Effects and molecular mechanism of exogenous L-carnitine on excessive endoplasmic reticulum stress-mediated hepatic pyroptosis in severely scald rats
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摘要:
目的 探讨外源性左旋肉碱对过度内质网应激介导的严重烫伤大鼠肝细胞焦亡的影响及其分子机制。 方法 采用实验研究方法。将15只6~8周龄雌性SD大鼠按随机数字表法（分组方法下同）分为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+肉碱组，每组5只，单纯烫伤组和烫伤+肉碱组大鼠背部制作30%体表总面积的Ⅲ度烫伤，其中烫伤+肉碱组大鼠另外给予腹腔注射左旋肉碱。伤后72 h，采用全自动生化仪检测肝损伤生物化学指标天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平，样本数为5。伤后72 h，采用苏木精-伊红染色观察肝组织损伤情况。伤后72 h，采用实时荧光定量反转录PCR（RT-qPCR）法检测肝组织中细胞焦亡相关标志物核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、胱天蛋白酶1（caspase-1）、消皮素D和白细胞介素1β（IL-1β）以及内质网应激相关标志物葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的mRNA水平；采用蛋白质印迹法检测肝组织中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平，样本数均为5。取人肝癌细胞HepG2，分为二甲基亚砜（DMSO）组、0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组，分别作相应处理。培养24 h后，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞活力并筛选衣霉素干预浓度（样本数为5）。取HepG2人肝癌细胞，分为DMSO组、单纯衣霉素组和衣霉素+肉碱组，分别作相应处理。培养24 h后，采用蛋白质印迹法检测细胞中GRP78、CHOP、NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平，样本数均为3。对数据行单因素方差分析和LSD-t检验。 结果 伤后72 h，单纯烫伤组大鼠血清中AST和ALT水平分别为（640±22）、（157±8）U/L，均分别明显高于假伤组的（106±13）、（42±6）U/L（t值分别为-46.78、-25.98，P<0.01）；烫伤+肉碱组大鼠血清中AST和ALT水平分别为（519±50）、（121±10）U/L，均明显低于单纯烫伤组（t值分别为4.93、6.06，P<0.01）。伤后72 h，假伤组大鼠肝组织形态基本正常，未见明显的炎症细胞浸润；与假伤组相比，单纯烫伤组大鼠肝组织可见大量的炎症细胞浸润，细胞排列紊乱；与单纯烫伤组相比，烫伤+肉碱组大鼠肝组织可见少量的炎症细胞浸润。伤后72 h，单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1β mRNA表达水平均明显高于假伤组（t值分别为34.42、41.93、30.17、15.68，P<0.01）；烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、消皮素D和IL-1β mRNA表达水平均明显低于单纯烫伤组（t值分别为34.40、37.20、19.95、7.88，P<0.01）。伤后72 h，与假伤组相比，单纯烫伤组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显升高（t值分别为12.28、26.92、5.20、10.02、24.78，P<0.01）；与单纯烫伤组相比，烫伤+肉碱组大鼠肝组织中NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白表达水平均明显下降（t值分别为10.99、27.96、12.69、8.96、12.27，P<0.01）。伤后72 h，单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显高于假伤组（t值分别为21.00、16.52，P<0.01），烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的mRNA水平均明显低于单纯烫伤组（t值分别为8.92、8.21，P<0.01）；单纯烫伤组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显高于假伤组（t值分别为22.50、14.29，P<0.01），烫伤+肉碱组大鼠肝组织中GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显低于单纯烫伤组（t值分别为14.29、5.33，P<0.01）。