Regulatory effects of bio-intensity electric field on microtubule acetylation in human epidermal cell line HaCaT
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摘要:
目的 探讨生物强度电场对人表皮细胞株HaCaT方向性迁移及微管乙酰化水平的调节作用，以期为临床创面修复提供分子理论依据。 方法 采用实验研究方法。取HaCaT细胞，分为置于电场装置中不通电处理3 h的模拟电场组和用强度200 mV/mm电场处理3 h的电场处理组（处理方法下同，样本数分别为54、52），在活细胞工作站中观察处理3 h内细胞运动的方向并计算细胞运动的位移速度、轨迹速度及运动方向性cosθ。取2批HaCaT细胞，分为模拟电场组和用强度200 mV/mm的电场处理相应时间的电场处理1 h组、电场处理2 h组、电场处理3 h组及模拟电场组和用相应强度的电场处理3 h的100 mV/mm电场组、200 mV/mm电场组、300 mV/mm电场组，采用蛋白质印迹法检测乙酰化α-微管蛋白的表达（样本数均为3）。取HaCaT细胞，分为模拟电场组和电场处理组，采用免疫荧光法观测乙酰化α-微管蛋白的表达及定位（样本数为3）。对数据行Kruskal-Wallis H检验、Mann-Whitney U检验、Bonferroni校正、单因素方差分析、LSD检验及独立样本t检验。 结果 处理3 h内，与模拟电场组相比，电场处理组细胞有明显定向迁移的趋势，位移速度、轨迹速度均明显加快（Z值分别为-8.53、-2.05，P<0.05或P<0.01），方向性明显增强（Z=-8.65，P<0.01）。与模拟电场组（0.80±0.14）比较，电场处理1 h组、电场处理2 h组细胞中乙酰化α-微管蛋白表达量（1.50±0.08、1.89±0.06）均无明显变化（P>0.05），电场处理3 h组细胞乙酰化α-微管蛋白表达量（3.37±0.36）明显增高（Z=-3.06，P<0.05）。处理3 h，100 mV/mm电场组、200 mV/mm电场组、300 mV/mm电场组细胞乙酰化α-微管蛋白表达量分别为1.63±0.05、2.24±0.08、2.00±0.13，均较模拟电场组的0.95±0.27明显增高（P<0.01）；200 mV/mm电场组、300 mV/mm电场组细胞乙酰化α-微管蛋白表达量均较100 mV/mm电场组明显增高（P<0.01）；300 mV/mm电场组细胞乙酰化α-微管蛋白表达量较200 mV/mm电场组明显降低（P<0.05）。处理3 h，电场处理组细胞中乙酰化α-微管蛋白的分布较模拟电场组更具有方向性，电场处理组细胞乙酰化α-微管蛋白的表达量较模拟电场组明显增高（t=5.78，P<0.01）。 结论 生物强度电场可促进HaCaT细胞定向迁移，在200 mV/mm电场强度下处理3 h可明显促进微管乙酰化水平。 Abstract:Objective To investigate the regulatory effects of bio-intensity electric field on directional migration and microtubule acetylation in human epidermal cell line HaCaT, aiming to provide molecular theoretical basis for the clinical treatment of wound repair. Methods The experimental research methods were used. HaCaT cells were collected and divided into simulated electric field group (n=54) placed in the electric field device without electricity for 3 h and electric field treatment group (n=52) treated with 200 mV/mm electric field for 3 h (the same treatment methods below). The cell movement direction was observed in the living cell workstation and the movement velocity, trajectory velocity, and direction of cosθ of cell movement within 3 h of treatment were calculated. HaCaT cells were divided into simulated electric field group and electric field treatment 1 h group, electric field treatment 2 h group, and electric field treatment 3 h group which were treated with 200 mV/mm electric field for corresponding time. HaCaT