多种体细胞较单一体细胞治疗创面无疑更符合细胞生物学的需求。
1.3 干/祖细胞
终末分化细胞的多向分化和自我更新能力有限，无法实现对神经、皮肤附属物和色素细胞等皮肤重要成分的修复，而干/祖细胞可弥补前述不足。
1.3.1 间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）
MSC来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，可在特定条件下被诱导分化为脂肪细胞、血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）、血管平滑肌细胞、Fb、KC等。此外，MSC不表达Ⅱ类主要组织相容性复合体分子，因而同种异体MSC移植后发生免疫排斥的风险小；MSC具有来源丰富、提取方便、体外扩增容易、可通过工程化手段进一步修饰其细胞功能等特点，这使其成为具有临床应用前景的创面修复种子细胞之一。目前，骨髓、脂肪、胎盘和脐带来源的MSC较多被应用于创面的细胞治疗。
移植后的MSC可通过2种机制发挥作用：（1）直接或诱导分化为特定类型细胞。MSC可促进毛囊、汗腺和其他皮肤附属物的形成，如将MSC移植至裸鼠创面中可显著促进受损汗腺的修复和再生 ［ 14］ 。（2）促愈合调控作用。即通过与其他细胞的直接接触，或通过分泌多种活性物质［细胞外囊泡（extracellular vesicle， EV）、生长因子等活性因子］，以旁分泌机制发挥促愈合调控作用。移植后的MSC可通过免疫调控 ［ 15］ 、促血管新生 ［ 16］ ，加速再上皮化和表皮分化 ［ 17］ ，诱导多种祖细胞分化、释放促愈合生物活性因子，加速创面愈合，并参与调节ECM重塑 ［ 18］ 。已有多项临床研究将MSC用于急性创面 ［ 19］ 、烧伤创面 ［ 20］ 、糖尿病足溃疡 ［ 21］ 和放射性烧伤创面 ［ 22］ 等的治疗。一项应用骨髓来源MSC治疗3例骶骨压疮患者创面（临床试验注册号：NCT00535548）的研究显示，治疗侧的创面较仅用生理盐水处理的对照侧创面愈合速率显著增快 ［ 23］ 。
MSC具有响应不同微环境并发生特异性分化的能力，如缺血、炎症微环境可直接影响植入MSC的存活、增殖能力并可能致细胞死亡，糖尿病、肥胖和衰老等“病态”创面微环境可致MSC分化不良 ［ 24］ ，定植细菌的创面 ［ 25］ 、存在血流动力学障碍的创面等 ［ 26］ 均可致MSC植入成活率下降，甚至失败。深入探索MSC向靶组织迁移的机制可能与了解其特定的分化条件同等重要，因此应对移植后的MSC进行长期监测以确保其发挥有益效应。但目前鲜有评估创面应用MSC后的“植入率”的相关研究。尤其需要重视的是，干细胞的多向分化能力，即其可塑性是一把双刃剑，不稳定的细胞表型可致组织结构和/或功能发生病理性改变，甚至成瘤。未来的研究应关注对细胞分子特征和表型的鉴定，以及对细胞分离和扩增过程的调控，从而实现对MSC增殖或分化方向的准确控制。
1.3.2 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）
iPSC是由2位日本科学家于2006年首次提出，他们使用反转录病毒重编程小鼠胚胎Fb基因，从而产生了iPSC ［ 27］ 。有研究者通过基因手段将成人Fb诱导成iPSC ［ 28］ 。至今，Fb、毛发KC、脐带血细胞和成体干细胞等多种成人体细胞均已被诱导成iPSC。iPSC具有与胚胎干细胞相似的极大的分化潜能，理论上可以分化成机体所有细胞和组织，而目前已报道iPSC可被诱导成表皮干细胞、MSC、黑色素细胞以及构成毛囊的所有细胞谱系 ［ 29］ 。2013年，Itoh等 ［ 30］ 用来自人Fb的iPSC构建出同时含Fb和KC的三维皮肤，该皮肤含有由Fb分泌的Ⅶ型胶原，可用于治疗因Ⅶ型胶原基因缺陷导致的营养不良性大疱性表皮松解症。