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P311对人微血管内皮细胞1体外血管形成能力的影响及其分子机制

王淞 李海胜 钱卫 张小容 贺伟峰 罗高兴

王淞, 李海胜, 钱卫, 等. P311对人微血管内皮细胞1体外血管形成能力的影响及其分子机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(2): 119-129. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20211210-00410.
引用本文: 王淞, 李海胜, 钱卫, 等. P311对人微血管内皮细胞1体外血管形成能力的影响及其分子机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(2): 119-129. DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20211210-00410.
Wang S,Li HS,Qian W,et al.Effects of P311 on the angiogenesis ability of human microvascular endothelial cell 1 in vitro and its molecular mechanism[J].Chin J Burns Wounds,2022,38(2):119-129.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20211210-00410.
Citation: Wang S,Li HS,Qian W,et al.Effects of P311 on the angiogenesis ability of human microvascular endothelial cell 1 in vitro and its molecular mechanism[J].Chin J Burns Wounds,2022,38(2):119-129.DOI: 10.3760/cma.j.cn501120-20211210-00410.

P311对人微血管内皮细胞1体外血管形成能力的影响及其分子机制

doi: 10.3760/cma.j.cn501120-20211210-00410
基金项目: 

国家自然科学基金重点项目 81630055

国家自然科学基金青年科学基金项目 82102340

湖北省自然科学基金 2020CFB210

详细信息
    通讯作者:

    罗高兴,Email:logxw@yahoo.com

Effects of P311 on the angiogenesis ability of human microvascular endothelial cell 1 in vitro and its molecular mechanism

Funds: 

Key Program of National Natural Science Foundation of China 81630055

Youth Science Foundation Project of National Natural Science Foundation of China 82102340

Hubei Provincial Natural Science Foundation 2020CFB210

More Information
    Corresponding author: Luo Gaoxing, Email: logxw@yahoo.com
  • 摘要:       目的     探讨P311对人微血管内皮细胞1(HMEC-1)血管形成能力的影响及其可能的分子机制。      方法     采用实验研究方法。取HMEC-1,按随机数字表法(分组方法下同)分为P311腺病毒组和空载腺病毒组,分别进行48 h相应转染后,采用细胞计数试剂盒8法检测培养1、3、5 d细胞增殖活性;划痕试验检测细胞划痕后6、11 h剩余划痕面积,并计算剩余划痕面积百分比;体外血管形成实验观察细胞培养8 h血管形成情况,并测量管状结构节点数和总长度;蛋白质印迹法检测细胞中血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、磷酸化VEGFR2、胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)及磷酸化ERK1/2蛋白表达量。取HMEC-1,分为P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA(siRNA)组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组,分别进行相应的处理,蛋白质印迹法检测转染24 h细胞中VEGFR2、磷酸化VEGFR2、ERK1/2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量;体外血管形成实验观察转染24 h细胞血管形成情况,并测量管状结构节点数和总长度。取HMEC-1,分为P311腺病毒+二甲基亚砜(DMSO)组、空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组,分别进行相应的处理。蛋白质印迹法检测处理2 h细胞中ERK1/2及磷酸化ERK1/2蛋白表达量;体外血管形成实验观察处理2 h细胞血管形成情况,并测量管状结构节点数和总长度。各组各时间点样本数均为6。对数据行独立样本t检验、重复测量方差分析、单因素方差分析、LSD检验。      结果     与空载腺病毒组比较,P311腺病毒组细胞培养1、3、5 d增殖活性均没有明显改变(t值分别为-0.23、-1.30、-1.52,P>0.05)。P311腺病毒组细胞划痕后6、11 h剩余划痕面积百分比均较空载腺病毒组明显降低(t值分别为-2.47、-2.62,P<0.05)。培养8 h,与空载腺病毒组比较,P311腺病毒组细胞管状结构节点数和总长度均明显增加(t值分别为4.49、4.78,P<0.01)。转染48 h,与空载腺病毒组比较,P311腺病毒组细胞VEGFR2、ERK1/2蛋白表达量均无明显变化(P>0.05),磷酸化VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显升高(t值分别为17.27、16.08,P<0.01)。转染24 h,P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞磷酸化VEGFR2和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于空载腺病毒+阴性对照siRNA组(P<0.01),P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞VEGFR2、磷酸化VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组(P<0.01),空载腺病毒+阴性对照siRNA组细胞VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组(P<0.05或P<0.01)。转染24 h,P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞管状结构节点数为(720±62)个,明显多于空载腺病毒+阴性对照siRNA组的(428±38)个、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组的(364±57)个(P值均<0.01);P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞管状结构总长度为(21 241±1 139)μm,明显长于空载腺病毒+阴性对照siRNA组的(17 005±1 156)μm、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组的(13 494±2 465)μm(P值均<0.01)。空载腺病毒+阴性对照siRNA组细胞管状结构节点数明显多于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组的(310±75)个(P<0.01),管状结构总长度明显长于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组的(11 600±2 776)μm(P<0.01)。处理2 h,P311腺病毒+DMSO组细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显高于空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组(P值均<0.01),空载腺病毒+DMSO组细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显高于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组(P<0.05)。处理2 h,P311腺病毒+DMSO组细胞管状结构节点数为(726±72)个,明显多于空载腺病毒+DMSO组的(421±39)个、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组的(365±41)个(P值均<0.01);P311腺病毒+DMSO组细胞管状结构总长度为(20 318±1 433)μm,明显长于空载腺病毒+DMSO组的(16 846±1 464)μm、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组的(15 114±1 950)μm(P值均<0.01)。空载腺病毒+DMSO组管状结构节点数明显多于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组的(317±67)个(P<0.01),管状结构总长度明显长于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组的(13 188±2 306)μm(P<0.01)。      结论     P311能够通过激活VEGFR2/ERK1/2信号通路发挥促进HMEC-1血管形成的作用。