cells were divided into simulated electric field group and 100 mV/mm electric field group, 200 mV/mm electric field group, and 300 mV/mm electric field group treated with electric field of corresponding intensities for 3 h. The protein expression of acetylated α-tubulin was detected by Western blotting (n=3). HaCaT cells were divided into simulated electric field group and electric field treatment group, and the protein expression of acetylated α-tubulin was detected and located by immunofluorescence method (n=3). Data were statistically analyzed with Kruskal-Wallis H test,Mann-Whitney U test, Bonferroni correction, one-way analysis of variance, least significant difference test, and independent sample t test. Results Within 3 h of treatment, compared with that in simulated electric field group, the cells in electric field treatment group had obvious tendency to move directionally, the movement velocity and trajectory velocity were increased significantly (with Z values of -8.53 and -2.05, respectively, P<0.05 or P<0.01), and the directionality was significantly enhanced (Z=-8.65, P<0.01). Compared with (0.80±0.14) in simulated electric field group, the protein expressions of acetylated α-tubulin in electric field treatment 1 h group (1.50±0.08) and electric field treatment 2 h group (1.89±0.06) were not changed obviously (P>0.05), while the protein expression of acetylated α-tubulin of cells in electric field treatment 3 h group (3.37±0.36) was increased significantly (Z=-3.06, P<0.05). After treatment for 3 h, the protein expressions of acetylated α-tubulin of cells in 100 mV/mm electric field group, 200 mV/mm electric field group, and 300 mV/mm electric field group were 1.63±0.05, 2.24±0.08, and 2.00±0.13, respectively, which were significantly more than 0.95±0.27 in simulated electric field group (P<0.01). Compared with that in 100 mV/mm electric field group, the protein expressions of acetylated α-tubulin in 200 mV/mm electric field group and 300 mV/mm electric field group were increased significantly (P<0.01); the protein expression of acetylated α-tubulin of cells in 300 mV/mm electric field group was significantly lower than that in 200 mV/mm electric field group (P<0.05). After treatment for 3 h, compared with that in simulated electric field group, the acetylated α-tubulin of cells had enhanced directional distribution and higher protein expression (t=5.78, P<0.01). Conclusions Bio-intensity electric field can induce the directional migration of HaCaT cells and obviously up-regulate the level of α-ubulin acetylation after treatment at 200 mV/mm bio-intensity electric field for 3 h. -