在多种临床前创面模型中，iPSC被用于糖尿病创面 ［ 31］ 、烧伤创面 ［ 32］ 、急性全层皮肤缺损创面 ［ 33］ 的治疗。由内皮祖细胞诱导的iPSC可明显加快链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的愈合 ［ 34］ 。有研究显示，iPSC衍生的KC可促进小鼠烧伤创面的再上皮化和无瘢痕愈合 ［ 32］ 。值得注意的是，与正常组织内的Fb相比，由iPSC分化而来的Fb和KC具有更强的增殖能力和ECM形成能力 ［ 35］ 。这可能与iPSC分化过程中细胞表观遗传特征发生改变有关。由于体内直接注射iPSC有诱导肿瘤发生的可能性，目前大多数研究侧重于诱导iPSC定向分化为明确的细胞谱系，用于创面修复。
iPSC源于宿主体细胞，移植后一般不会引发免疫反应，还可避免胚胎干细胞移植存在的伦理风险；iPSC的构建不受年龄和疾病的限制，多种成人体细胞均可用于构建iPSC。但由于诱导iPSC的过程需使用病毒载体，存在遗传不稳定性和潜在的免疫原性，故其安全性仍有待评估 ［ 36］ 。此外，现有的细胞纯化方法尚不能彻底分离不同分化程度的iPSC，故不能排除肿瘤形成风险，这也是iPSC临床应用中的伦理争议。
1.3.3 脂肪干细胞（adipose-derived stem cell，ADSC）
ADSC是一种具有多向分化潜能、较强增殖活性的MSC，可条件性分化为脂肪细胞、内皮细胞和神经细胞等。ADSC来源丰富、获取简单、易于分离，分离后的细胞具备培养条件简单、功能稳定、存活率高、免疫排斥少等优势，在皮肤修复领域具有很大的应用价值。目前已有ADSC应用于糖尿病足 ［ 37］ 、皮肤年轻化 ［ 38］ 和萎缩性痤疮瘢痕 ［ 39］ 等的临床研究。
ADSC同样可通过增殖、分化成皮肤细胞替代和修复受损、死亡的细胞，也可通过自分泌和旁分泌途径激活环境内其他细胞，从而发挥促愈功能。一方面，ADSC可迅速募集至受伤部位并分化为真皮Fb、VEC和KC，参与修复过程；另一方面，ADSC衍生的EV和可溶性因子（细胞因子和生长因子）可调控巨噬细胞表型转化、促进血管新生、ECM重塑，显著改善创面愈合过程。但体外扩增的ADSC寿命较短，限制了其临床应用。为了设计永生化的人源ADSC细胞系，有研究者将人类端粒酶基因转移至ADSC中，该研究显示高表达人类端粒酶的ADSC在体外传代17次后仍具有较强的增殖与多谱系分化能力 ［ 40］ 。工程永生化的ADSC可维持亲本细胞的干性，作为种子细胞用于创面修复具有良好的应用前景。笔者在临床实践中观察到，应用富集ADSC的脂肪联合刃厚皮移植修复创面后，创面质地、色素改变、皮脂分泌程度都明显优于单纯应用刃厚皮。
1.3.4 表皮干细胞
表皮干细胞（epidermal stem cell，ESC）来源于外胚层，主要分布于表皮基底层、毛囊隆突部和皮脂腺开口处，属专能干细胞，可分化为KC、毛囊和皮脂腺等，是创面修复细胞治疗中应用广泛的细胞种类之一。ESC可分为毛囊干细胞、滤泡间表皮干细胞及皮脂腺干细胞等类型。其中毛囊隆突部的ESC可向上迁移、分化形成皮脂腺，并不断地为表皮基底层提供干细胞；向下可为毛囊根部补充毛囊干细胞。这些隆突部的干细胞具有更缓慢的细胞周期以及较强的自我更新能力，在特定微环境下它们可表现出更强的干性，并被诱导分化成皮肤附属物 ［ 41］ 。若ESC缺失则显著影响皮肤的正常新陈代谢过程和皮肤创面修复。多项临床前或临床研究尝试利用ESC诱导皮肤再生的潜能、提供各类皮肤缺损创面的替代选择。ESC可分化为黑素细胞，用于人烧伤后皮肤色素脱失的治疗 ［ 42］ 。基因修饰的ESC可用于单纯性大疱性表皮松解症等遗传性皮肤病的治疗 ［ 43］ 。与空白对照相比，小鼠全层皮肤缺损创面局部注射同种异体ESC可显著促进再上皮化、毛发生长和血管新生 ［ 44］ ；与仅涂抹不含ESC的溶剂相比，移植ESC的患者腿部慢性溃疡创面愈合速度明显加快 ［ 45］ ；与无基因修饰的ESC相比，用 EGF或 caveolin- 1基因修饰的ESC促再上皮化、Fb增殖和创面修复的能力显著增强 ［ 46］ 。ESC的临床应用同样受到细胞存活率低、损耗率高、分化方向不确定等因素的限制；此外，缺乏真皮ECM支撑的ESC的功能及创面修复能力均不尽如人意。未来，有望借助细胞重编程、递送材料、生物医学工程等新兴技术解决上述问题。
