中华烧伤与创面修复杂志

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史春梦

2022, 38(11): 999-1003. doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20220913-00405

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摘要:
近年来，细胞疗法在难愈合创面修复领域的应用显示出广阔前景，其中间充质干细胞是最受关注和研究最为广泛的细胞类型。尽管临床转化研究已取得快速发展，但细胞疗法效果并不稳定，多数临床试验尚未取得预想结果。深入研究表明，异质性是制约细胞疗法深入开展和亟待研究的重要问题。该文基于间充质干细胞的研究进展，探讨难愈合创面细胞治疗策略的现状和挑战。

肝细胞生长因子修饰的人脂肪间充质干细胞外泌体对糖尿病小鼠全层皮肤缺损的作用

曹涛, 肖丹, 计鹏, 张智, 蔡维霞, 韩超, 李雯, 陶克

2022, 38(11): 1004-1013. doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20220731-00330

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摘要:
目的探讨肝细胞生长因子（HGF）修饰的人脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的作用及其机制。方法采用实验研究方法。取2021年2—5月于空军军医大学第一附属医院整形科行腹部手术的3名健康女性（10~25岁）废弃脂肪组织，采用胶原酶消化法获取原代ADSC，培养7 d，用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第3代ADSC，转染HGF慢病毒，培养5 d，采用成像系统观察细胞荧光情况并计算转染率。取第3~6代ADSC和第3~6代转染HGF的ADSC，均分别采用密度梯度离心法提取其外泌体，即为ADSC外泌体和HGF-ADSC外泌体。采用透射电子显微镜观察外泌体微观形态，采用流式细胞仪检测外泌体的CD9、CD63、CD81阳性表达。取24只6周龄雄性昆明小鼠，制作糖尿病模型后，在其背部制作全层皮肤缺损创面。按照随机数字表法将小鼠分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组和HGF-ADSC外泌体组，每组6只，分别作相应处理。伤后3、7、10、14 d，观察创面愈合情况并计算其愈合率，使用多普勒血流仪检测创基血流强度并计算伤后10 d创基相对血流强度百分比。伤后10 d，采用免疫荧光法检测创面中Ki67阳性细胞数，采用免疫组织化学法检测创面中CD31阳性染色且成管样结构的新生血管数，采用蛋白质印迹法检测创面中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）的蛋白表达并计算p-PI3K与PI3K比值及p-Akt与Akt比值。伤后14 d，采用苏木精-伊红染色法、Masson染色法分别检测创面皮肤组织缺损长度及胶原新生情况，并计算胶原容积分数（CVF）。样本数均为3。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及Tukey检验。结果原代ADSC培养7 d，细胞呈梭形，生长密集后呈旋涡状排列。培养5 d后，第3代转染HGF的ADSC携带绿色荧光，转染率为85%。ADSC外泌体及HGF-ADSC外泌体微观形态相似，均呈囊泡状结构，平均粒径分别为103、98 nm，均呈CD9、CD63、CD81阳性。伤后3 d，4组小鼠创面的创周均红肿且有少量渗液；伤后7 d，HGF-ADSC外泌体组创面逐渐缩小，其余3组创面缩小不明显；伤后10 d，4组创面均缩小、结痂；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面基本愈合，其余3组均有残余创面。伤后3 d，4组创面愈合率接近（P>0.05）；伤后7、10 d，HGF-ADSC外泌体组创面愈合率均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为13.11、13.11、11.89，12.85、11.28、7.74，P<0.01）；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面愈合率明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为15.50、11.64、6.36，P值均<0.01）。伤后3 d，4组小鼠创基均无明显血运；伤后7 d，HGF-ADSC外泌体组创基开始有微血管形成，其余3组创基仅创缘充血；伤后10 d，除PBS组创基仍无明显血运外，其余3组均有微血管形成；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创基血流信号强于其余3组且分布均匀。伤后10 d，HGF-ADSC外泌体组创基相对血流强度百分比明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为23.73、19.32、9.48，P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中Ki67阳性细胞数及新生血管数均明显多于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为19.58、18.20、11.04，20.68、13.79、8.12，P<0.01）。伤后10 d，HGF-ADSC外泌体组创面中eNOS蛋白表达水平明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为53.23、42.54、26.54，P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中p-PI3K与PI3K的比值及p-Akt与Akt的比值均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为16.11、11.78、6.08，65.54、31.63、37.86，P<0.01）。伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面皮肤中组织缺损长度明显短于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为20.51、18.50、11.99，P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中CVF明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为31.31、28.52、12.35，P值均<0.01）。结论人HGF-ADSC外泌体可增加创基组织新生血管形成，从而显著促进糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合，其机制可能与HGF-ADSC外泌体通过激活PI3K/Akt信号通路从而促进创面中eNOS的表达增高有关。

高糖微环境下P62对人表皮细胞株HaCaT迁移和运动性的影响及其机制

张喻平, 张琼, 邓芳, 陈兵, 张均辉, 胡炯宇

2022, 38(11): 1014-1022. doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20220630-00272