Key words:
- Skin /
- Cell movement /
- Tubulin /
- Acetylation /
- Bio-intensity electric field /
- Epidermal cells
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(1)经分析,得出女性、合并基础疾病、Ⅲ度烧伤面积、入院24 h内血肌酐值、合并肺水肿、出现血红蛋白<70 g/L、合并脓毒症、行连续性肾脏替代治疗、切削痂植皮手术（以下简称手术）次数、总手术失血量是大面积烧伤患者输血情况的主要影响因素。
(2)证实切削痂和取皮面积、手术时长及活性创面移植物通过影响单次手术失血量，间接影响患者输血情况。
Highlights:
(1)After analysis, it was concluded that the major factors influencing blood transfusion status in patients with extensive burns were female, combined underlying diseases, full-thickness burn area, serum creatinine value within 24 h of admission, combined pulmonary edema, occurrence of hemoglobin value <70 g/L, combined sepsis, conduction of continuous renal replacement therapy, number of escharectomy or tangential excision and skin grafting surgery (hereinafter referred to as surgery), and total surgical blood loss volume were the main factors affecting blood transfusion in patients with extensive burns.
(2)It was proved that the area of escharectomy or tangential excision and skin graft harvesting, duration of operation, and active wound grafts indirectly affected the patient's blood transfusion by affecting the blood loss volume per surgery.
大面积烧伤患者通常会发生全身性的病理反应，如循环血量下降、贫血、全身性感染、凝血功能紊乱及脏器衰竭等 ［ 1］ ，其中贫血的病因包括创面出血、应激性溃疡出血、更换敷料、频繁抽血检查及切削痂植皮手术（以下简称手术）等。临床治疗上，对于大面积烧伤患者通常需要给予快速补液、呼吸支持、纠正贫血、清创换药、手术、抗感染、镇静镇痛和营养支持等治疗 ［ 2］ 。
为了补充大面积烧伤患者丢失的血液成分，输血是重要的治疗方法。然而输血导致的并发症也是不可忽视的 ［ 3］ 。但是有学者认为大面积烧伤患者体液丢失严重、热量消耗快和失血量过多，输血量不足会增加患者的死亡风险 ［ 4］ 。因此，本研究回顾了国内3家医院烧伤中心收治的大面积烧伤患者的血制品使用情况，探讨患者输血情况的影响因素，期望为大面积烧伤患者的临床用血提供参考依据。
1. 对象与方法
本回顾性病例系列研究符合《赫尔辛基宣言》的基本原则，分别通过了南昌大学第一附属医院、浙江大学医学院附属第二医院和安徽医科大学第一附属医院伦理审查委员会的审批，批号分别为（2023）CDYFYYLK（01-043）、I20221060、PJ2023-10-12。在不泄露患者身份信息的前提下对其临床资料进行分析、使用。
1.1 入选标准
纳入标准：（1）烧伤总面积≥50%TBSA；（2）性别不限，年龄≥18岁；（3）病历资料完整。排除标准：（1）烧伤前有怀孕、贫血及血液疾病；（2）入院48 h内死亡；（3）治疗期间自动出院且无法判断预后。
1.2 临床资料与统计指标
收集2016年1月—2022年6月，3家医院烧伤中心收治的455例符合入选标准的大面积烧伤患者的临床资料，其中南昌大学第一附属医院202例、浙江大学医学院附属第二医院179例、安徽医科大学第一附属医院74例。