     

  • 创面是临床常见病症1,创面血管新生是创面修复的关键环节之一2。血管新生是一个受到精确调控的病理生理过程3,该过程涉及多种细胞与细胞因子4, 5,其中微血管内皮细胞是参与此过程的主要功能细胞6,它们在多种细胞因子及信号通路的精确调控下,通过迁移、增殖、芽生等形成新生血管7, 8, 9

    P311,官方基因符号NERP,定位于人5号染色体和小鼠18号染色体上,编码分子量为8×103的胞内蛋白,该蛋白是一种在种属间高度保守的多功能蛋白10。研究表明,P311蛋白在组织纤维化11, 12, 13, 14、神经系统疾病15、肿瘤浸润16, 17、血压维持18、组织再生19, 20等多方面发挥重要作用。近年来研究表明,P311在创面愈合中发挥重要作用21, 22, 23。本课题组前期研究表明,人皮肤微血管内皮细胞在静息状态下低表达P311,在炎症刺激条件下高表达P311,进而参与创面血管新生2224,但目前P311参与血管新生的机制仍不清楚。因此,本课题组通过前期构建的P311腺病毒转染人微血管内皮细胞1(HMEC-1),使之高表达P311,从而模拟创面愈合过程中P311的表达模式,进而探讨P311对HMEC-1体外血管形成能力的影响及其可能的分子机制。

    基质胶购自美国Corning公司,HMEC系购自美国典型培养物保藏中心,MCDB131培养基购自美国Gibco公司,二甲基亚砜(DMSO)购自德国Meck公司,脂质体2000购自北京索莱宝科技有限公司,细胞计数试剂盒8(CCK-8)、二辛丁酸蛋白浓度测定试剂盒购自海门市碧云天生物技术研究所,VEGF受体2(VEGFR2)、小干扰RNA(siRNA)和阴性对照siRNA均购自广州锐博生物科技有限公司,胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)抑制剂SCH772984购自上海蓝木化工有限公司,兔抗小鼠VEGFR2单克隆抗体、兔抗小鼠磷酸化VEGFR2单克隆抗体、兔抗小鼠ERK1/2单克隆抗体、兔抗小鼠磷酸化ERK1/2单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司,小鼠源性GAPDH单克隆抗体购自上海康成生物工程有限公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体和山羊抗小鼠IgG多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。710 型多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher公司,LSM510 Meta型活细胞工作站购自德国Zeiss公司,IX71型倒置相差显微镜购自日本Olympus公司,ChemiDoc XRS型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

    将含有10 ng/mL EGF、10 mmol/L谷氨酰胺、1 µg/mL氢化可的松和体积分数10%胎牛血清的MCDB131培养基(以下称完全培养基)加入底面积25 cm2的培养瓶后,将1×106个HMEC-1接种至该培养瓶中培养,每隔2 d换液1次,待细胞生长达85%融合以上,使用2.5 g/L胰蛋白酶+0.1 g/L乙二胺四乙酸消化后,按1∶3进行细胞传代。取第3~5代细胞用于后续实验。

    1.3.1   细胞分组及处理

    用完全培养基调整HMEC-1浓度为1×105个/mL,接种于6孔板中,每孔1 mL。待细胞生长达60%左右融合时,将其按随机数字表法(分组方法下同)分为P311腺病毒组和空载腺病毒组。P311腺病毒组细胞每孔加入10 μL P311腺病毒,空载腺病毒组细胞每孔加入10 μL空载腺病毒(P311腺病毒和空载腺病毒均由本课题组前期构建),转染48 h后,收集细胞用于后续实验。

    1.3.2   CCK-8法检测P311高表达对HMEC-1增殖活性的影响

    取P311腺病毒组和空载腺病毒组细胞,用完全培养基调整细胞浓度为2×104个/mL,接种于96孔板中,每孔100 μL,每组3个复孔。于培养1、3、5 d,分别使用CCK-8法检测2组细胞增殖活性。检测时,吸弃原有培养基,将完全培养基和CCK-8溶液按体积比10∶1混合,每孔加入混合液100 μL,37 ℃孵育2 h,使用多功能酶标仪测定波长450 nm处的吸光度值,以此代表细胞增殖活性。本实验重复6次。