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摘要:
目的研究高糖微环境下P62蛋白对人表皮细胞株HaCaT迁移和运动性的影响及其可能的分子机制，以探讨糖尿病足创面难愈合的机制。方法采用实验研究方法。取对数生长期HaCaT进行实验。取细胞，按随机数字表法（分组方法下同）分为正常对照组（培养液含终物质的量浓度5.5 mmol/L的葡萄糖）及高糖（培养液含终物质的量浓度30.0 mmol/L的葡萄糖）24 h组、高糖48 h组、高糖72 h组。正常对照组细胞行常规培养72 h，高糖72 h组细胞行高糖培养72 h，高糖48 h组细胞先常规培养24 h再高糖培养48 h，高糖24 h组细胞先常规培养48 h再高糖培养24 h后，采用蛋白质印迹法检测P62蛋白表达。取细胞，分为正常对照组、高糖组，分别同前培养48 h后，采用免疫荧光法检测P62蛋白表达（以绿色荧光表示）。取细胞，分为阴性对照小干扰RNA（siRNA）组、P62-siRNA-1组、P62-siRNA-2组、P62-siRNA-3组，并转染相应试剂，于转染后72 h，采用蛋白质印迹法检测P62蛋白表达。取细胞，分为正常糖+阴性对照siRNA组、正常糖+P62-siRNA组、高糖+阴性对照siRNA组、高糖+P62-siRNA组，并行相应处理，于转染后72 h，采用蛋白质印迹法检测P62蛋白表达；行划痕试验检测并计算划痕后24 h细胞迁移率（样本数为9）；在活细胞工作站下，观察3 h内细胞运动范围并计算运动速度（正常糖+阴性对照siRNA组、正常糖+P62-siRNA组、高糖+阴性对照siRNA组、高糖+P62-siRNA组观察细胞数分别为76、75、80、79个）。取细胞，分为正常糖+磷酸盐缓冲液（PBS）组、高糖+PBS组、高糖+N-乙酰半胱氨酸（NAC）组，行相应处理后，于培养48 h，分别采用蛋白质印迹法及免疫荧光法检测P62蛋白表达。除划痕试验外，其余实验各组样本数均为3。对数据行单因素方差分析、LSD检验。结果与正常对照组比较，高糖24 h组、高糖48 h组及高糖72 h组细胞P62蛋白表达量均明显增加（P<0.01）。培养48 h，高糖组细胞中P62的绿色荧光强于正常对照组。转染后72 h，与阴性对照siRNA组比较，P62-siRNA-1组、P62-siRNA-2组和P62-siRNA-3组细胞P62蛋白表达量均明显减少（P<0.01）。转染后72 h，与正常糖+阴性对照siRNA组比较，正常糖+P62-siRNA组细胞P62蛋白表达量明显减少（P<0.01），高糖+阴性对照siRNA组细胞P62蛋白表达量明显增加（P<0.01）；与高糖+阴性对照siRNA组比较，高糖+P62-siRNA组细胞P62蛋白表达量明显减少（P<0.01）。划痕后24 h，与正常糖+阴性对照siRNA组［（55±7）%］比较，正常糖+P62-siRNA组细胞迁移率明显升高［（72±14）%，P<0.01］，高糖+阴性对照siRNA组细胞迁移率明显下降［（37±7）%，P<0.01］；与高糖+阴性对照siRNA组比较，高糖+P62-siRNA组细胞迁移率明显升高［（54±10）%，P<0.01］。观察3 h内，高糖+阴性对照siRNA组细胞运动范围较正常糖+阴性对照siRNA组缩小，正常糖+P62-siRNA组细胞运动范围较正常糖+阴性对照siRNA组增大，高糖+P62-siRNA组细胞运动范围较高糖+阴性对照siRNA组增大。与正常糖+阴性对照siRNA组比较，正常糖+P62-siRNA组细胞运动速度明显增加（P<0.01），高糖+阴性对照siRNA组细胞运动速度明显下降（P<0.01）；与高糖+阴性对照siRNA组比较，高糖+P62-siRNA组细胞运动速度明显增加（P<0.01）。培养48 h，与正常糖+PBS组比较，高糖+PBS组细胞P62蛋白表达量明显增加（P<0.01）；与高糖+PBS组比较，高糖+NAC组细胞P62蛋白表达量明显减少（P<0.01）。培养48 h，高糖+PBS组细胞中P62的绿色荧光强于正常糖+PBS组，而高糖+NAC组细胞中P62的绿色荧光弱于高糖+PBS组。结论在HaCaT中，高糖微环境可促进P62蛋白表达；敲减P62蛋白可促进其迁移并增加运动性；高糖微环境下活性氧增加可能是P62表达增加的潜在机制。

人脐静脉内皮细胞外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制

易佳荣, 李泽楠, 谢慧清, 陈舒悦, 蒋碧梅, 钱利, 徐立新, 李海红, 雷少榕, 陈志钊, 周建大

2022, 38(11): 1023-1033. doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20220622-00254