2. 基于细胞治疗的新技术应用
2.1 小分子诱导细胞重编程
细胞重编程，指在特定的条件下诱导细胞进一步分化或者转分化，使其具有全能或多能的状态。通过核移植、细胞融合、小分子诱导以及分子调控等方式均可实现细胞重编程。其中小分子诱导细胞重编程具有效率高、细胞膜穿透性强、非基因组整合、操作简单等诸多优势。单一或组合小分子可实现对多个靶点和信号通路的同时调控，调整小分子浓度和作用时间还可以实现有序的细胞重编程。体外研究中，利用小分子诱导已可实现对KC ［ 47］ 、内皮细胞 ［ 48］ 和多种干细胞 ［ 49, 50］ 的重编程，例如降血脂药物辛伐他汀可诱导毛囊干细胞分化为KC，并通过抗氧化的双重作用加速创面愈合 ［ 47］ 。联合5-氮杂-2'-脱氧胞苷（DNA甲基转移酶抑制剂）、曲古抑菌素A（组蛋白脱乙酰酶抑制剂）和tideglusib（β-连环蛋白磷酸化抑制剂）可诱导Fb去分化为功能性内皮祖细胞 ［ 48］ 。这些研究提示了小分子诱导细胞重编程协助细胞治疗的可行性。但现有研究尚处于基础研究阶段，仍需探索更多可实现重编程的关键信号通路和有效手段。
2.2 细胞递送方式
局部应用和静脉注射等传统的细胞治疗递送方式，存在细胞存活率低、损耗率高以及缺乏细胞与ECM间的附着等局限性。如何为移植的细胞提供稳定的微环境，如探索多种细胞递送材料以携带和/或递送细胞、细胞因子/生长因子以及ECM成分等至相应的创面来模拟皮肤环境以支持和发挥细胞功能是亟待解决的问题。通过对生物材料的孔隙比、刚度、形貌、抗机械性等物理化学性能的调整可实现调节细胞生物化学信号通路，促进细胞黏附、增殖、迁移和分化，加速创面愈合和皮肤再生。目前广泛使用的细胞递送材料包括凝胶、真皮支架、三维生物打印敷料等。
2.2.1 凝胶
凝胶由单一或混合的水合聚合物组成，通过共价或非共价交联可控制其膨胀能力并维持构象。凝胶可以在特定pH值和离子强度的水环境中可逆地膨胀或收缩，维持创面湿润环境、减轻创面疼痛。包裹于凝胶中的细胞可被稳定递送至创面，参与创面修复过程且避免递送过程中受外界机械力影响 ［ 51］ 。有研究显示，注射负载有MSC和VEC的透明质酸凝胶可促进难治性糖尿病足溃疡愈合 ［ 52］ 。还有研究显示，由N-羧乙基壳聚糖、己二酸二酰肼与透明质酸醛合成的新型自修复凝胶，可通过刺激MSC分泌多种生长因子调节创面炎症，促进肉芽组织形成、胶原沉积和新生血管形成 ［ 53］ 。
2.2.2 真皮支架
皮肤真皮结构破坏是导致创面增生性瘢痕形成、皮肤功能障碍的关键因素。正常的真皮成分和三维空间结构可为VEC、Fb等细胞发挥生物学功能提供适宜的微环境。因此，真皮支架的构建应尽可能真实地模拟人真皮成分和空间结构。真皮支架主要以天然生物材料（ADM、变性真皮基质和瘢痕真皮基质）、生物合成材料（如透明质酸、壳聚糖和藻酸盐）和有机高分子材料（如聚乳酸-乙醇酸、聚酸酐、聚乙二醇等）为原料。真皮支架已被证明可以通过促进移植细胞的生物活性增强，改善患者创面修复情况 ［ 54］ 。此外，有研究显示由合成聚合物、基因工程肽或纳米纤维静电纺丝制成的多孔生物支架结构，具有高生物活性、生物相容性和生物降解性等特性 ［ 55］ 。