    1.3.3   划痕试验检测P311高表达对HMEC-1迁移能力的影响

    取P311腺病毒组和空载腺病毒组细胞,用完全培养基调整细胞浓度为2×104个/mL,接种于24孔板中,每孔1 mL,每组3个复孔。待细胞生长达90%以上融合时,吸弃原有培养基,加入500 μL含2.5 μg/mL丝裂霉素C的完全培养基继续培养2 h。使用100 μL移液枪枪头和直尺在HMEC-1单细胞层上做一直线划痕。吸弃原有培养基,加入PBS冲洗2遍,加入新鲜完全培养基。将细胞置于活细胞工作站倒置相差显微镜200倍镜下观察11 h,记录细胞迁移情况。使用ImageJ 1.48V图像分析软件(美国国立卫生研究院)测量划痕后0(即刻)、6、11 h剩余划痕面积,并计算剩余划痕面积百分比。剩余划痕面积百分比=剩余划痕面积÷初始划痕面积×100%。本实验重复6次。

    1.3.4   体外血管形成实验检测P311高表达对HMEC-1血管形成能力的影响

    首先将50 μL基质胶加入预冷的96孔板中,在37 ℃培养箱中放置45 min。然后加入用无血清MCDB131培养基培养24 h的P311腺病毒组和空载腺病毒组细胞,用完全培养基调整细胞浓度为4×105个/mL,每孔50 μL,每组3个复孔,在37 ℃培养箱中培养8 h,倒置相差显微镜200倍镜下观察血管形成情况并拍照,采用ImageJ 1.48V图像分析软件测量管状结构节点数和总长度。本实验重复6次。

    1.3.5   蛋白质印迹法检测P311高表达对VEGFR2/ERK1/2信号通路的影响

    取P311腺病毒组和空载腺病毒组细胞,充分裂解后, 以离心半径10 cm、14 000 r/min离心15 min后收集上清液,二辛丁酸法进行蛋白定量。向上样孔内加入20 μg待测蛋白质样品,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,湿法转膜后,用30 g/L牛血清白蛋白溶液封闭3 h,分别加入兔抗小鼠VEGFR2单克隆一抗、兔抗小鼠磷酸化VEGFR2单克隆一抗、兔抗小鼠ERK1/2单克隆一抗、兔抗小鼠磷酸化ERK1/2单克隆一抗(稀释比均为1∶1 000)及小鼠源性GAPDH单克隆一抗(稀释比为1∶10 000),4 ℃孵育过夜。次日取出抗体孵育盒,室温下静置1 h,洗涤后分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆二抗和山羊抗小鼠IgG多克隆二抗(稀释比均为1∶2 000),室温孵育1 h。化学发光液浸泡条带后,凝胶成像仪下曝光,并采集图像,Quantity one软件进行灰度值分析,VEGFR2、ERK1/2的蛋白表达量分别以其与GAPDH灰度值比值表示,磷酸化VEGFR2、磷酸化ERK1/2的蛋白表达量分别以其与VEGFR2、ERK1/2的灰度值比值表示。本实验重复6次。

    1.4.1   蛋白质印迹法检测siRNA-VEGFR2对P311高表达引起的VEGFR2/ERK1/2信号通路活化的影响

    用完全培养基调整HMEC-1浓度为1×105个/mL,接种于6孔板中,每孔1 mL。待细胞生长达60%左右融合时,分为P311腺病毒+阴性对照siRNA组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组,每组3个复孔。P311腺病毒+阴性对照siRNA组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组细胞每孔分别加入10 μL P311腺病毒、空载腺病毒,24 h后,再采用脂质体2000转染终物质的量浓度50 nmol/L阴性对照siRNA;P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组细胞每孔分别加入10 μL P311腺病毒、空载腺病毒,24 h后,采用脂质体2000转染终物质的量浓度50 nmol/L的siRNA-VEGFR2(靶基因序列为5'-GGAAATCTCTTGCAAGCTA-3')。转染24 h,同1.3.5采用蛋白质印迹法检测VEGFR2、磷酸化VEGFR2、ERK1/2、磷酸化ERK1/2的蛋白表达情况。本实验重复6次。

    1.4.2   体外血管形成实验检测siRNA-VEGFR2对P311高表达介导的血管形成作用的影响

    取HMEC-1,同1.4.1分组及处理,同1.3.4检测各组细胞体外血管形成情况。本实验重复6次。

    1.4.3   蛋白质印迹法检测ERK1/2抑制剂对P311高表达引起的ERK1/2信号通路活化的影响

    取HMEC-1,用完全培养基调整HMEC-1浓度为1×105个/mL,接种于6孔板中,每孔1 mL,待细胞生长达60%左右融合时,分为P311腺病毒+DMSO组、载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组,每组1孔。P311腺病毒+DMSO组和空载腺病毒+DMSO组细胞每孔分别加入10 μL P311腺病毒、空载腺病毒,24 h后,加入10 μL DMSO处理2 h;P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组细胞每孔分别加入10 μL P311腺病毒、空载腺病毒,24 h后,加入终物质的量浓度5 nmol/L ERK1/2抑制剂SCH772984处理2 h。 同1.3.5采用蛋白质印迹法检测ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达情况。本实验重复6次。