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摘要:
目的探讨人脐静脉内皮细胞（HUVEC）外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制。方法采用实验研究方法。取中南大学湘雅三医院2019年6月收治的2例糖尿病溃疡患者（男49岁、女58岁）手术切除溃疡周边皮肤组织，提取原代血管内皮细胞（VEC）和人皮肤成纤维细胞（HSF），通过形态观察和流式细胞术成功鉴定。采用超速离心法提取HUVEC外泌体，通过形态观察、粒径检测和蛋白质印迹法检测成功鉴定。取20只3个月龄雌性新西兰兔，背部两侧分别制作1个2型糖尿病全层皮肤缺损创面，将创面分成外泌体组和磷酸盐缓冲液（PBS）组并进行相应处理，每组20个创面，观察创面组织完全覆盖时间。伤后14 d，行苏木精-伊红染色或Masson染色，观察血管生成或胶原纤维增生情况（样本数为20）。观察VEC和HSF与HUVEC外泌体共培养24 h对HUVEC外泌体的摄取情况。将VEC与HSF均分成采用HUVEC外泌体或PBS处理的外泌体组和PBS组，采用细胞计数试剂盒8检测培养4 d细胞增殖情况，采用划痕试验检测并计算划痕后24、48 h细胞迁移率，采用Transwell实验检测培养24 h细胞迁移数，采用实时荧光定量反转录PCR法检测核因子红细胞系2相关因子2（NRF2）、转录激活因子3（ATF3）的mRNA表达，行成管实验观测VEC培养12 h血管分支点数和成管长度（样本数均为3）。取VEC及HSF，分成同前处理的PBS组、外泌体组和采用相应基因干扰的NRF2干扰组、ATF3干扰组、空载干扰组，同前检测2种细胞增殖、迁移和VEC的血管形成（样本数均为3）。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、独立样本t检验及LSD检验。结果外泌体组创面组织完全覆盖时间为（17.9±1.9）d，明显短于PBS组的（25.2±2.3）d，t=4.54，P<0.05。伤后14 d，PBS组创面血管密度明显低于外泌体组（t=10.12，P<0.01），胶原纤维生成少于外泌体组。培养24 h，HUVEC外泌体成功被VEC和HSF摄取。培养4 d，外泌体组HSF和VEC增殖活力均明显强于PBS组（t值分别为54.73、7.05，P<0.01）。划痕后24、48 h，外泌体组HSF迁移率（t值分别为3.42、11.87，P<0.05或P<0.01）和VEC迁移率（t值分别为21.42、5.49，P<0.05或P<0.01）均明显高于PBS组。培养24 h，外泌体组VEC、HSF迁移数均明显多于PBS组（t值分别为12.31、16.78，P<0.01）。培养12 h，外泌体组HSF和VEC中NRF2的mRNA表达均明显高于PBS组（t值分别为7.52、5.78，P<0.05或P<0.01），ATF3的mRNA表达均明显低于PBS组（t值分别为13.44、8.99，P<0.01）。培养12 h，外泌体组VEC血管分支点数明显多于PBS组（t=17.60，P<0.01），成管长度明显长于PBS组（t=77.30，P<0.01）。培养4 d，NRF2干扰组HSF和VEC增殖活力均较PBS组和外泌体组显著降低（P<0.05或P<0.01）；ATF3干扰组HSF和VEC增殖活力均较PBS组显著增加（P<0.05或P<0.01），均较外泌体组显著降低（P<0.05或P<0.01）。划痕后24、48 h，ATF3干扰组HSF和VEC的迁移率均较PBS组显著增加（P<0.05或P<0.01），均较外泌体组显著降低（P<0.05或P<0.01）。划痕后24、48 h，NRF2干扰组HSF和VEC的迁移率均较PBS组和外泌体组显著降低（P<0.05或P<0.01）。培养24 h，ATF3干扰组VEC和HSF的迁移数均明显多于PBS组（P<0.05），均明显少于外泌体组（P<0.05或P<0.01）；NRF2干扰组VEC和HSF的迁移数均明显少于PBS组和外泌体组（P<0.01）。培养12 h，NRF2干扰组VEC血管长度、分支点数均较PBS组和外泌体组明显减少（P<0.01）；ATF3干扰组VEC血管长度、分支点数均较PBS组明显增加（P<0.01），均较外泌体组明显减少（P<0.01）。结论 HUVEC外泌体通过促进VEC和HSF的增殖、迁移，从而促进糖尿病兔创面愈合，而NRF2 和 ATF3 在这个过程中明显受到外泌体的影响，是外泌体作用的可能靶点。

超声清创法在烧伤残余创面中的应用及其临床疗效

何泽亮, 李锦, 随振阳, 张聚磊, 安亮恩, 刘玲玲, 张程亮, 姚媛媛, 仇树林, 李晓东

2022, 38(11): 1034-1039. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20211123-00396