统计患者住院期间输注红细胞、血浆及血小板的情况。同时收集以下临床资料：（1）一般特征，包括年龄、性别、体重指数、合并基础疾病情况、致伤原因、伤后入院时间、入院类型、烧伤总面积、Ⅲ度烧伤面积、合并吸入性损伤情况、合并其他创伤情况、合并肺水肿情况。（2）血生化指标，包括入院24 h内血乳酸、血肌酐、总胆红素、白蛋白值。（3）感染情况，包括合并血流、创面、肺部、尿路感染情况，合并脓毒症情况。（4）手术情况，包括用于分析患者血浆和红细胞输注量影响因素的手术次数、总手术失血量；用于分析患者手术失血量影响因素的伤后14 d内的602次手术资料，包括单次手术的切削痂和取皮面积、单次手术时长、单次手术失血量、手术部位、止血带和创面移植物使用情况。其中手术失血量采用Budny公式计算，即单次手术的总失血量=循环血容量×［（术前24 h血红蛋白浓度-术后48 h血红蛋白浓度）÷术前24 h血红蛋白浓度］+术中及术后48 h内总输血量。成年男性循环血容量=75 mL/kg×体重，成年女性循环血容量=66 mL/kg×体重。（5）治疗情况，包括出现血红蛋白<70 g/L情况、入住ICU情况、行机械通气情况、行连续性肾脏替代治疗（CRRT）情况、住院天数及预后。
1.3 统计学处理
采用SPSS 25.0统计软件对数据进行分析。计数资料数据以频数（百分比）表示；符合正态分布的计量资料数据以
2. 结果
2.1 输血情况
455例患者在整个住院期间，有437例（96.0%）患者进行了输血治疗。其中，72例（15.8%）患者接受血浆、红细胞及血小板3种类型的血液制品的输血治疗。具体来说，435例（95.6%）患者输注了血浆，共5 551次，总量为3 961 683 mL，每例患者输注量为6 350（3 050，11 650）mL；410例（90.1%）患者输注了红细胞，共3 109次，总量为8 070.50 U，每例患者输注量为14.00（6.00，27.00）U；另有73例（16.0%）患者输注了血小板，共147次，总量为2 962 U。
2.2 临床资料及影响血浆和红细胞输注量的单因素分析
455例患者以男性为主，年龄18~92岁；近半数患者体重指数在正常范围内；少部分患者合并基础疾病；烧伤总面积为50%~100%TBSA，Ⅲ度烧伤面积为0~98%TBSA，火焰烧伤是最常见的致伤原因，平均伤后入院时间为5 h；多数患者由下级医院转入；大多数患者合并吸入性损伤，少数患者合并肺水肿、其他创伤。患者入院24 h内血乳酸、血肌酐、总胆红素、白蛋白的平均值分别为4.2 mmol/L、86 μmol/L、22 μmol/L、30 g/L。住院期间绝大多数患者合并感染，少数患者合并脓毒症。每例患者平均进行3次手术，平均总手术失血量为2 541 mL。少数患者在住院期间出现血红蛋白<70 g/L的情况；大多数患者入住ICU，行机械通气；少数患者进行了CRRT；患者的住院天数为46（23，69）d，321例（70.5%）患者存活。
不同合并基础疾病情况、合并吸入性损伤情况、合并其他创伤情况、合并肺水肿情况、合并血流感染情况、合并创面感染情况、合并肺部感染情况、合并尿路感染情况、合并脓毒症情况、出现血红蛋白<70 g/L情况、入住ICU情况、行机械通气情况、行CRRT情况下的患者血浆输注量比较，差异均有统计学意义（ P<0.05）；且患者的烧伤总面积、Ⅲ度烧伤面积、入院24 h内血乳酸值、入院24 h内血肌酐值、入院24 h内白蛋白值、手术次数、总手术失血量均与血浆输注量相关（ P<0.05）。不同性别、合并吸入性损伤情况、合并其他创伤情况、合并肺水肿情况、合并血流感染情况、合并创面感染情况、合并肺部感染情况、合并尿路感染情况、合并脓毒症情况、出现血红蛋白<70 g/L情况、入住ICU情况、行机械通气情况、行CRRT情况下的患者红细胞输注量比较，差异均有统计学意义（ P<0.05）；且患者的年龄、烧伤总面积、Ⅲ度烧伤面积、入院24 h内血乳酸值、入院24 h内血肌酐值、入院24 h内总胆红素值、入院24 h内白蛋白值、手术次数、总手术失血量均与红细胞输注量相关（ P<0.05）。见 表1、 2。
表1 455例大面积烧伤患者不同临床资料（分类变量）下血浆和红细胞输注量比较表1. Comparison of plasma and red blood cell transfusion volumes under different clinical data (categorical variables) in 455 patients with extensive burns项目与类别 例数 构成比（%） 血浆输注量［mL， M（ Q 1， Q 3）］ 红细胞输注量［U， M（ Q 1， Q 3）］ 统计量值1 P 1值 统计量值2 P 2值 性别 女 125 27.5 7 100（2 788，10 260） 15.50（6.00，24.25） Z=-0.80 0.427 Z=-2.00 0.045 男 330 72.5 5 775（2 548，11 500） 10.50（4.00，24.63） 体重指数（kg/m 2） <18.5 12 2.6 3 350（2 283，8 553） 6.50（0.25，12.00） H=3.69 0.158 H=4.09 0.129 ≥18.5且<24.0 192 42.2 5 590（2 550，9 800） 12.25（4.00，24.00） ≥24.0 251 55.2 6 370（2 850，12 440） 12.00（4.50，25.50） 合并基础疾病 是 100 22.0 7 095（3 498，12 181） 