    1.4.4   体外血管形成实验检测ERK1/2抑制剂对P311高表达介导的血管形成作用的影响

    取HMEC-1,同1.4.3分组及处理,同1.3.4检测各组细胞体外血管形成情况。本实验重复6次。

    采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。所有计量资料数据均符合正态分布,以x¯±s表示。2组多个时间点组间总体比较行重复测量方差分析,组间两两比较进行独立样本t检验;多组间单一时间点总体比较行单因素方差分析,组间两两比较行LSD检验(软件自动略去该统计量值)。P<0.05为差异有统计学意义。

    2.1.1   细胞增殖活性

    与空载腺病毒组比较,P311腺病毒组细胞培养各时间点增殖活性均没有明显改变(P>0.05),见表1

    表1  2组人微血管内皮细胞1培养各时间点增殖活性比较(x¯±s
    组别样本数1 d3 d5 d
    P311腺病毒组60.188±0.0300.415±0.0320.713±0.030
    空载腺病毒组60.185±0.0190.392±0.0300.687±0.031
    t-0.23-1.30-1.52
    P0.8220.2220.160
    注:处理因素主效应,F=5.10,P=0.074;时间因素主效应,F=720.12,P<0.001;两者交互作用,F=0.81,P=0.473
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    2.1.2   细胞迁移能力

    P311腺病毒组细胞划痕后6、11 h剩余划痕面积百分比较空载腺病毒组明显降低(P<0.05),见表2图1

    表2  2组人微血管内皮细胞1划痕后各时间点剩余划痕面积百分比比较(%,x¯±s
    组别样本数6 h11 h
    P311腺病毒组647±79±5
    空载腺病毒组655±520±10
    t-2.47-2.62
    P0.0330.025
    注:初始剩余划痕面积百分比均为100%;处理因素主效应,F=18.42,P=0.008;时间因素主效应,F=443.86,P<0.001;两者交互作用,F=7.89,P=0.041
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    1  2组人微血管内皮细胞1划痕后各时间点剩余划痕面积 倒置相差显微镜×200,图中标尺为100 μm。1A、1B、1C.分别为P311腺病毒组划痕后0(即刻)、6、11 h,随着划痕后时间的延长,剩余划痕面积逐渐减少,至划痕后11 h划痕基本愈合;1D、1E、1F.分别为空载腺病毒组划痕后0、6、11 h,图1E、1F剩余划痕面积分别较图1B、1C明显增大
    2.1.3   细胞血管形成能力

    培养8 h,P311腺病毒组细胞管状结构节点数为(731±104)个,明显多于空载腺病毒组的(496±74)个(t=4.49,P=0.001);P311腺病毒组细胞管状结构总长度为(19 231±2 647)μm,明显长于空载腺病毒组[(12 670±2 077)μm,t=4.78,P=0.001]。见图2

    2  2组人微血管内皮细胞1培养8 h血管形成情况 倒置相差显微镜×200,图中标尺为100 μm。2A. P311腺病毒组管状结构节点数较多,管状结构总长度较长;2B.空载腺病毒组管状结构节点数少于图2A,管状结构总长度短于图2A
    2.1.4   细胞中VEGFR2/ERK1/2信号通路

    转染48 h,与空载腺病毒组比较,P311腺病毒组细胞VEGFR2、ERK1/2蛋白表达量均无明显变化(t值分别为0.28、1.36,P值分别为0.786、0.202),磷酸化VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显升高(t值分别为17.27、16.08,P<0.001)。见图3

    3  蛋白质印迹法检测2组人微血管内皮细胞1转染48 h VEGFR2/ERK1/2信号通路相关蛋白的表达量。3A.条带图;3B.条图(样本数为6,x¯±s
    注:VEGFR2为血管内皮生长因子受体2,ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条带图上方1、2分别为P311腺病毒组和空载腺病毒组;与空载腺病毒组比较,aP<0.01
    2.2.1   siRNA-VEGFR2对P311高表达引起的VEGFR2/ERK1/2信号通路活化的影响

    转染24 h,P311腺病毒+阴性对照siRNA组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组细胞磷酸化VEGFR2、VEGFR2和磷酸化ERK1/2蛋白表达量总体比较,差异均有统计学意义(F值分别为27.89、25.07、14.20,P<0.001);4组间细胞ERK1/2蛋白表达量总体比较,差异无统计学意义(F=0.08,P=0.971)。