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摘要:
目的探讨超声清创法在烧伤残余创面中的应用及其临床疗效。方法采用回顾性队列研究方法。2017年8月—2021年8月解放军联勤保障部队第980医院收治64例符合入选标准的烧伤残余创面患者，根据对残余创面采用的清创方法，将患者分为超声清创组［34例，男22例、女12例，年龄（31±13）岁］和传统清创组［30例，男19例、女11例、年龄（32±13）岁］。对2组患者创面行相应的清创后，根据患者创面所在部位及皮源情况选择邮票皮片或大张皮片进行移植治疗。对于Ⅰ期手术后未愈合创面，则行二次清创+植皮术，2组创面的清创方式均分别同其Ⅰ期。术后3 d，采用药物敏感试验检测创面中细菌情况并计算细菌阳性率。术后7 d，计算创面中皮片成活率及皮下血肿发生率。出院时，统计患者创面愈合时长及清创次数并计算二次清创率。对数据行独立样本t检验或χ²检验。结果术后3 d，超声清创组创面感染金黄色葡萄球菌者2例、铜绿假单胞菌者2例，传统清创组创面感染金黄色葡萄球菌者5例、铜绿假单胞菌者3例、鲍曼不动杆菌者1例、肺炎克雷伯菌者1例、阴沟肠杆菌者1例；超声清创组创面细菌阳性率明显低于传统清创组（χ²=5.51，P<0.05）。术后7 d，超声清创组创面的移植皮片成活率为（92±5）%，明显高于传统清创组的（84±10）%（χ²=6.78，P<0.01）；超声清创组创面皮下血肿发生率为17.6%（6/34），明显低于传统清创组的40.0%（12/30），χ²=3.94，P<0.05。出院时，超声清创组创面愈合时长为（11.0±2.0）d，明显短于传统清创组的（13.0±3.1）d，（t=3.81，P<0.01）；超声清创组创面二次清创率为2.9%（1/34），明显低于传统清创组的20.0%（6/30），χ²=4.76，P<0.05。结论超声清创法可显著减轻烧伤残余创面细菌负荷，减少术后血肿形成，促进移植皮片成活，从而缩短患者病程。

无神经吻合的股前外侧皮瓣修复手腕及手背部创面后感觉恢复规律

周耀, 巨积辉, 唐林峰, 王凯, 周荣, 郭礼平, 杨亮

2022, 38(11): 1040-1046. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20211014-00350

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摘要:
目的探讨无神经吻合的股前外侧皮瓣修复手腕及手背部创面后感觉恢复规律。方法采用横断面研究方法。将2018年1月—2020年12月在江苏省常熟市海虞卫生院和苏州瑞华骨科医院采用无神经吻合的股前外侧皮瓣游离移植修复手腕及手背部创面的且符合入选标准的患者纳入本研究。根据患者手术日与横断面调查日之间的时间间隔，将80例患者分为6个月组（男15例、女5例，年龄22~63岁）、12个月组（男16例、女4例，年龄21~65岁）、18个月组（男15例、女5例，年龄25~61岁）、24个月组（男14例、女6例，年龄20~65岁），每组20例。患者清创后的皮肤软组织缺损面积为6.0 cm×4.5 cm~18.0 cm×9.0 cm，股前外侧皮瓣切取面积为7 cm×5 cm~20 cm×10 cm、厚度为1.0~2.5 cm。将移植后皮瓣分为A区（近心端）、B/D区（两侧）、C区（远端）和E区（中央区域）。测试并比较前述5个区的痛觉、触觉、冷觉、温觉和两点辨别觉（2-PD）及整个皮瓣5种感觉的差异。对数据行单因素方差分析、Fisher确切概率法检验、 χ ²检验或McNemar检验。结果无神经吻合的股前外侧皮瓣A区中，与6个月组相比，12个月组患者皮瓣的痛觉、触觉、冷觉、温觉均恢复明显（ χ ²值分别为10.10、14.55、12.13、4.29， P<0.05或 P<0.01）；与12个月组相比，18个月组患者皮瓣的温觉恢复明显（ χ ²=5.23， P<0.05）。B区中，与6个月组相比，12个月组患者皮瓣的痛觉、触觉、冷觉均恢复明显（ χ ²值分别为5.58、3.96、4.29， P<0.05）；与12个月组相比，18个月组患者皮瓣的痛觉、触觉、冷觉、温觉均恢复明显（ χ ²值分别为5.58、3.96、7.03、12.38， P<0.05或 P<0.01）。C区中，与6个月组相比，12个月组患者皮瓣的痛觉恢复明显（ χ ²=4.80， P<0.05）；与12个月组相比，18个月组患者皮瓣的温觉恢复明显（ χ ²=10.16， P<0.01）。D区中，与6个月组相比，12个月组患者皮瓣的痛觉、触觉、冷觉均恢复明显（ χ ²值分别为5.58、4.29、3.96， P<0.05）；与12个月组相比，18个月组患者皮瓣的痛觉、触觉、冷觉、温觉均恢复明显（ χ ²值分别为5.58、4.29、3.96、10.10， P<0.05或 P<0.01）。E区中，与6个月组相比，12个月组患者皮瓣的冷觉恢复明显（ χ ²=4.80， P<0.05）；与12个月组相比，18个月组患者皮瓣的痛觉、触觉、温觉均恢复明显（ χ ²值分别为6.47、4.91、9.23， P<0.05或 P<0.01）。24个月组患者皮瓣5个区的5种感觉与18个月组均相似（ P>0.05）。各相邻2组间，患者皮瓣5个区的2-PD恢复情况均近似（ P>0.05）。12个月组患者皮瓣A区的痛觉、触觉、冷觉恢复均明显优于其他4个区（ P<0.05或 P<0.01），温觉恢复明显优于B区、C区、E区（ P<0.05或 P<0.01）；18个月组患者皮瓣A区的痛觉、触觉、冷觉、温觉恢复明显优于C区（ P<0.05）。与6个月组相比，12个月组患者整个皮瓣的痛觉、触觉、冷觉均恢复明显（ χ ²值分别为7.62、7.03、5.58， P<0.05或 P<0.01）；与12个月组患者整个皮瓣的痛觉、触觉、冷觉、温觉恢复者分别有10、11、10、4例相比，18个月组患者的17、17、16、14例均明显增多（ χ ²值分别为5.58、4.29、3.96、10.10， P<0.05或 P<0.01）。24个月组患者整个皮瓣的5种感觉与18个月组均相似（ P>0.05）。结论在修复手腕及手背部创面的无神经吻合的股前外侧皮瓣中，感觉从近端逐渐向远端恢复；其中整个皮瓣的触觉、痛觉、冷觉从术后6个月即开始恢复，至术后18个月进入恢复稳定期；温觉从术后12个月开始恢复，至术后18个月进入恢复稳定期；而大多数皮瓣的2-PD在术后2年仍未恢复。