培养24 h后，与DMSO组相比，0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组细胞存活率均明显下降（t值分别为4.90、9.35、18.64、25.09，P<0.01）；选择0.8 μmol/L作为后续衣霉素的干预浓度。培养24 h后，与DMSO组相比，单纯衣霉素组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显升高（t值分别为10.48、17.67，P<0.01）；与单纯衣霉素组相比，衣霉素+肉碱组细胞GRP78、CHOP的蛋白表达水平均明显下降（t值分别为8.08、13.23，P<0.05或P<0.01）。培养24 h后，与DMSO组相比，单纯衣霉素组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显升高（t值分别为13.44、27.51，P<0.01），caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化（P>0.05）；与单纯衣霉素组相比，衣霉素+肉碱组细胞NLRP3、消皮素D-N蛋白表达水平均明显下降（t值分别为20.49、21.95，P<0.01），caspase-1、caspase-1/p20、剪切型IL-1β蛋白表达水平均无明显变化（P>0.05）。 结论 在严重烫伤大鼠中，外源性左旋肉碱可能通过抑制过度内质网应激介导的细胞焦亡相关通路发挥对肝损伤的保护作用。 Abstract:Objective To investigate the effects and molecular mechanism of exogenous L-carnitine on hepatic pyroptosis mediated by excessive endoplasmic reticulum stress in severely scald rats. Methods The experimental research method was adopted. According to the random number table (the same group method below), fifteen female Sprague Dawley rats aged 6-8 weeks were divided into sham-injury group, scald alone group, and scald+carnitine group (with 5 rats in each group), and full-thickness scald of 30% total body surface area were made on the back of rats in scald alone group and scald+carnitine group, and rats in scald+carnitine group were additionally given intraperitoneal injection of L-carnitine. At post injury hour (PIH) 72, The levels of aspartate aminotransferase (AST) and alanine dehydrogenase (ALT) of biochemical indicators of liver injury were detected by automatic biochemical analyzer with the sample number of 5. At PIH 72, liver tissue damage was detected by hematoxylin-eosin staining. At PIH 72, The mRNA levels of nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein-like receptor family pyrin domain containing 3 (NLRP3), cysteine aspartic acid specific protease 1 (caspase-1), gasderminD (GSDMD), and interleukin 1β(IL-1β) in liver tissue as pyroptosis-related markers and glucose regulatory protein 78 (GRP78) and CCAAT/enhancer binding protein homologous protein (CHOP) in liver tissue as endoplasmic reticulum stress-related markers