11.75（4.00，24.38） Z=-2.06 0.040 Z=-0.21 0.837 否 355 78.0 5 620（2 540，10 750） 12.00（4.00，25.50） 入院类型 直接入院 143 31.4 6 050（3 270，12 000） 12.00（4.00，27.00） Z=-1.58 0.114 Z=-0.45 0.652 转入院 312 68.6 6 040（2 485，10 685） 12.00（4.00，23.25） 致伤原因 火焰 371 81.5 6 200（2 550，11 850） 12.50（4.00，26.00） H=0.70 0.874 H=1.70 0.638 热液 35 7.7 6 370（2 950，9 600） 10.00（4.00，18.00） 化学物质 31 6.8 5 580（2 550，10 900） 11.50（5.00，24.00） 电 18 4.0 5 260（3 300，7 600） 10.75（2.00，30.00） 合并吸入性损伤 是 301 66.2 7 100（3 310，13 365） 14.50（5.00，29.00） Z=-4.67 <0.001 Z=-4.34 <0.001 否 154 33.8 4 435（1 938，8 833） 7.50（2.75，17.63） 合并其他创伤 是 45 9.9 6 830（4 125，18 425） 19.50（11.25，33.25） Z=-2.11 0.035 Z=-3.10 0.002 否 410 90.1 5 950（2 538，10 863） 11.00（4.00，23.13） 合并肺水肿 是 139 30.5 9 360（4 810，18 690） 17.00（7.00，30.00） Z=-6.13 <0.001 Z=-4.22 <0.001 否 316 69.5 5 250（2 325，9 038） 9.75（4.00，20.50） 合并血流感染 是 220 48.4 9 150（5 590，16 375） 18.50（9.63，32.88） Z=-9.56 <0.001 Z=-8.24 <0.001 否 235 51.6 3 700（1 800，6 610） 6.00（2.00，16.00） 合并创面感染 是 279 61.3 7 170（3 470，12 900） 16.50（7.00，29.50） Z=-4.93 <0.001 Z=-7.66 <0.001 否 176 38.7 4 825（1 900，9 038） 6.00（2.00，14.88） 合并肺部感染 是 207 45.5 8 900（4 970，1 700） 19.00（9.50，35.00） Z=-8.08 <0.001 Z=-8.62 <0.001 否 248 54.5 4 390（1 830，7 980） 6.25（2.13，15.88） 合并尿路感染 是 129 28.4 8 680（4 545，15 819） 18.00（7.25，33.75） Z=-4.78 <0.001 Z=-4.75 <0.001 否 326 71.6 5 295（2 300，9 608） 10.00（3.88，20.50） 合并脓毒症 是 125 27.5 10 490（6 883，19 825） 21.50（12.00，37.80） Z=-9.12 <0.001 Z=-7.42 <0.001 否 330 72.5 4 825（2 050，8 833） 8.00（3.50，19.5） 血红蛋白<70 g/L 是 155 34.1 9 050（5 000，17 470） 21.00（13.00，35.50） Z=-6.55 <0.001 Z=-9.36 <0.001 否 300 65.9 4 960（2 125，9 037） 7.00（2.00，16.50） 入住ICU 是 370 81.3 7 250（3 915，12 903） 14.50（5.00，27.63） Z=-9.37 <0.001 Z=-6.12 <0.001 否 85 18.7 2 100（550，4 050） 4.50（1.75，11.50） 行机械通气 是 267 58.7 9 050（5 580，15 400） 17.00（8.00，32.50） Z=-11.46 <0.001 Z=-8.31 <0.001 否 188 41.3 2 788（1 205，5 400） 6.00（2.00，14.00） 行CRRT 是 55 12.1 12 330（8 680，26 650） 33.50（15.50，55.50） Z=-7.17 <0.001 Z=-6.64 <0.001 否 400 87.9 5 495（2 465，9 645） 10.00（4.00，20.88） 注：ICU为重症监护病房，CRRT为连续性肾脏替代治疗；统计量值1、 P 1值，统计量值2、 P 2值分别为不同临床资料下血浆输注量、红细胞输注量比较所得 表2 455例大面积烧伤患者不同临床资料（连续变量）与血浆和红细胞输注量相关分析表2. Correlation analysis of plasma and red blood cell transfusion volumes with different clinical data (continuous variables) in 455 patients with extensive burns项目与类别 数值 血浆输注量 