Krüppel样因子4对脓毒症小鼠炎症反应与脏器损伤的作用

王运帷, 刘洋, 曹鹏, 张清怡, 陈阳, 李少珲, 官浩

2022, 38(11): 1047-1056. doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20220111-00005

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目的探讨Krüppel样因子4（KLF4）在巨噬细胞炎症反应中的表达特点与作用及其对脓毒症小鼠炎症反应与脏器损伤的作用，为烧创伤脓毒症的靶向治疗奠定理论基础。方法采用实验研究方法。取小鼠RAW264.7巨噬细胞与从10只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠中提取的原代腹腔巨噬细胞（PM）进行实验。采用内毒素/脂多糖（LPS）分别处理RAW264.7巨噬细胞与PM 0（未处理）、1、2、4、6、8、12、24 h构建巨噬细胞炎症反应模型，采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）法检测白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6、CC趋化因子配体2（CCL2）与肿瘤坏死因子α（TNF-α）mRNA表达，据此确定后续部分实验LPS处理时间。用LPS处理RAW264.7巨噬细胞0、8 h，采用免疫荧光法检测KLF4的定位与蛋白表达；利用高通量测序技术平台对细胞进行转录组测序，采用DESeq2软件筛选2种处理时间细胞间的差异表达基因（DEG）。采用LPS分别处理RAW264.7巨噬细胞与PM 0、1、2、4、6、8、12、24 h，分别用实时荧光定量RT-PCR法与蛋白质印迹法检测KLF4的mRNA与蛋白表达。将RAW264.7巨噬细胞按随机数字表法分为阴性对照组与KLF4过表达组，分别转染对应质粒后用LPS处理0、8 h，采用实时荧光定量RT-PCR法检测KLF4、IL-1β、IL-6、CCL2与TNF-α的mRNA表达，采用蛋白质印迹法检测KLF4蛋白表达。前述实验样本数均为3。将40只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为KLF4过表达组和阴性对照组（每组20只），分别注射相应转染注射液后构建盲肠结扎穿孔脓毒症模型。采用随机数字表法从2组小鼠中各选取12只，观察建模后72 h内生存情况。于建模后8 h取2组分别剩余的8只小鼠，先行眼球取血，采用酶联免疫吸附测定法检测血清中IL-1β、IL-6水平，采用干化学法检测血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）水平；后取心脏、肺脏、肝脏组织，行苏木精-伊红染色后观察损伤情况。对数据行独立样本t检验、Cochran&Cox近似t检验、单因素方差分析、Dunnett检验、Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析、Dunnett T3检验、log-rank（Mantel-Cox）检验。结果与LPS处理0 h比较，LPS处理6 h与8 h RAW264.7巨噬细胞中IL-1β mRNA表达、LPS处理4~12 h RAW264.7巨噬细胞中IL-6 mRNA表达、LPS处理8 h和12 h RAW264.7巨噬细胞中CCL2 mRNA表达以及LPS处理4~8 h RAW264.7巨噬细胞中TNF-α mRNA表达均显著上调（P<0.05或P<0.01），LPS处理4~8 h PM中IL-1β与CCL2 mRNA表达、LPS处理2~24 h PM中IL-6 mRNA表达以及LPS处理2~12 h PM中TNF-α mRNA表达均显著上调（P<0.05或P<0.01）。选取8 h作为后续部分实验的LPS处理时间。KLF4主要定位在RAW264.7巨噬细胞的细胞核中。与LPS处理0 h比较，LPS处理8 h RAW264.7巨噬细胞中KLF4蛋白表达明显减少；LPS处理8 h RAW264.7巨噬细胞中有1 470个差异表达显著的DEG，包括转录表达显著下调的KLF4［错误发现率<0.05，log₂（差异倍数）=-2.47］。与LPS处理0 h比较，LPS处理6~24 h RAW264.7巨噬细胞中KLF4 mRNA表达、LPS处理1~24 h RAW264.7巨噬细胞与PM中KLF4蛋白表达以及LPS处理4~24 h PM中KLF4的mRNA表达均明显降低（P<0.05或P<0.01）。与阴性对照组比较，KLF4过表达组LPS处理0、8 h RAW264.7巨噬细胞中KLF4的mRNA（t'值分别为17.03、8.61，P<0.05或P<0.01）与蛋白表达均明显升高，LPS处理0 h RAW264.7巨噬细胞中IL-6、CCL2的mRNA表达均明显升高（t值分别为6.29、3.40，P<0.05或P<0.01），LPS处理8 h RAW264.7巨噬细胞中IL-1β、IL-6、CCL2、TNF-α的mRNA表达均显著下降（t值分别为10.52、9.60、4.58、8.58，P<0.01）。KLF4过表达组小鼠建模后72 h内生存比例明显高于阴性对照组（χ²=4.01，P<0.05）。建模后8 h，KLF4过表达组小鼠血清中IL-1β、IL-6与ALT、AST水平分别为（161±63）、（476±161）pg/mL与（144±24）、（264±93）U/L，明显低于阴性对照组的（257±58）、（654±129）pg/mL与（196±27）、（407±84）U/L（t值分别为3.16、2.44与4.04、3.24，P<0.05或P<0.01）。建模后8 h，与阴性对照组比较，KLF4过表达组小鼠心脏、肺脏、肝脏的组织结构紊乱减轻，炎性渗出明显减少，脏器实质细胞病理样改变明显减轻。结论 KLF4在LPS诱导的巨噬细胞炎症反应中表达显著下降，显著抑制巨噬细胞炎症反应；KLF4显著提高脓毒症小鼠生存率并缓解炎症反应与脓毒症相关脏器损伤。