were detected by real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR). Protein expression levels of GRP78, CHOP, NLRP3, caspase-1, caspase-1/p20, GSDMD-N, and cleaved IL-1β in liver tissue were detected by Western blotting, and the sample numbers were all 5. HepG2 cells as human liver cancer cells were divided into dimethyl sulfoxide (DMSO) group, 0.1 μmol/L tunicamycin (TM) group, 0.2 μmol/L TM group, 0.4 μmol/L TM group, and 0.8 μmol/L TM group and were treated accordingly. After 24 h of culture, cell viability was detected by cell counting kit 8, and the intervention concentration of TM was screened, and the sample number was 5. HepG2 cells were divided into DMSO group, TM alone group, and TM+carnitine group, and treated accordingly. After 24 h of culture, the protein expression levels of GRP78, CHOP, NLRP3, caspase-1, caspase-1/p20, GSDMD-N, and cleaved IL-1β in cells were detected by Western blotting, and the sample numbers were all 3. Data were statistically analyzed with one-way analysis of variance and least significant difference-t test. Results At PIH 72, the AST and ALT levels of serum in scald alone group were (640±22) and (157±8) U/L, which were significantly higher than (106±13) and (42±6) U/L in sham-injury group, respectively, with t values of -46.78 and -25.98, respectively, P<0.01. The AST and ALT levels of serum in scald+carnitine group were (519±50) and (121±10) U/L, which were significantly lower than those in scald alone group, respectively, with t values of 4.93 and 6.06, respectively, P<0.01. At PIH 72, the morphology of liver tissue of rats in sham-injury group were basically normal with no obvious inflammatory cell infiltration; compared with those in sham-injury group, the liver tissue of rats in scald alone group showed a large number of inflammatory cell infiltration and disturbed cell arrangement; compared with that in scald alone group, the liver tissue of rats in scald+carnitine group showed a small amount of inflammatory cell infiltration. At PIH 72, the mRNA expression on levels of NLRP3, caspase-1, GSDMD, and IL-1β in liver tissue of rats in scald alone group were significantly higher than those in sham-injury group (with t values of 34.42, 