人工合成真皮支架可为多种创面中修复细胞的黏附、迁移和增殖提供ECM成分和结构支持，允许细胞借助支架成分和空间结构发生细胞与细胞、细胞与ECM间的相互作用，构建更接近天然皮肤特性的皮肤组织。人工合成真皮支架应具有一定的稳定性，目前临床应用商品化产品的在体稳定性一般在3周以上。此外，制备支架的材料应具有免疫相容性，不诱导明显的炎症和免疫反应；支架还应具有可以被生长因子、ECM等修饰的功能。目前国内外商品化人工合成真皮支架产品包括PELNAC ®、Lando ®、Biobrane ®、Dermagraft ®、Integra ®、Apligraft ®、Matriderm ®、Orcel ®、Hyalomatrix ®和Renoskin ®等，其中进口产品PELNAC ®和国内产品Lando ®目前已在国内临床得到广泛应用。
2.2.3 三维生物打印敷料
三维生物打印是一种新兴技术，它通过精确逐层沉积由活细胞、生物材料、蛋白质、多肽、激素、ECM分子和生长因子等生物活性成分组成的“生物墨水”至待修复组织部位，为制造高生物相容性的仿生皮肤提供新的策略。三维生物打印敷料用于创面修复的优势包括：（1）快速、高通量的自动化技术可实现对大面积创面的快速覆盖，减少时间和费用成本；（2）更灵活地将多种生物材料和细胞精确沉积在不同位置，利于创面，尤其是复杂创面的神经再生、色素沉着和血管形成，可针对不同类型的创面开发个性化治疗方法；（3）“生物墨水”的高生物相容性、生物降解性等使三维生物打印敷料具有良好的机械稳定性以及形状保持能力。现已开发了由皮肤Fb和KC ［ 56］ 、MSC ［ 57］ 和微VEC ［ 58］ 组成的多种三维生物打印敷料，用于治疗各种创面，如烧伤创面 ［ 59］ 、全层皮肤缺损创面 ［ 60］ 和糖尿病足溃疡 ［ 61］ 等。
应用各种生物墨水和种子细胞的皮肤三维生物打印敷料层出不穷，最初仅实现真皮层三维生物打印，随后开发了双层（真皮层和表皮层）三维生物打印和三层（表皮层、真皮层和皮下组织层）三维生物打印。将人源异种Fb和KC混合后以水凝胶为载体构建的包含真皮层和表皮层的双层三维生物打印敷料应用至大鼠全层皮肤缺损创面后，该材料表现出良好的生物相容性，且可加速创面再上皮化、减轻创面收缩程度 ［ 62］ 。有研究显示，混悬于ADM预凝胶“生物墨水”中的人源ADSC可显著增加裸鼠全层皮肤缺损创面微血管密度、毛细血管直径，缩短创面再上皮化时间 ［ 63］ 。
限制三维生物打印技术临床应用的关键在于目前对于皮肤组织的成分和三维结构、再生修复过程的调控机制等仍未完全了解。创面愈合的网络调控机制复杂，细胞与细胞、细胞与ECM、细胞与所处微环境中的各种物理化学因素与生物信息间的作用机制复杂，如果不能对这些因素有全面、深入的了解就不可能构建出完全符合人体皮肤结构和功能的三维生物打印皮肤。同时，由于缺乏针对不同皮肤层优化的定制“生物墨水”，目前的三维生物打印皮肤模型在模拟皮肤组织的异质性和复杂性方面也受到限制。此外，如何保持“生物墨水”的活性、保证打印方式的持续稳定以及所提供的细胞和其他活性成分能在损伤部位完成功能性皮肤组织的“自组装”以恢复损伤靶组织的功能仍是有待解决的问题。
3. 细胞衍生物治疗
近年来，研究者逐渐认识到细胞衍生物在细胞治疗损伤组织中发挥的重要作用。细胞衍生物包括多种生物活性因子，如蛋白质/活性肽（神经肽、趋化因子、生长因子和转录因子）、核酸（mRNA、微小RNA以及诸多非编码RNA）和脂质等，它们由细胞直接释放到细胞外或以双层EV的形式运输。细胞衍生物可作为细胞间交流信号，影响其周围环境中其他细胞的增殖、迁移、分化 ［ 64］ 、凋亡 ［ 65］ 、自噬 ［ 66］ 等功能，以调控免疫应答 ［ 67］ 、ECM重塑 ［ 68］ 、血管新生 ［ 69］ 以及微环境中氧化应激反应 ［ 70］ 等。细胞衍生物也可随体液循环分布到全身各处，发挥细胞间通讯作用，改变周围细胞的功能和代谢状态，激活内源性修复潜能。