猪真皮深层组织错位损伤对皮肤纤维化的影响

余小平, 刘英开, 马先, 唐佳俊, 牛轶雯, 周军利, 陆树良

2022, 38(11): 1057-1065. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20210831-00301

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摘要:
目的探讨猪真皮深层组织错位损伤对皮肤纤维化的影响，以期为烧伤瘢痕治疗提供一定的理论依据。方法采用实验研究方法。取6只2个月龄雌性杜洛克猪，将背部右侧切取中厚皮片和真皮深层组织片并原位回植的15个术区纳入真皮原位回植组，将背部左侧切取中厚皮片和真皮深层组织片并将真皮深层组织片放在脂肪层下的15个术区纳入真皮错位组。观察2组伤后7、14、21 d术区毛发生长情况及伤后14 d横断面结构。伤后7、14、21 d，测量并比较2组术区皮肤厚度（表皮到脂肪上缘的距离）、真皮厚度（表皮下缘到脂肪上缘的距离，不包括真皮和脂肪间的纤维组织厚度）、真皮-脂肪界面（真皮原位回植组为真皮深层下缘至脂肪上缘、真皮错位组为真皮浅层下缘至脂肪上缘）的纤维组织厚度，测量真皮原位回植组术区真皮切割界面（真皮浅层下缘至真皮深层上缘）纤维组织厚度并与真皮-脂肪界面纤维组织厚度进行比较；行天狼猩红染色，观测并比较2组术区真皮-脂肪界面及真皮原位回植组术区真皮切割界面和真皮-脂肪界面Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量；行免疫组织化学染色观察2组术区增殖细胞核抗原（PCNA）、转化生长因子β₁（TGF-β₁）、成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、肝细胞生长因子（HGF）的阳性表达。样本数均为6。对数据行独立样本t检验。结果伤后7、14、21 d，真皮原位回植组术区毛发均较真皮错位组浓密。伤后14 d，真皮错位组术区皮肤横断面呈“三明治”样结构，真皮原位回植组术区皮肤横断面结构正常。伤后7、14、21 d，真皮错位组术区皮肤厚度分别为（4 234±186）、（4 688±360）、（4 548±360）μm，与真皮原位回植组的（4 425±156）、（4 714±141）、（4 310±473）μm均相近（P>0.05）；真皮错位组术区真皮厚度均较真皮原位回植组明显变薄（t值分别为-9.73、-15.85、-15.41，P<0.01）；真皮错位组术区真皮-脂肪界面纤维组织厚度均较真皮原位回植组明显增厚（t值分别为14.48、20.58、15.67，P<0.01）；真皮原位回植组术区真皮-脂肪界面和真皮切割界面纤维组织厚度均无明显差异（P>0.05）。伤后7、14、21 d，真皮错位组术区真皮-脂肪界面Ⅲ型胶原蛋白含量均较真皮原位回植组明显增加（t值分别为2.65、0.61、7.39，P<0.05或P<0.01），而2组术区真皮-脂肪界面Ⅰ型胶原蛋白含量均无明显差异（P>0.05）；真皮原位回植组术区真皮-脂肪界面与真皮切割界面Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量均无明显差异（P>0.05）。伤后7、14、21 d，真皮错位组术区真皮浅层和脂肪组织中均有PCNA、TGF-β₁、FGF-2、HGF阳性表达，真皮原位回植组术区真皮浅层、真皮深层和脂肪层均有PCNA、TGF-β₁、FGF-2、HGF阳性表达。结论猪真皮组织固有厚度不足是引起纤维化的关键因素，纤维化的生物学目的旨在“补偿”皮肤的固有厚度，脂肪组织也可能是影响皮肤纤维化修复的重要组成部分。