41.93, 30.17, and 15.68, respectively, P<0.01); the mRNA levels of NLRP3, caspase-1, GSDMD, and IL-1β in liver tissue of rats in scald+carnitine group were significantly lower than those in scald alone group (with t values of 34.40, 37.20, 19.95, and 7.88, respectively, P<0.01). At PIH 72, the protein expression levels of NLRP3, caspase-1, caspase-1/p20, GSDMD-N, and cleaved IL-1β in liver tissue of rats in scald alone group were significantly higher than those in sham-injury group (with t values of 12.28, 26.92, 5.20, 10.02, and 24.78, respectively, P<0.01); compared with those in scald alone group, the protein expression levels of NLRP3, caspase-1, caspase-1/p20, GSDMD-N, and cleaved IL-1β in liver tissue of rats in scald+carnitine group were significantly decreased (with t values of 10.99, 27.96, 12.69, 8.96, and 12.27, respectively, P<0.01). At PIH 72, the mRNA levels of GRP78 and CHOP in liver tissue of rats in scald alone group were significantly higher than those in sham-injury group (with t values of 21.00 and 16.52, respectively, P<0.01), and the mRNA levels of GRP78 and CHOP in liver tissue of rats in scald+carnitine group were significantly lower than those in scald alone group (with t values of 8.92 and 8.21, respectively, P<0.01); the protein expression levels of GRP78 and CHOP in liver tissue of rats in scald alone group were significantly higher than those in sham-injury group (with t values of 22.50 and 14.29, respectively, P<0.01), and the protein expression levels of GRP78 and CHOP in liver tissue of rats in scald+carnitine group were significantly lower than those in scald alone group (with t values of 14.29 and 5.33 respectively, P<0.01). After 24 h of culture, the cell survival rates of 0.1 μmol/L TM group, 0.2 μmol/L TM group, 0.4 μmol/L TM group, and 0.8 μmol/L TM group were significantly decreased than that in DMSO group (with t values of 4.90, 9.35, 18.64, and 25.09, respectively, P<0.01). Then 0.8 μmol/L was selected as the intervention concentration of TM. After 24 h of culture, compared with that in DMSO group, the protein expression levels of GRP78 and CHOP in cells in TM alone group were significantly increased (with t values of 10.48 and 