    转染24 h,P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞磷酸化VEGFR2和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于空载腺病毒+阴性对照siRNA组(P值分别为<0.001、0.001),2组细胞VEGFR2和ERK1/2蛋白表达量相近(P值分别为0.063、0.640)。P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞VEGFR2、磷酸化VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组(P<0.001),2组细胞ERK1/2蛋白表达量相近(P=0.822)。空载腺病毒+阴性对照siRNA组细胞VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组(P值分别为<0.001、0.049),该2组细胞磷酸化VEGFR2和ERK1/2蛋白表达量相近(P值分别为0.071、0.761)。转染24 h,P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组细胞VEGFR2、磷酸化VEGFR2、ERK1/2和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均相近(P值分别为0.155、0.493、0.952、0.314)。见图4

    4  蛋白质印迹法检测4组人微血管内皮细胞1转染24 h VEGFR2/ERK1/2信号通路相关蛋白的表达量。4A.条带图;4B.条图(样本数为6,x¯±s
    注:VEGFR2为血管内皮生长因子受体2,ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条带图上方1、2、3、4分别为P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA(siRNA)组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA- VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组;与P311腺病毒+阴性对照siRNA组比较,aP<0.01;与空载腺病毒+阴性对照siRNA组比较,bP<0.01,cP<0.05
    2.2.2   siRNA-VEGFR2对P311高表达介导的血管形成能力的影响

    转染24 h,P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞管状结构节点数明显多于空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组(P值均<0.01),管状结构总长度明显长于空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组(P值均<0.01)。转染24 h,空载腺病毒+阴性对照siRNA组细胞管状结构节点数明显多于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组(P<0.01),管状结构总长度明显长于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组(P<0.01)。P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组细胞管状结构节点数和管状结构总长度相近(P>0.05)。见图5表3

    5  4组人微血管内皮细胞1转染24 h血管形成情况 倒置相差显微镜×200,图中标尺为100 μm。5A.P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA(siRNA)组管状结构节点数较多,管状结构总长度较长;5B.空载腺病毒+阴性对照siRNA组管状结构节点数明显少于图5A,管状结构总长度明显短于图5A;5C.P311腺病毒+siRNA-血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)组管状结构节点数明显少于图5A,管状结构总长度明显短于图5A;5D.空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组管状结构节点数明显少于图5B,管状结构总长度明显短于图5B,且均与图5C相近
    表3  4组人微血管内皮细胞1转染24 h后血管形成情况(x¯±s
    组别样本数管状结构节点数(个)管状结构总长度(μm)
    P311腺病毒+阴性对照siRNA组6720±6221 241±1 139
    空载腺病毒+阴性对照siRNA组6428±3817 005±1 156
    P311腺病毒+siRNA- VEGFR2组6364±5713 494±2 465
    空载腺病毒+siRNA- VEGFR2组6310±7511 600±2 776
    F57.0726.32
    P<0.001<0.001
    P1<0.0010.002
    P2<0.001<0.001
    P30.002<0.001
    P40.1270.121
    注:F值、P值为4组间各指标总体比较所得;P1值、P2值分别为P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA(siRNA)组与空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)组比较所得,P3值、P4值分别为空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组与空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组比较所得
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    2.2.3   ERK1/2抑制剂对P311高表达引起的ERK1/2信号通路活化的影响

    处理2 h,P311腺病毒+DMSO组、空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达量总体比较,差异有统计学意义(F=16.79,P<0.001);4组细胞ERK1/2 蛋白表达量总体比较,差异无统计学意义(F=0.99,P=0.419)。

    P311腺病毒+DMSO组细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显高于空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组(P值均<0.001),P311腺病毒+DMSO组与空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组细胞ERK1/2蛋白表达量均相近(P值分别为0.806、0.467)。空载腺病毒+DMSO组细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显高于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组(P=0.030),2组细胞ERK1/2 蛋白表达量相近(P=0.140)。P311腺病毒+ERK1/2 抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组细胞磷酸化ERK1/2和ERK1/2蛋白表达量均相近(P值分别为0.591、0.373)。见图6

    6  蛋白质印迹法检测4组人微血管内皮细胞1处理2 h ERK1/2信号通路相关蛋白的表达量。6A.条带图;6B.条图(样本数为6,x¯±s
    注:F值、P值为4组间各指标总体比较所得;ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条带图上方1、2、3、4分别为P311腺病毒+二甲基亚砜(DMSO)组、空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组;与P311腺病毒+DMSO组比较,aP<0.01;与空载腺病毒+DMSO组比较,bP<0.05
    2.2.4   ERK1/2抑制剂对P311高表达介导的促HMEC-1体外血管形成作用的影响

    于处理2 h,P311腺病毒+DMSO组细胞管状结构节点数明显多于空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组(P值均<0.01),管状结构总长度明显长于空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组(P值均<0.01)。空载腺病毒+DMSO组管状结构节点数明显多于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组(P<0.01),管状结构总长度明显长于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组(P<0.01)。P311腺病毒+ERK1/2 抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组细胞管状结构节点数和总长度均相近(P>0.05)。见图7表4