生物强度电场对人表皮细胞株HaCaT微管乙酰化的调节作用

邬亚婷, 张泽, 冀然, 张书豪, 王文平, 武潮, 张家平, 江旭品, 张恒术

2022, 38(11): 1066-1072. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20211105-00377

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摘要:
目的探讨生物强度电场对人表皮细胞株HaCaT方向性迁移及微管乙酰化水平的调节作用，以期为临床创面修复提供分子理论依据。方法采用实验研究方法。取HaCaT细胞，分为置于电场装置中不通电处理3 h的模拟电场组和用强度200 mV/mm电场处理3 h的电场处理组（处理方法下同，样本数分别为54、52），在活细胞工作站中观察处理3 h内细胞运动的方向并计算细胞运动的位移速度、轨迹速度及运动方向性cosθ。取2批HaCaT细胞，分为模拟电场组和用强度200 mV/mm的电场处理相应时间的电场处理1 h组、电场处理2 h组、电场处理3 h组及模拟电场组和用相应强度的电场处理3 h的100 mV/mm电场组、200 mV/mm电场组、300 mV/mm电场组，采用蛋白质印迹法检测乙酰化α-微管蛋白的表达（样本数均为3）。取HaCaT细胞，分为模拟电场组和电场处理组，采用免疫荧光法观测乙酰化α-微管蛋白的表达及定位（样本数为3）。对数据行Kruskal-Wallis H检验、Mann-Whitney U检验、Bonferroni校正、单因素方差分析、LSD检验及独立样本t检验。结果处理3 h内，与模拟电场组相比，电场处理组细胞有明显定向迁移的趋势，位移速度、轨迹速度均明显加快（Z值分别为-8.53、-2.05，P<0.05或P<0.01），方向性明显增强（Z=-8.65，P<0.01）。与模拟电场组（0.80±0.14）比较，电场处理1 h组、电场处理2 h组细胞中乙酰化α-微管蛋白表达量（1.50±0.08、1.89±0.06）均无明显变化（P>0.05），电场处理3 h组细胞乙酰化α-微管蛋白表达量（3.37±0.36）明显增高（Z=-3.06，P<0.05）。处理3 h，100 mV/mm电场组、200 mV/mm电场组、300 mV/mm电场组细胞乙酰化α-微管蛋白表达量分别为1.63±0.05、2.24±0.08、2.00±0.13，均较模拟电场组的0.95±0.27明显增高（P<0.01）；200 mV/mm电场组、300 mV/mm电场组细胞乙酰化α-微管蛋白表达量均较100 mV/mm电场组明显增高（P<0.01）；300 mV/mm电场组细胞乙酰化α-微管蛋白表达量较200 mV/mm电场组明显降低（P<0.05）。处理3 h，电场处理组细胞中乙酰化α-微管蛋白的分布较模拟电场组更具有方向性，电场处理组细胞乙酰化α-微管蛋白的表达量较模拟电场组明显增高（t=5.78，P<0.01）。结论生物强度电场可促进HaCaT细胞定向迁移，在200 mV/mm电场强度下处理3 h可明显促进微管乙酰化水平。

烧伤专科护士人文关怀能力现状的横断面调查及影响因素分析

蒋琦琦, 张寅, 乔亮, 查庆华, 解琳, 骆智臻

2022, 38(11): 1073-1078. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20210318-00092