17.67, respectively, P<0.01), and the protein expression levels of GRP78 and CHOP in TM+carnitine group were significantly lower than those in TM alone group (with t values of 8.08 and 13.23, respectively, P<0.05 or P<0.01). After 24 h of culture, compared with those in DMSO group, the protein expression levels of NLRP3 and GSDMD-N in cells in TM alone group were significantly increased (with t values of 13.44 and 27.51, respectively, P<0.01), but the protein expression levels of caspase-1, caspase-1/p20, and cleaved IL-1β in cells were not significantly changed (P>0.05); compared with that in TM alone group, the protein expression levels of NLRP3 and GSDMD-N in cells in TM+carnitine group were significantly decreased (with t values of 20.49 and 21.95, respectively, P<0.01), but the protein expression levels of caspase-1, caspase-1/p20, and cleaved IL-1β in cells were not significantly changed (P>0.05). Conclusions In severely scald rats, exogenous L-carnitine may play a protective role against liver injury by inhibiting the pathways related to excessive endoplasmic reticulum stress-mediated pyroptosis. -
Key words:
- Burns /
- Pyroptosis /
- Endoplasmic reticulum stress /
- Liver /
- L-carnitine
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如何准确高效地预测烧伤患者的预后一直是烧伤学科密切关注的问题，早在20世纪60年代，就有学者建立了Baux评分以预测烧伤患者病死率，随后又出现了许多国际上较广泛认可的预测模型，如Ryan评分、简明烧伤严重程度指数（ABSI）等，为烧伤患者预后评估提供了更多选择。21世纪以来，烧伤预后相关预测模型更是得到了学术界的密切关注，许多学者在原有模型基础上进行改良完善，提出了更多相对简便、更为精准的预测模型。近几十年来，随着重症监护技术及临床救治手段的不断完善，烧伤患者的救治成功率也在不断提升，但降低烧伤患者病死率仍是临床工作中的一项重要任务，烧伤预后相关预测模型能够对患者的预后进行早期评估，对为烧伤患者制订更为科学的救治方案有积极帮助。因此，熟悉预测模型的优点不足及其适用性，对于临床救治工作而言具有重要意义。本文主要讨论烧伤患者预后相关预测模型的发展，并对其中一些预测模型及相关危险因素加以论述，旨在为临床工作中对烧伤患者的预后评估提供思路。
1. 烧伤患者预后相关预测模型的简要发展史
烧伤预后相关预测模型是指应用烧伤患者基本信息、体征、血清学指标等建立的用于预测患者病死率、评估预后的指数或评分公式。早在1961年就有学者根据烧伤患者年龄和烧伤程度之和来预测病死率，也就是在20世纪广泛应用的Baux评分 ［ 1］ ；1982年Tobiasen等 ［ 2］ 考虑到年龄及烧伤面积以外的影响因素，提出了ABSI；1998年，Ryan等 ［ 3］ 通过引入3种危险因素，创立了Ryan评分。
进入21世纪后，各种预测模型更是层出不穷，并不断得以改良。2005年，Moreau等 ［ 4］ 通过引入年龄、烧伤总面积、出院后生存时间，并将年龄标准化，建立了针对烧伤患者的年龄风险评分。2008年，Gomez等 ［ 5］ 提出了包含年龄、急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ（APACHEⅡ）、烧伤面积及性别在内的火焰评分，该评分在APACHEⅡ基础上进一步改良，尤其适用于危重症烧伤患者。2009年，比利时烧伤研究组根据烧伤患者的年龄、烧伤面积和是否合并吸入性损伤制订了比利时烧伤预后（BOBI）评分 ［ 6］ 。2010年Osler等 ［ 7］ 提出了改良Baux评分，现BOBI、改良Baux评分均在欧美国家得到了较广泛认可。