    7  4组人微血管内皮细胞1处理2 h血管形成情况 倒置相差显微镜×200,图中标尺为100 μm。7A.P311腺病毒+二甲基亚砜(DMSO)组管状结构节点数较多,管状结构总长度较长;7B.空载腺病毒+DMSO组管状结构节点数少于图7A,管状结构总长度短于图7A;7C.P311腺病毒+胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)抑制剂组管状结构节点数少于图7A,管状结构总长度短于图7A;7D.空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组管状结构节点数和总长度与图7C相近
    表4  4组人微血管内皮细胞1处理2 h血管形成情况(x¯±s
    组别样本数管状结构节点数(个)管状结构总长度(μm)
    P311腺病毒+DMSO组6726±7220 318±1 433
    空载腺病毒+DMSO组6421±3916 846±1 464
    P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组6365±4115 114±1 950
    空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组6317±6713 188±2 306
    F63.4916.53
    P<0.001<0.001
    P1<0.0010.004
    P2<0.001<0.001
    P30.0050.002
    P40.1620.083
    注:F值、P值为4组间各指标总体比较所得;DMSO为二甲基亚砜,ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2;P1值、P2值分别为P311腺病毒+DMSO组与空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组比较所得,P3、P4值分别为空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组与空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组比较所得
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    创面愈合过程被划分为4个连续而又有重叠的阶段,包括凝血期、炎症期、增殖期和重构期25。创面一旦形成,就开始了局部新的血液供应系统的建立,该进程贯穿整个创面修复过程2,但其机制仍不完全清楚。本课题组前期研究表明,皮肤微血管内皮细胞在静息状态下低表达P311,在炎症刺激条件下高表达P311,进而参与创面血管新生22。本研究进一步证实,P311能够通过激活VEGFR2/ERK1/2 信号通路,发挥促进HMEC-1血管形成的作用。

    P311基因是一种损伤环境诱导型基因,即在静息状态下低表达或者不表达,当受到外界环境刺激时表达升高,从而发挥相关生物学功能22, 23。该基因能够编码一种种属间高度保守的细胞内多功能蛋白10。在创面愈合过程中,P311持续高表达,可增强表皮干细胞Rho A和Rac1蛋白的活性21,并激活TGF-β1/Smad信号通路23,从而发挥促进创面修复作用。近年来研究表明,P311表达于创面皮肤微血管内皮细胞,P311基因敲除导致皮肤创面愈合过程中的血管新生减弱,进而导致创面愈合延迟;P311基因敲除皮肤微血管内皮细胞迁移及血管形成能力均减弱22。这些研究结果提示P311可能通过影响微血管内皮细胞的迁移和血管形成能力参与血管新生。微血管内皮细胞具有正常有效的增殖能力在血管形成中也至关重要26

    本研究用P311腺病毒转染HMEC-1,CCK-8法检测结果显示,P311腺病毒组和空载腺病毒组HMEC-1增殖能力没有明显差异;划痕试验结果显示,P311腺病毒组HMEC-1迁移能力较空载腺病毒组明显增强;体外血管形成实验结果显示,P311腺病毒组HMEC-1血管形成能力较空载腺病毒组明显增强。以上结果表明P311高表达能够显著提高HMEC-1的迁移能力和体外血管形成能力,而对HMEC-1增殖能力没有明显影响。

    VEGFR2信号通路在启动血管内皮细胞各项生物学过程中发挥重要作用27。VEGFR2活化是VEGFR2同二聚化或异二聚化导致酪氨酸激酶的活化和受体细胞内结构域中酪氨酸残基的自磷酸化28, 29。VEGFR2活化后启动血管内皮细胞内多种信号通路30。研究表明,在小鼠中VEGFR2 Tyr1173磷酸化(人类中Tyr1175磷酸化)对ERK1/2 激活至关重要31。ERK1/2信号通路与细胞的成活32、迁移33、血管形成34等生物学过程密切相关35。然而,此前尚鲜见有关P311对VEGFR2活化和ERK1/2活化的影响的研究。本研究采用蛋白质印迹法检测P311腺病毒组和空载腺病毒组HMEC-1中VEGFR2、磷酸化VEGFR2、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达水平,结果显示,P311高表达对HMEC-1 VEGFR2、ERK1/2的蛋白表达没有明显影响,但是却能够促进VEGFR2、ERK1/2的磷酸化。根据上述结果可以得出,P311高表达可以激活VEGFR2/ERK1/2信号通路,该机制可能参与了P311促HMEC-1体外血管形成的作用。