红细胞输注量 r 1值 P 1值 r 2值 P 2值 年龄（岁， 46±14 -0.02 0.609 0.12 0.009 烧伤总面积［%TBSA， M（ Q 1， Q 3）］ 70（60，87） 0.39 <0.001 0.22 <0.001 Ⅲ度烧伤面积［%TBSA， M（ Q 1， Q 3）］ 33（16，55） 0.51 <0.001 0.49 <0.001 伤后入院时间［h， M（ Q 1， Q 3）］ 5（3，11） <0.001 0.992 0.03 0.535 入院24 h内血生化指标 血乳酸（mmol/L， 4.2±2.7 0.14 0.002 0.09 0.045 血肌酐（μmol/L， 86±37 0.28 <0.001 0.18 <0.001 总胆红素（μmol/L， 22±16 0.08 0.092 0.13 0.005 白蛋白（g/L， 30±8 -0.13 0.006 -0.15 0.001 手术次数［次， M（ Q 1， Q 3）］ 3（1，5） 0.47 <0.001 0.69 <0.001 总手术失血量［mL， M（ Q 1， Q 3）］ 2 541（1 217，4 859） 0.56 <0.001 0.77 <0.001 注：TBSA为体表总面积； r 1值、 P 1值， r 2值、 P 2值分别为不同临床资料与血浆输注量、红细胞输注量进行Spearman相关分析所得 2.3 血浆和红细胞输注量的多元线性回归分析
将年龄、烧伤总面积、Ⅲ度烧伤面积、入院24 h内血乳酸值、入院24 h内血肌酐值、入院24 h内总胆红素值、入院24 h内白蛋白值、手术次数、总手术失血量此类连续变量以原始值代入；对分类变量进行赋值，如性别：1=男、2=女，合并基础疾病情况，合并吸入性损伤情况，合并其他创伤情况，合并肺水肿情况，合并血流、创面、肺部、尿路感染情况，合并脓毒症情况：1=是、2=否，出现血红蛋白<70 g/L情况：1=是、2=否，入住ICU情况：1=是、2=否，行机械通气情况：1=是、2=否，行CRRT情况：1=是、2=否。以每例患者住院期间红细胞输注量和血浆输注量为因变量建立多元线性回归模型，结果显示：合并基础疾病、Ⅲ度烧伤面积、合并肺水肿、入院24 h内血肌酐值、合并脓毒症、行CRRT、手术次数、总手术失血量均是大面积烧伤患者住院期间血浆输注量的独立影响因素（ P<0.05）。女性、Ⅲ度烧伤面积、入院24 h内血肌酐值、合并脓毒症、出现血红蛋白<70 g/L、行CRRT、总手术失血量均是大面积烧伤患者住院期间红细胞输注量的独立影响因素（ P<0.05）。另外，共线性分析结果表明，方差膨胀因子（ VIF）值均<3，说明变量间无共线性问题。见 表3。
表3 455例大面积烧伤患者血浆和红细胞输注量的影响因素的多元线性回归模型分析结果表3. Results of multiple linear regression model analysis of factors affecting plasma and red blood cell infusion volumes in 455 patients with extensive burns因变量 自变量 非标准化回归系数 标准化回归系数 标准误 95%置信区间 t值 P值 VIF 血浆输注量 合并基础疾病 2 309.89 0.09 677.42 694.50~3 357.19 2.99 0.003 1.07 Ⅲ度烧伤面积（%TBSA） 69.21 0.16 14.07 26.06~81.38 3.82 <0.001 1.89 合并肺水肿 2 501.45 0.12 622.30 1 151.49~3 597.50 3.82 <0.001 1.12 入院24 h内血肌酐值（μmol/L） 20.32 0.07 8.14 2.00~33.99 2.21 0.028 1.22 合并脓毒症 2 667.40 0.11 725.83 701.87~3 554.85 2.93 0.004 1.43 行CRRT 4 500.94 0.15 958.91 2 214.57~5 983.69 4.28 <0.001 1.33 手术次数 911.64 0.31 179.22 705.61~1 410.06 5.90 <0.001 3.11 总手术失血量（mL） 0.77 0.26 0.16 0.47~1.08 4.99 <0.001 2.95 红细胞输注量 女性 4.56 0.10 1.15 2.18~6.71 3.86 <0.001 1.07 Ⅲ度烧伤面积（%TBSA） 0.09 0.12 0.02 0.05~0.14 4.20 <0.001 1.45 入院24 h内血肌酐值（μmol/L） 0.05 0.10 0.02 0.03~0.09 3.67 <0.001 1.26 合并脓毒症 3.64 0.11 1.26 2.41~7.37 3.87 <0.001 1.29 出现血红蛋白<70 g/L 2.98 0.05 1.15 0.05~4.57 2.01 0.045 1.20 行CRRT 10.62 0.19 1.73 8.17~14.97 6.70 <0.001 1.28 总手术失血量（mL） 0.004 0.54 <0.001 0.003~0.004 16.78 <0.001 1.70 注：TBSA为体表总面积，CRRT为连续性肾脏替代治疗， VIF为方差膨胀因子；残差均服从正态分布，且血浆输注量的调整后的 R²=0.72，红细胞输注量的调整后的 R²=0.59 2.4 手术情况及影响单次手术失血量的单因素和多元线性回归分析