与直接移植细胞相比，EV及细胞分泌的可溶性因子在临床应用方面具有更多优势：（1）它们体积较小、产量大、无免疫原性且不致瘤，具备更高的安全性。（2）EV可以在-80 ℃下长期储存，一旦有临床需求可直接应用，无须较长细胞培养周期。有研究显示，将人源ADSC-EV局部应用于糖尿病小鼠创面可促使M2型巨噬细胞数量增加，下调组织促炎介质IL-6、IL-1β、γ干扰素和TNF-α的表达 ［ 71］ 。有研究显示，在裸鼠创面模型中应用人源ADSC-EV可促进PDGF和VEGF的表达，从而在创面中可见更多具正常结构、成熟的毛囊 ［ 69］ 。还有研究显示，人源ADSC-EV亦可能通过调节创面中施万细胞的增殖活性来改善糖尿病周围神经病变情况 ［ 72］ 。
局部应用细胞衍生物具有稳定性欠佳、影响治疗效果的不足，而利用水凝胶、聚合物颗粒、纳米颗粒等药物递送系统可实现细胞衍生物的有效递送。研究显示，装载细胞分泌因子的水凝胶可明显改善大鼠烧伤创面的血管新生情况 ［ 73］ ；装载ADSC外泌体的pH响应、热敏、抗菌多糖创面敷料可明显加速糖尿病小鼠创面的血管化和愈合 ［ 74］ 。细胞衍生物治疗依然面临挑战，如各种细胞来源分泌物的组成和功能不确定，如何根据创面类型、大小和位置选择合适的递送策略，细胞衍生物的商品化生产标准、评价、监督流程等仍待研究完善。
4. 细胞治疗的局限性与展望
细胞治疗在创面修复中的发展前景已被大量临床前和临床研究证实，很可能成为未来解决大面积创面覆盖、增生性瘢痕防治、皮肤附属器官再生和神经修复的重要手段。细胞疗法的出现推动了多种可调控创面炎症反应、组织损伤及再生修复过程的治疗手段和策略的革新，将成为最有应用潜力的难愈性创面的治疗策略。但细胞治疗在临床大规模推广应用前仍有诸多尚未解决的问题。
目前人们尚不能准确掌握细胞在处理及递送过程中的活性、递送的组织特异性、组织微环境情况，以及细胞在体内的迁移、分布、代谢、活性状态及到达靶组织后的细胞命运等信息，因此很难对影响细胞治疗有效性的因素进行准确判断。细胞治疗的效果与局部创面对移植细胞的“接受率”有关。临床研究显示，细胞治疗在感染创面、部分慢性创面中的应用效果不佳 ［ 25］ 。另外，糖尿病等慢性疾病所导致的微环境改变，使得患者自体细胞功能异常 ［ 75］ ，为自体细胞治疗带来困难。因此在应用细胞治疗前需对创面情况进行评估，确定适合患者移植的细胞类型以及适宜的细胞递送方法。细胞治疗在人体创面的有效性仍需更多的临床研究支持。
生物安全风险是细胞治疗，尤其是干细胞治疗需关注的问题。干/祖细胞在创面局部微环境信号的刺激下可分化为多种细胞与组织，故仍存在干细胞分化失控的风险。目前可用于鉴别各类细胞的最佳生物标志物仍不明确，进一步增加了早期、准确判断此类风险的难度。在临床应用中，亦需警惕iPSC的遗传不稳定性、潜在的免疫原性和保留亲代细胞的表观遗传记忆性。此外，细胞标准化检测、应用和管理规范以及伦理规范制订对于细胞治疗的安全推广十分重要。对于细胞的采集、制备、保存、运输、供体跟踪，以及细胞的种类、数量、给药时间、给药方式、效果评估、不良反应监测等均应有明确的界定，以确保临床细胞治疗的安全、规范、有序进行。如何实现大规模生产和纯化、减少批次间差异以及检测分析的规范化需基于现有细胞研究成果，通过研究机构、生产企业和临床机构的协同合作，共同制订解决策略。降低生产成本也是细胞治疗推广应用的关键，通过移植细胞的规范化、工程化生产有望降低生产成本。
尽管仍有诸多困难，但细胞治疗的临床转化之路必会如旭日东升，为预料之中的事。
陈向军：研究设计、实施与论文撰写；吴兴、林欢欢、刘肇兴、刘沙：实验实施与资料收集所有作者均声明不存在利益冲突广告目次深圳市源兴医药股份有限公司 封二上海铠唏尔医疗器械贸易有限公司 对封二南海朗肽制药有限公司 对中文目次1深圳海卓科赛医疗有限公司 对中文目次2上海腾瑞制药股份有限公司 对英文目次1江西省科星生物工程有限公司 插页1保赫曼（上海）贸易有限公司 插页2浙江医学科技开发有限公司 插页3苏州汇涵医用科技发展有限公司 插页4苏州爱得科技发展股份有限公司 对正文珠海亿胜生物制药有限公司 封三武汉维斯第医用科技股份有限公司 封底 -