    为进一步探讨P311介导的促体外血管形成作用是否通过激活VEGFR2/ERK1/2信号通路而发挥作用,本研究分别采用siRNA-VEGFR2和ERK抑制剂SCH772984阻断VEGFR2/ERK1/2信号通路的活化,随后采用蛋白质印迹法检测细胞VEGFR2磷酸化和ERK1/2磷酸化水平的变化,采用体外血管形成实验检测细胞血管形成能力的变化。结果显示,P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞磷酸化VEGFR2和磷酸化ERK1/2蛋白表达水平均明显高于空载腺病毒+阴性对照siRNA组,提示P311高表达能够促进VEGFR2/ERK1/2信号通路活化。在阻断VEGFR2途径后,VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平均明显降低,HMEC-1体外血管形成能力明显减弱,提示siRNA-VEGFR2能够抑制P311高表达引起的VEGFR2/ERK1/2信号通路活化,进而抑制P311高表达介导的促HMEC-1体外血管形成作用。另外,在抑制ERK1/2信号通路后,ERK1/2磷酸化水平均明显降低,HMEC-1体外血管形成能力明显减弱,提示ERK1/2抑制剂能够抑制P311高表达引起的ERK1/2信号通路活化,进而抑制P311高表达介导的促HMEC-1体外血管形成作用。由此推测,P311通过激活VEGFR2/ERK1/2信号通路发挥促进HMEC-1血管形成的作用。

    综上所述,P311在创面血管新生中发挥重要作用,能够通过激活VEGFR2/ERK1/2信号通路发挥促进HMEC-1血管形成的作用。本研究结果丰富了创面愈合理论,为促进皮肤创面修复提供了新思路、新线索与新靶点。

    ·《Burns & Trauma》好文推荐·

    严重烫伤后肠道菌群移位的分子机制:囊性纤维化穿膜传导调节蛋白的作用

    王淞:实施研究、起草文章;李海胜:实施研究和分析数据;钱卫、张小容:采集数据和统计分析;贺伟峰:酝酿和设计实验;罗高兴:获取研究经费和对文章的知识性内容作批评性审阅
    所有作者均声明不存在利益冲突
    严重烫伤后肠道缺血缺氧会引起肠上皮屏障受损,发生肠道细菌移位(EBT),从而导致严重的并发症,如SIRS、脓毒症和MOF的发生。囊性纤维化穿膜传导调节蛋白(CFTR)可因肠上皮细胞缺氧而表达下调,进而影响紧密连接蛋白的正常结构与功能,而紧密连接蛋白正是维持肠道屏障的关键结构。陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院全军烧伤研究所陈婧老师团队联合上海交通大学第九人民医院整复外科章一新教授团队近期在《Burns & Trauma》发文《Molecular mechanism mediating enteric bacterial translocation after severe burn: the role of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator》,使用人Caco-2细胞系建立体外缺氧损伤模型,并建立C57小鼠严重烫伤模型,研究严重烫伤对小鼠肠黏膜屏障、CFTR和紧密连接蛋白表达的影响,同时选取DF 508小鼠(F508del CFTR基因突变小鼠)为体内模型,进一步证明CFTR在维持小鼠正常肠道屏障功能中的作用。研究结果显示,在缺氧条件下,人Caco-2细胞中CFTR的表达显著降低;胞外信号调节激酶(ERK)和核因子κB信号被激活;炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-8)分泌增加;带状闭合蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白和E-钙黏合素的表达下调;跨上皮电阻值降低;并导致ZO-1在细胞膜上分布不连续,排列不规则。同样地,敲除CFTR导致了相似的改变,且敲除CFTR引起的炎症因子的上调和紧密连接蛋白(ZO-1和闭合蛋白)的下调,可以通过抑制特定的ERK或核因子κB而逆转。与此同时,在严重烫伤小鼠的肠道中观察到大量的促炎症介质分泌和EBT,进一步支持了体外实验结果。与野生型小鼠相比,DF 508小鼠回肠中的TNF-α、IL-1β和IL-8浓度升高。此外,维生素D3被证明可以保护肠道上皮屏障免受缺氧损伤,机制可能与其上调CFTR表达,从而抑制ERK通路激活,减少促炎性细胞因子释放有关。此项研究结果表明,严重烫伤后,肠上皮细胞通过CFTR/ERK/促炎性细胞因子途径调节细胞间紧密连接蛋白的表达,进而调节肠道菌群移位,维生素D3可对严重烫伤后的肠黏膜屏障起到保护作用。
    杨云稀,编译自《Burns & Trauma》,2021,8:tkaa042;孙炳伟,审校
  • 参考文献(35)

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  • 1  2组人微血管内皮细胞1划痕后各时间点剩余划痕面积 倒置相差显微镜×200,图中标尺为100 μm。1A、1B、1C.分别为P311腺病毒组划痕后0(即刻)、6、11 h,随着划痕后时间的延长,剩余划痕面积逐渐减少,至划痕后11 h划痕基本愈合;1D、1E、1F.分别为空载腺病毒组划痕后0、6、11 h,图1E、1F剩余划痕面积分别较图1B、1C明显增大

    2  2组人微血管内皮细胞1培养8 h血管形成情况 倒置相差显微镜×200,图中标尺为100 μm。2A. P311腺病毒组管状结构节点数较多,管状结构总长度较长;2B.空载腺病毒组管状结构节点数少于图2A,管状结构总长度短于图2A