继改良Baux评分后，更多学者投入到烧伤患者预后相关预测模型的研究中。2012年Davis等 ［ 8］ 通过引入年龄、烧伤总面积、改良创伤评分制订了适用于预测老年烧伤患者死亡风险的预测模型。2013年，澳大利亚学者开发了烧伤评估和病死率研究模型用于预测烧伤ICU（BICU）患者的死亡情况，并把女性作为十分重要的危险因素 ［ 9］ 。2014年，因原损伤严重程度评分对烧伤患者的预测效能较低，有学者将年龄及烧伤总面积添加至评分中，得到了准确性更高的烧伤特异性损伤严重程度评分 ［ 10］ 。同样在2014年，英国学者综合年龄、烧伤面积、吸入性损伤、致伤因素及并发症等危险因素建立了适用于英国烧伤患者的死亡预测模型 ［ 11］ 。Taylor等 ［ 12］ 也根据美国烧伤协会国家烧伤资源库2000—2009年的患者数据，将年龄进行分层计算，并引入吸入性损伤和烧伤面积，从而建立了适用于各个年龄段烧伤患者的死亡风险预测模型。2016年，我国学者综合烧伤患者入院特征（性别、年龄、烧伤总面积、Ⅲ度烧伤面积、是否合并吸入性损伤、休克情况等）开发了预测烧伤病死率的数学模型 ［ 13］ 。2019年，韩国学者综合考虑年龄、烧伤面积、吸入性损伤、血清乳酸、pH值、凝血酶原时间等10个变量，建立了用于反映烧伤死亡风险和疾病严重程度的汉江模型 ［ 14］ 。2020年，我国学者在改良SIRS评分的基础上建立了用于评估大面积烧伤患者死亡风险的联合预测模型，其指标包括年龄、改良SIRS评分和Ⅲ度烧伤面积，但并未在临床上得到应用 ［ 15］ 。同样在2020年，我国学者在BOBI、Ryan、改良Baux评分及ABSI的基础上提出了用于预测烧伤患者病死率的新模型 ［ 16］ ，但该模型也尚未在临床上得到应用。2020年5月，Bartels等 ［ 17］ 将ABSI中性别因素剔除，并制订新的年龄量表，得到改良ABSI。2020年9月我国学者引入呼吸机使用情况、连续性肾脏替代治疗、烧伤指数这3个指标，建立了特重度烧伤患者死亡风险列线图预测模型 ［ 18］ ，但该模型未被应用于临床。2021年，日本学者同样对ABSI进行了修改，提出了用于预测烧伤合并吸入性损伤患者院内病死率的改良ABSI ［ 19］ 。2023年，德国学者在评估了7 276例烧伤患者后提出了烧伤病死率预测评分，评估指标除年龄、烧伤面积外还包括烧伤并发症（2种以上）、致伤原因（工伤、交通事故、自杀等）等 ［ 20］ ，但其适用性在我国尚未得到证实。
2. 国内外一些烧伤患者预后相关预测模型的进展
可用于烧伤患者预后评估的预测模型数量不少，但只有少数得到较广泛认可。20世纪比较被认可的烧伤患者预后相关预测模型主要为Baux评分和ABSI，目前比较实用、新颖的预测模型包括火焰、Ryan、改良Baux评分及BOBI评分、APACHEⅡ等，我国学者自21世纪以来也提出了数个预测模型，但均未被进一步推广使用。下面本文将对国内外一些可能较有应用前景的预测模型作进一步汇总分析。
2.1 ABSI及改良ABSI
相对于Baux评分，ABSI准确性更高，预测指标主要包括年龄（1~5分）、性别（女性记1分、男性记0分）、烧伤总面积（1~10分）、Ⅲ度烧伤（有记1分、无记0分）、合并吸入性损伤（1分）等 ［ 21］ 。ABSI总得分≤7分，烧伤患者的生存率可达90%以上；总得分为8、9分，生存率在50%~70%；总得分为10、11分，生存率则只有20%~40%；总得分≥12分，生存率低至10%以下，救治希望渺茫 ［ 22］ 。此预测模型在国际上得到了许多学者的认可，在临床上使用较广泛，在预测烧伤患者病死率方面有比较不错的准确性。在本研究团队看来，虽然ABSI充分考虑到了性别、Ⅲ度烧伤及吸入性损伤对预后的影响，但吸入性损伤及Ⅲ度烧伤所占比重过小，且未对年龄进行分层考虑，相较于目前较为广泛认可的预测模型而言，准确性较低。Bartels等 ［ 17］ 在分析了2015—2018年德国烧伤登记在册的14 984例患者的数据后重新评估了ABSI中的变量，将性别因素去除，并对年龄因素进行重新评估；日本学者同样对ABSI进行修改，在原基础上引入是否行机械通气这一预测因子，得到改良ABSI，该模型对烧伤合并吸入性损伤患者院内病死率预测准确性较高 ［ 19］ 。以上2个学者团队虽然均改良了ABSI，但2种改良ABSI的可靠性均尚未得到国际认可。
2.2 Ryan评分
Ryan等 ［ 3］ 对1 665例急性烧伤患者进行了回顾性分析，并使用logistic回归分析得出Ryan评分，其主要包括3个危险因素，即患者年龄≥60岁、烧伤总面积≥40%TBSA及合并吸入性损伤。根据危险因素个数，患者病死率可分为4个等级，当无危险因素时，病死率仅为0.3%；存在1个危险因素时，病死率为3%；存在2个危险因素时，病死率为33%；同时拥有3个危险因素时，病死率则达到90% ［ 1］ 。Ryan评分虽比较简便，但是准确性并不算高，对各个年龄段和烧伤面积的针对性较差，在评估老年患者时也只是将≥60岁作为风险因素 ［ 23］ 。另Ryan评分还忽略了小儿患者、Ⅲ度烧伤面积等因素。目前，Ryan评分未在我国得到应用。