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1 3种浓度甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）冻干材料的氢核磁共振波谱描记图。1A、1B、1C.分别为低浓度GelMA、中浓度GelMA和高浓度GelMA，均在5.63、5.68 ppm处存在连续的波峰Ⅰ，在4.14 ppm处存在波峰Ⅱ
注：红色箭头指示波峰
2 3种浓度甲基丙酸烯酐化明胶（GelMA）水凝胶微观形貌 场发射扫描电子显微镜×600，图中标尺为50 μm。2A.低浓度GelMA水凝胶支架存在疏松、不规则三维空间网状结构；2B.中浓度GelMA水凝胶三维空间网络、孔径大小均较均匀规则；2C.高浓度GelMA水凝胶支架三维空间网状结构致密、层次混乱
4 含不同浓度银GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径
注：GelMA为甲基丙烯酸酐化明胶；横坐标轴下方的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10依次代表从低至高的10种含不同浓度银GelMA水凝胶；与最低浓度含银GelMA水凝胶相比，aP<0.01
5 含银甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶微观形貌观察及银元素检测结果。5A.含银GelMA水凝胶为规律的趋于平行线性的条索状结构 场发射扫描电子显微镜×200，图中标尺为50 μm；5B.能谱仪检测结果描记图显示，含银GelMA水凝胶含有银元素
7 不同观察倍数下负载银和重组人碱性成纤维细胞生长因子的复合水凝胶微观形貌 场发射扫描电子显微镜。7A.2 000倍放大倍数下复合水凝胶呈规则均匀的网格状，图中标尺为25 μm；7B.10 000倍放大倍数下复合水凝胶内部存在细丝网状结构，图中标尺为5 μm
8 2组兔各时间点创面愈合情况比较。8A.伤后3 d，复合水凝胶组创面可见大量坏死组织及渗出物；8B.伤后7 d，复合水凝胶组创面仍可见少量渗出及坏死组织；8C.伤后14 d，复合水凝胶组创面坏死组织减少、痂皮逐渐脱落，创面红润可见肉芽组织生长；8D.伤后21 d，复合水凝胶组创面完全愈合；8E.伤后28 d，复合水凝胶组创面部位可见新生毛发；8F.伤后3 d，纱布对照组创面可见散在结痂，亦可见少量坏死组织及渗出物；8G.伤后7 d，纱布对照组创面出现与纱布粘连情况；8H.伤后14 d，创面基底呈苍白色、血运差，仍有少量渗出物；8I.伤后21 d，纱布对照组创面也出现愈合趋势，创面基底红润；8J.伤后28 d，纱布对照组仍残存椭圆形创面
注：复合水凝胶指负载银和重组人碱性成纤维细胞生长因子的甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶
表1 2组兔深Ⅱ度烧伤创面各时间点愈合率比较（%，
组别 兔数（只） 伤后7 d 伤后14 d 伤后21 d 伤后28 d 复合水凝胶组 30 34±7 70±8 89±6 100±3 纱布对照组 30 29±10 59±11 75±8 88±8 t值 2.24 4.43 7.67 7.69 P值 0.030 <0.001 <0.001 <0.001 注：复合水凝胶指负载银和重组人碱性成纤维细胞生长因子的甲基丙烯酸酐化明胶；处理因素主效应，F=104.40，P<0.001；时间因素主效应，F=699.50，P<0.001；两者交互作用，F=3.55，P=0.015 
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