总手术失血量是大面积烧伤患者血浆输注量和红细胞输注量的独立影响因素，进一步探讨单次手术失血量的影响因素。患者单次手术失血量为1 268（813，1 927）mL，单次手术中的切削痂和取皮面积为5%~60%TBSA，单次手术时长为39~430 min，多数手术为单纯肢体手术，近半数手术使用了止血带，大多数手术中使用了自体皮、冷藏异体皮及异种皮等活性创面移植物。不同手术部位、创面移植物下的患者单次手术失血量比较，差异均有统计学意义（ P<0.05）；患者切削痂和取皮面积、手术时长均与单次手术失血量相关（ P<0.05）。见 表4。将切削痂和取皮面积、手术时长以原始值代入；对分类变量进行赋值，手术部位：单纯肢体=1、肢体+躯干=2，创面移植物：1=有活性、2=无活性。以单次手术失血量为因变量建立多元线性回归模型，结果显示：切削痂和取皮面积、手术时长及活性创面移植物均是大面积烧伤患者单次手术失血量的独立影响因素（ P<0.05）。而各个变量的 VIF值均<3，说明变量间无共线性问题。见 表5。
表4 455例大面积烧伤患者的不同临床资料下单次手术失血量比较表4. Comparison of blood loss volume per surgery under different clinical data in 455 patients with extensive burns项目与类别 数据 单次手术失血量［mL， M（ Q 1， Q 3）］ 统计量值 P值 切削痂和取皮面积［%TBSA， M（ Q 1， Q 3）］ 22（18，26） 1 268（813，1 927） r=0.40 <0.001 手术时长［min， M（ Q 1， Q 3）］ 120（95，176） 1 268（813，1 927） r=0.21 <0.001 手术部位［例（%）］ 单纯肢体 376（62.5） 1 377（875，2 042） Z=-2.54 0.011 肢体+躯干 226（37.5） 1 120（747，1 771） 止血带的使用［例（%）］ 是 257（42.7） 1 158（857，2 196） Z=-0.52 0.601 否 345（57.3） 1 344（783，1 892） 创面移植物［例（%）］ 有活性 494（82.1） 1 205（800，1 893） Z=-2.27 0.023 无活性 108（17.9） 1 585（905，2 249） 注：TBSA为体表总面积 表5 455例大面积烧伤患者的单次手术失血量影响因素的多元线性回归模型分析结果表5. Results of multiple linear regression model analysis of factors affecting blood loss volume per surgery in 455 patients with extensive burns影响因素 标准化回归系数 标准误 95%置信区间 t值 P值 VIF 切削痂和取皮面积（%TBSA） 0.41 3.92 35.45~50.84 11.01 <0.001 1.08 手术时长（h） 0.16 0.55 1.20~3.37 4.14 <0.001 1.10 单纯肢体手术 -0.05 73.49 -234.33~54.33 -1.23 0.220 1.05 有活性的创面移植物 0.12 91.89 113.93~474.88 3.20 0.001 1.03 注：TBSA为体表总面积，VIF为方差膨胀因子；残差服从正态分布且调整后的 R²=0.23 3. 讨论
输血是大面积烧伤患者的重要治疗方法。研究表明，烧伤面积>40%TBSA的烧伤患者输血率为97.7% ［ 5］ ，与本研究中96.0%（437/455）的输血率相近。研究显示，性别与烧伤患者输血存在显著相关性 ［ 6］ 。本研究中，女性是大面积烧伤患者红细胞输注量的独立影响因素，这与Wu等 ［ 5］ 的研究结论相同。此外，有学者认为年龄是烧伤患者输血需求以及输血量的重要影响因素 ［ 4, 5， 7］ 。但本研究显示，年龄并非大面积烧伤患者红细胞输注量的独立影响因素。Kilyewala等 ［ 6］ 研究显示，伤前患有基础疾病的烧伤患者输血的风险增加了大约90%，而且烧伤患者伤前合并基础疾病可作为输血的决定因素 ［ 8］ 。在本研究中，合并基础疾病是大面积烧伤患者血浆输注量的独立影响因素。除此之外，烧伤面积及深度也是患者血浆及红细胞输注量的重要预测因素 ［ 9, 10］ 。本研究中，烧伤总面积和Ⅲ度烧伤面积均为大面积烧伤患者血浆及红细胞输注量的影响因素，但只有Ⅲ度烧伤面积是以上两者的独立影响因素，这可能是由于Ⅲ度烧伤损伤皮肤全层，创面难以愈合，通常需要手术治疗。
本研究结果显示，入院24 h内血肌酐值是大面积烧伤患者血浆及红细胞输注量的独立影响因素，可能是因为入院血肌酐升高反映肾功能受损，而肾功能损伤可导致促红细胞生成素减少，使红细胞生成减少 ［ 9］ 。此外，合并肺水肿是大面积烧伤患者血浆输注量的独立影响因素，这可能是大面积烧伤的液体复苏过程中的过度补液导致的 ［ 11］ ，血浆是临床常用的胶体复苏液，因此临床上需要准确监测液体复苏情况，防止并发症的发生。烧伤患者容易发生各种感染，且感染率随着输血量的增加而大大增加 ［ 4， 12］ 。本研究显示，合并血流、创面、肺部、尿路感染及脓毒症均是大面积烧伤患者血浆及红细胞输注量的影响因素，而合并脓毒症是以上两者的独立影响因素。临床上，脓毒症烧伤患者可能进展为脓毒性休克，出现血管内血容量不足和顽固性低血压 ［ 13］ ，这可能是脓毒症患者输血量增多的原因。脓毒症是大面积烧伤患者存活的最主要威胁，早期识别并及时处置是改善患者预后的关键 ［ 14］ 。