    3  蛋白质印迹法检测2组人微血管内皮细胞1转染48 h VEGFR2/ERK1/2信号通路相关蛋白的表达量。3A.条带图;3B.条图(样本数为6,x¯±s

    注:VEGFR2为血管内皮生长因子受体2,ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条带图上方1、2分别为P311腺病毒组和空载腺病毒组;与空载腺病毒组比较,aP<0.01

    4  蛋白质印迹法检测4组人微血管内皮细胞1转染24 h VEGFR2/ERK1/2信号通路相关蛋白的表达量。4A.条带图;4B.条图(样本数为6,x¯±s

    注:VEGFR2为血管内皮生长因子受体2,ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条带图上方1、2、3、4分别为P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA(siRNA)组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA- VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组;与P311腺病毒+阴性对照siRNA组比较,aP<0.01;与空载腺病毒+阴性对照siRNA组比较,bP<0.01,cP<0.05

    5  4组人微血管内皮细胞1转染24 h血管形成情况 倒置相差显微镜×200,图中标尺为100 μm。5A.P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA(siRNA)组管状结构节点数较多,管状结构总长度较长;5B.空载腺病毒+阴性对照siRNA组管状结构节点数明显少于图5A,管状结构总长度明显短于图5A;5C.P311腺病毒+siRNA-血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)组管状结构节点数明显少于图5A,管状结构总长度明显短于图5A;5D.空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组管状结构节点数明显少于图5B,管状结构总长度明显短于图5B,且均与图5C相近

    6  蛋白质印迹法检测4组人微血管内皮细胞1处理2 h ERK1/2信号通路相关蛋白的表达量。6A.条带图;6B.条图(样本数为6,x¯±s

    注:F值、P值为4组间各指标总体比较所得;ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2,GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶;条带图上方1、2、3、4分别为P311腺病毒+二甲基亚砜(DMSO)组、空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组;与P311腺病毒+DMSO组比较,aP<0.01;与空载腺病毒+DMSO组比较,bP<0.05

    7  4组人微血管内皮细胞1处理2 h血管形成情况 倒置相差显微镜×200,图中标尺为100 μm。7A.P311腺病毒+二甲基亚砜(DMSO)组管状结构节点数较多,管状结构总长度较长;7B.空载腺病毒+DMSO组管状结构节点数少于图7A,管状结构总长度短于图7A;7C.P311腺病毒+胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)抑制剂组管状结构节点数少于图7A,管状结构总长度短于图7A;7D.空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组管状结构节点数和总长度与图7C相近

    表1  2组人微血管内皮细胞1培养各时间点增殖活性比较(x¯±s

    组别样本数1 d3 d5 d
    P311腺病毒组60.188±0.0300.415±0.0320.713±0.030
    空载腺病毒组60.185±0.0190.392±0.0300.687±0.031
    t-0.23-1.30-1.52
    P0.8220.2220.160
    注:处理因素主效应,F=5.10,P=0.074;时间因素主效应,F=720.12,P<0.001;两者交互作用,F=0.81,P=0.473
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    表2  2组人微血管内皮细胞1划痕后各时间点剩余划痕面积百分比比较(%,x¯±s

    组别样本数6 h11 h
    P311腺病毒组647±79±5
    空载腺病毒组655±520±10
    t-2.47-2.62
    P0.0330.025
    注:初始剩余划痕面积百分比均为100%;处理因素主效应,F=18.42,P=0.008;时间因素主效应,F=443.86,P<0.001;两者交互作用,F=7.89,P=0.041
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    表3  4组人微血管内皮细胞1转染24 h后血管形成情况(x¯±s

    组别样本数管状结构节点数(个)管状结构总长度(μm)
    P311腺病毒+阴性对照siRNA组6720±6221 241±1 139
    空载腺病毒+阴性对照siRNA组6428±3817 005±1 156
    P311腺病毒+siRNA- VEGFR2组6364±5713 494±2 465
    空载腺病毒+siRNA- VEGFR2组6310±7511 600±2 776
    F57.0726.32
    P<0.001<0.001
    P1<0.0010.002
    P2<0.001<0.001
    P30.002<0.001
    P40.1270.121
    注:F值、P值为4组间各指标总体比较所得;P1值、P2值分别为P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA(siRNA)组与空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)组比较所得,P3值、P4值分别为空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组与空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组比较所得
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    表4  4组人微血管内皮细胞1处理2 h血管形成情况(x¯±s

    组别样本数管状结构节点数(个)管状结构总长度(μm)
    P311腺病毒+DMSO组6726±7220 318±1 433
    空载腺病毒+DMSO组6421±3916 846±1 464
    P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组6365±4115 114±1 950
    空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组6317±6713 188±2 306
    F63.4916.53
    P<0.001<0.001
    P1<0.0010.004
    P2<0.001<0.001
    P30.0050.002
    P40.1620.083
    注:F值、P值为4组间各指标总体比较所得;DMSO为二甲基亚砜,ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2;P1值、P2值分别为P311腺病毒+DMSO组与空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组比较所得,P3、P4值分别为空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组与空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组比较所得
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  • 收稿日期:  2021-12-10

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