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摘要:
目的调查烧伤专科护士人文关怀能力的现状并分析其影响因素。方法采用单中心横断面调查研究方法。2020年5—8月，选择上海交通大学医学院附属瑞金医院符合入选标准的63名烧伤专科护士，采用自制一般资料调查问卷调查其性别、年龄、职称、工作年限、是否接受过人文关怀培训、学历等17个指标，采用关怀能力量表（CAI）评估其人文关怀能力。将护士按一般资料分类后，统计CAI总得分，对数据行独立样本t检验、单因素方差分析。将护士的CAI总得分及认知、勇气和耐心维度得分与国际常模进行比较。选取单因素分析中差异有统计学意义的指标行多元线性回归分析，筛选烧伤专科护士人文关怀能力的独立影响因素。结果本次调查共回收问卷63份，均有效。63名护士中男4名、女59名，年龄以20~30岁为主（30名，占47.62%），职称以护师为主（36名，占57.14%），工作年限多>10年（28名，占44.44%），32名护士未接受过人文关怀培训，学历多为大学专科（37名，占58.73%）。不同年龄、职称、工作年限、接受过人文关怀培训、学历护士的CAI总得分差异明显（F值分别为53.95、49.14、75.42，t值分别为6.08、-2.82，P<0.01）。本组护士CAI认知、勇气、耐心维度得分和总得分均明显低于国际常模（t值分别为-2.02、-2.04、-6.19、-3.89，P<0.05或P<0.01）。多元线性回归分析显示，年龄、工作年限、职称、是否接受过人文关怀培训是烧伤专科护士人文关怀能力的独立影响因素（95%置信区间分别为1.91~23.23、16.25~31.48、1.05~19.09、6.72~31.82，非标准化回归系数分别为12.57、23.86、10.07、19.27，P<0.05或P<0.01）。结论烧伤专科护士人文关怀能力较弱。烧伤专科护士的年龄、职称、工作年限、是否接受过人文关怀培训是其人文关怀能力的独立影响因素。

音乐疗法对烧伤患者创面换药疼痛和焦虑干预效果的荟萃分析

李烨, 刘芳丽, 袁举, 李静, 刘子薇, 关宁笑

2022, 38(11): 1079-1084. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20210716-00252

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摘要:
目的评价音乐疗法在烧伤患者创面换药疼痛及焦虑中的干预效果。方法采用荟萃分析方法。以“音乐、烧伤、创面换药/伤口换药、疼痛/操作性疼痛”为中文检索词，检索《中国知网》《万方数据库》《维普数据库》，以“music、burn、dressing change/wound dressing、pain/ache/sore”为英文检索词，检索《PubMed》《Embase》《Cochrane Library》，收集各数据库自建库起至2021年5月公开发表的关于音乐疗法应用于烧伤患者创面换药中的随机对照试验。结局指标包括换药后疼痛评分/百分比、换药后焦虑评分。采用Rev Man 5.4和Stata 14.0统计软件对符合纳入标准的研究进行荟萃分析。结果共纳入7篇文献520例烧伤患者，包括接受音乐治疗的音乐疗法组260例患者和接受常规换药的常规换药组260例患者。纳入的7项研究偏倚风险不确定。与常规换药组比较，音乐疗法组患者换药后疼痛百分比（相对危险度=0.06，95%置信区间为0.01~0.41，P<0.01）、疼痛评分均明显降低［标准化均数差（SMD）=-0.91，95%置信区间为-1.61~-0.22，P<0.05］。亚组分析显示，音乐类型和干预时机可能是换药后疼痛评分的异质性来源。音乐疗法组患者换药后焦虑评分明显低于常规换药组（SMD=-0.64，95%置信区间为-1.09~-0.19，P<0.01）。换药后疼痛评分、换药后焦虑评分均不存在发表偏倚（Ρ>0.05）。结论音乐疗法可减轻烧伤患者创面换药过程中的疼痛及焦虑水平。

糖尿病足溃疡难愈合机制研究进展

王宁, 鞠上

2022, 38(11): 1085-1089. doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20220227-00038

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摘要:
糖尿病足溃疡患病人数逐年递增，糖尿病足溃疡难愈合，给国家及个人带来巨大负担。如何加速糖尿病足溃疡愈合成为研究的重点，但目前其难愈合机制尚未被完全阐明，各机制之间关联性不高，因此其临床标准化和精准化诊疗仍面临若干挑战。该文结合国内外临床研究与基础研究进展，围绕慢性炎症、细菌生物膜形成、高氧化应激、生长因子抑制、微循环障碍、晚期糖基化终末产物积累等导致糖尿病足溃疡难愈合的具体机制进行综述。

软组织三维生物打印与其配套装备研发的进展

胡妍珂, 陈姝颖, 周飞, 熊雅慧, 陈蕾, 祁少海

2022, 38(11): 1090-1095. doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20210922-00327

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摘要:
三维生物打印作为组织工程的前沿技术，可以精确打印仿生组织，在骨骼、牙齿等硬组织打印领域取得了巨大的进展，软组织生物打印的研究也飞速发展。该文主要就软组织三维生物打印技术以及打印软件、打印硬件、配套耗材、生物反应器等配套装备的研发进展进行阐述，并对其未来研发方向进行展望。

甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶在创面修复领域中的应用研究进展

丁能, 付新新, 吴海媚, 朱鴷

2022, 38(11): 1096-1100. doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20220308-00056

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摘要:
创面修复是临床中常见难题，严重影响患者生活质量，也给社会带来沉重负担。基于水凝胶开发的多功能敷料在治疗急性和慢性创面中显示了较强的潜力。甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶除具备良好的组织相容性、细胞黏附性和生物可降解性等优势外，还因成本低廉、反应条件温和、理化性质可调节、临床应用广泛等而备受关注。该文介绍了GelMA水凝胶的特征及其在创面修复领域中的应用研究进展，并对用于治疗创面的多功能GelMA水凝胶敷料的未来发展进行了展望。

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