有研究显示，血红蛋白水平与烧伤患者是否输血及输血量相关 ［ 6， 15］ 。临床上，血红蛋白<70 g/L是外科输注红细胞的临床指征，但是大面积烧伤患者病情复杂，当血红蛋白<70 g/L时再输注红细胞，可能无法满足机体需求。本研究同样显示，出现血红蛋白<70 g/L是大面积烧伤患者红细胞输注量的独立影响因素，因此，需要密切关注患者的血红蛋白水平，准确评估患者失血情况，必要时输注红细胞，避免患者出现血红蛋白<70 g/L的情况。本研究结果显示，行CRRT是大面积烧伤患者血浆及红细胞输注量的独立影响因素。CRRT常被用于严重烧伤并发急性肾损伤和烧伤脓毒症的患者，此类患者全身情况差，容易出现低血容量性休克及贫血等症状，对输血的需求较大。此外，对于有CRRT适应证的患者应尽早开展治疗，否则当患者肾损伤进入需要行肾脏替代治疗阶段时，即使行CRRT也不能较好地改善预后 ［ 16］ 。
本研究结果显示，总手术失血量与患者血浆及红细胞输注量有关，手术次数与患者血浆输注量有关，与Mai等 ［ 17］ 的研究结果一致。而切削痂和取皮面积、手术时长及使用活性创面移植物是大面积烧伤患者单次手术失血量的独立影响因素，这与国内外学者的研究结果 ［ 18, 19］ 相似。同时，静脉注射氨甲环酸，创面使用纤维蛋白胶、生物流体止血膜及凝血酶等可以有效减少手术失血量 ［ 20, 21］ 。当然，本研究具有一定的局限性，主要是缺乏对其他一些可能的相关因素，如患者的凝血功能及抗凝剂的使用等的分析；其次，缺少对血小板、冷沉淀、白蛋白等应用情况的详细调查。
综上所述，在大面积烧伤患者的输血治疗中，Ⅲ度烧伤面积大、入院24 h内血肌酐高、合并脓毒症、行CRRT及总手术失血量大的患者输注了更多的血浆和红细胞。此外，合并基础疾病、合并肺水肿、手术次数多以及死亡的患者输注了更多的血浆，女性、出现血红蛋白<70 g/L的患者输注了更多的红细胞。而且控制切削痂和取皮面积，缩短手术时长以及使用活性创面移植物，可有效减少单次手术失血量，从而减少患者的输血量。因此，临床上不仅需要严格掌握输血指征，还需要根据患者的具体情况，合理地调整输血量以及减少失血量，从而更加科学有效地进行输血治疗，维持血容量及纠正贫血和减少相关并发症，进而改善患者预后。
邬亚婷：设计实验，实施实验，采集数据，分析数据，撰写文章；张泽、冀然：实施实验，采集数据，分析数据；张书豪、王文平、武潮：文献汇总，分析数据；张家平、江旭品：设计实验，审阅文章，获取研究经费，行政、技术和材料支持；张恒术：撰写并审阅文章，获取研究经费，行政、技术和材料支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
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1 蛋白质印迹法检测模拟电场组和用强度200 mV/mm的电场处理不同时间的3组人永生化表皮细胞HaCaT乙酰化α-微管蛋白的表达
注：GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带上方1、2、3、4分别为模拟电场组、电场处理1 h组、电场处理2 h 组和电场处理3 h组
2 蛋白质印迹法检测模拟电场组与不同强度电场处理3组人永生化表皮细胞HaCaT中乙酰化α-微管蛋白的表达
注：GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带上方1、2、3、4分别为模拟电场组、100 mV/mm电场组、200 mV/mm电场组、300 mV/mm电场组
3 模拟电场组和用强度200 mV/mm的电场处理3 h的电场处理组人永生化表皮细胞HaCaT乙酰化α-微管蛋白的表达。3A、3B.分别为模拟电场组和电场处理组HaCaT细胞中乙酰化α-微管蛋白染色重叠图片，图3B中乙酰化α-微管蛋白表达明显多于图3A Alexa Fluor 488-4',6-二脒基-2-苯基吲哚-鬼笔环肽×200；3C、3D.分别为模拟电场组和电场处理组HaCaT细胞中乙酰化α-微管蛋白局部染色重叠图片，图3D中乙酰化α-微管蛋白呈极性分布 Alexa Fluor 488-4',6-二脒基-2-苯基吲哚-鬼笔环肽×600
注：绿色荧光标记乙酰化α-微管蛋白，蓝色荧光标记细胞核，红色荧光标记细胞骨架
表1 2组人永生化表皮细胞HaCaT处理3 h后cosθ与轨迹速度和位移速度比较[M（Q1，Q3)]
组别 样本数 cosθ 轨迹速度（μm/min） 位移速度（μm/min） 模拟电场组 54 0.407（-0.010，0.914） 0.532（0.459，0.641） 0.131（0.068，0.240） 电场处理组 52 -0.986（-0.997，-0.941） 0.628（0.374，0.834） 0.504（0.390，0.548） Z值 -8.65 -2.05 -8.53 P值 <0.001 0.041 <0.001 注：以函数cosθ的计算值量化细胞迁移方向性的变化 
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