2.3 APACHEⅡ与火焰评分
APACHE最初在20世纪80年代初由Knaus等 ［ 24］ 开发。随着APACHE的发展，1985年更新为APACHEⅡ，由最初的34个变量减少至12个，1991年又更新为APACHEⅢ ［ 1］ 。对于烧伤患者而言，APACHEⅡ更具价值。APACHEⅡ常被用于评估重症患者，其评分指标范围较广，包括年龄、慢性健康评分、格拉斯哥昏迷评分、生命体征及血清学指标（动脉血pH值、钠钾离子浓度、血肌酐、血细胞比容及白细胞计数）；资料提示，APACHEⅡ>8分时烧伤患者的死亡风险为轻度危险；>15分时为中度危险；>20分时则为重度危险，且患者病死率极高，可达到80%~100%，APACHEⅡ得分越高，提示烧伤患者的预后越差 ［ 25］ 。APACHEⅡ虽不是专用于烧伤患者，但其与脓毒症相关性器官功能衰竭评价类似，可以准确评估全身器官损伤的严重程度，帮助预测烧伤患者最终病死率 ［ 26］ 。针对烧伤患者，后期又有学者提出了火焰评分，火焰评分=-8.285+0.045×年龄（岁）+0.157×APACHEⅡ得分+0.062×Ⅱ度烧伤面积（%TBSA）+0.104×Ⅲ度烧伤面积（%TBSA）-1.214（男性患者），最终病死率=e^（火焰评分）÷｛1+e^（火焰评分）｝。此评分在原APACHEⅡ基础上进行了改良，对烧伤患者病死率的预测准确性更高，尤其适用于危重症烧伤患者，在BICU的烧伤患者病死率统计上，其准确性甚至高于改良Baux、BOBI评分等 ［ 27］ 。火焰评分的预测指标虽然综合考虑了年龄、性别、烧伤面积等方面，但未将吸入性损伤考虑在内；且APACHEⅡ与火焰评分计算过程均过于烦琐，临床上实施起来比较困难。
2.4 BOBI评分
2009年，比利时烧伤研究小组分析了1999—2003年5 246例烧伤患者的数据，开发了BOBI评分，其中年龄层面：<50岁得0分，50~64岁得1分，65~79岁得2分，>80岁得3分；烧伤面积层面：<20%TBSA得0分，20%~39%TBSA得1分，40%~59%TBSA得2分，60%~79%TBSA得3分，>80%TBSA得4分；吸入性损伤层面：合并吸入性损伤得3分，无吸入性损伤则得0分；BOBI评分0~10分对应的患者病死率分别为0.1%、1.5%、5%、10%、20%、30%、50%、75%、85%、95%、99% ［ 6］ 。BOBI评分因准确性较高、计算相对简便，在欧洲一些发达国家中广泛应用，尤其适用于老年患者。但其不足也比较明显，相对其他预测模型而言过于机械、灵活性较差，在年龄层面还忽略了小儿群体；在吸入性损伤方面，也只是简单地根据有和无来分类，并没有作进一步划分；在计算烧伤面积时，也未将面积根据不同烧伤深度分开计算，而是将Ⅱ、Ⅲ度烧伤面积混合计算。因而，相对其他预测模型而言，BOBI评分的准确率并不算高。
2.5 改良Baux评分
因原Baux评分不包含吸入性损伤的影响，Osler等 ［ 7］ 添加了是否合并吸入性损伤这个危险因素，并使用logistic回归模型对39 888例烧伤患者进行校准，最终得到的公式如下：改良Baux分数=年龄（岁）+烧伤总面积（%TBSA）+（17×I）；其中患者若合并吸入性损伤，则I=1、否则I=0。改良Baux得分越高表示烧伤患者死亡风险越高，改良Baux分数>130分时常提示预后不良，死亡风险高。这种方法不仅计算简便，而且预测准确性高，在美国等发达国家得到了广泛应用 ［ 28］ 。但作为公认的预测模型，改良Baux评分并不算完美，其对小儿烧伤患者的适用性较差，Lam和Minh ［ 29］ 表示，改良Baux评分仅在合并吸入性损伤的老年烧伤患者病死率预测中可靠性较高，在成年烧伤群体中准确性亦可接受，但在儿童烧伤群体中价值较低，有必要进一步建立针对烧伤患儿的预测模型。有学者认为，因儿童和老人体质上的特殊性，改良Baux评分预测结果“一刀切”的模式并不能准确反映老年和儿童烧伤患者的结局，因此主张将儿童、青年、老人分开评估 ［ 12］ 。2013年伊朗学者通过分析870例烧伤患儿后开发了适用于儿童患者的儿科-Baux评分，其认为烧伤患儿年龄<15岁时，年龄越大，病死率越低 ［ 30］ 。此外，改良Baux评分在烧伤面积的计算中并没有充分考虑Ⅲ度烧伤面积的比重。因此，改良Baux评分可能需在年龄、烧伤面积及吸入性损伤层面作进一步改进，以获得更加准确的评估效果。
2.6 联合预测模型
联合预测模型由海军军医大学第一附属医院全军烧伤研究所提出，其具体预测公式如下：Ln［P÷（1-P）］=-7.322+0.912×改良SIRS评分+0.035×Ⅲ度烧伤面积（%TBSA）+0.062×年龄（岁），其Ln是以常数e为底数的对数，P代表病死率 ［ 15］ ，P值越高代表预后越差。该模型充分考量了年龄、改良SIRS评分和Ⅲ度烧伤面积等危险因素，其中SIRS评分包含了吸入性损伤及气管切开等重要危险因素，并将吸入性损伤分级，不足是未能将年龄进行分层计算。其准确性与改良Baux评分相当，但从临床适用性上来说，该模型比改良Baux评分更适用于危重症患者。目前，联合预测模型缺乏在临床广泛应用的多中心数据。
2.7 关于Logit（P）指数的新模型
有关Logit（P）指数的新模型由我国学者回顾性分析5 006例烧伤患者后提出（并用4 619例烧伤患者进行了外部验证）。具体公式如下：Logit（P）=In［P÷（1-P）］=-7.91+0.7×性别（男性=1、女性=0）+吸入性损伤（轻度=0.6、中度/重度=1.2）+年龄（0~5岁/40~59岁=0.8、60~79岁=2.4、≥80岁=4.0）+0.48×烧伤总面积（每10%体表总面积）+0.24×Ⅲ度烧伤面积（每10%体表总面积） ［ 16］ ，其中P代表患者病死率，P值越高提示预后越差。该预测模式综合考虑了年龄、性别、吸入性损伤、Ⅲ度烧伤面积等因素，并对年龄和吸入性损伤进行了分层考量，把不同年龄段及不同程度的吸入性损伤对烧伤预后的影响均考虑在内，且计算也较简便。但遗憾的是该预测模式尚未在临床广泛推广，其准确性及临床适用性有待进一步论证。
3. 相关危险因素分析
虽然每种预测模型的侧重点均不同，但从近十几年我国烧伤患者的救治过程中可以得出，我国大部分烧伤死亡患者具有“高龄、烧伤面积>50%TBSA、Ⅲ度烧伤面积占比大、合并吸入性损伤”等特征 ［ 31, 32, 33, 34］ 。因此，高效准确的预测模型不仅要计算简便，还要能综合考虑年龄、性别、烧伤总面积、Ⅲ度烧伤面积、吸入性损伤和内脏并发症等危险因素。
烧伤患者涵盖了中青年、老人、儿童在内的所有人群，因此，对于烧伤预后的评估不能一概而论，尤其是遭遇大面积烧伤时，这3种群体的耐受程度大相径庭。女性因耐受力较弱，在发生特重烧伤后病死率要高于男性 ［ 35］ 。儿童各项器官功能尚未成熟，老年患者各项器官功能已经开始衰弱，对烧伤打击的耐受力均不及健康中青年。除了年龄因素外，烧伤面积也是影响预后的关键因素，尤其是Ⅲ度烧伤面积，更是造成烧伤患者死亡的主要危险因素。来自阿尔巴尼亚的一份统计和分析数据显示，烧伤深度和烧伤原因等危险因素决定了特重烧伤患者最终的结局，贯穿皮肤全层的烧伤和合并吸入性损伤均可使患者的致死风险增加4倍 ［ 36］ 。因此，Ⅲ度烧伤面积在评估预后中应占据更为重要的地位。
造成烧伤患者死亡风险升高的重要危险因素还包括吸入性损伤和内脏并发症，在过去的几十年里，烧伤合并吸入性损伤在我国的发病率和病死率虽在逐渐下降，但其仍是烧伤致命的危险因素之一 ［ 18］ 。本研究团队认为，吸入性损伤不能简简单单地以“有或无”来划分，轻度与重度吸入性损伤对肺脏造成的损伤全然不同。轻度吸入性损伤只累及支气管层面，对肺实质并无太大的损伤；而重度吸入性损伤却累及肺泡层面，并常伴有大范围的炭末沉积、痰液渗出及严重的炎症反应 ［ 37］ 。造成烧伤患者死亡的另一重要原因为内脏并发症，现如今，其已经成了烧伤患者公认的死因。尤其在发生严重的心力衰竭和/或肾衰竭时，常预示着病情已进展至终末阶段。Brandão等 ［ 38］ 观察到在烧伤入院评分中引入并发症，可以更好地预测烧伤患者病死率，并推荐了一种对慢性合并症进行评分的标准化方法：Charlson合并症指数，其可以准确预测患者1年内的病死率。内脏并发症常见于心、肺、肾等重要脏器，其中，以肺脏并发症发生率最高，其发生率与吸入性损伤息息相关。2022年北京积水潭医院烧伤科专家团队分析显示，在223例严重烧伤患者中，有162例并发吸入性损伤，其中有近20例患者死亡 ［ 34］ 。除了肺外，心、肾并发症亦是造成患者死亡的重要因素；我国学者通过回顾性分析252例重度烧伤患者资料了解到并发心肌损害者死亡风险比未并发心肌损害者高得多 ［ 39］ 。我国学者在637例重度烧伤患者中观察到严重烧伤后急性肾损伤仍然很普遍 ［ 40］ ，与重度烧伤患者的高病死率息息相关。
4. 展望
自21世纪以来，烧伤面积、年龄、吸入性损伤及内脏并发症等已经成为烧伤患者死亡的公认危险因素，内脏并发症虽是大部分烧伤患者最终死因，但血清学指标作为预测内容的适用性有待进一步研究。许多学者提出的预测模型亦是围绕这些危险因素来开展的，尤其是改良Baux评分，更是得到了国际的较广泛认可。但本研究团队认为，由我国学者提出的烧伤患者预后相关预测模型可能更符合我国烧伤患者的特点，希望临床上对这些模型可以有更多的外部验证以证实其可靠性和临床实用性。
樊拂晓：酝酿和设计实验、实施研究、采集数据和论文撰写；李朋涛、夏正国：酝酿和设计实验及修改论文；谢超琼：资料收集及数据统计分析；徐结苟、徐庆连：酝酿和设计实验以及修改论文所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 假伤组与2个严重烫伤组大鼠伤后72 h肝组织损伤情况 苏木精-伊红×400，图中标尺为50 μm。1A.假伤组大鼠肝组织中的细胞排列规则，未见明显的炎症细胞浸润；1B.单纯烫伤组大鼠肝组织中可见大量的炎症细胞浸润，细胞排列紊乱，并可见弥漫的脂肪病变；1C.烫伤+肉碱组大鼠肝组织中可见少量的炎症细胞浸润以及散在的脂肪病变
注：图中箭头所指部位为病变部位
2 假伤组与2个严重烫伤组大鼠伤后72 h肝组织中细胞焦亡相关标志物表达水平。2A. 实时荧光定量反转录PCR条图（样本数均为5，
注：NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3，caspase-1为胱天蛋白酶1，IL-1β为白细胞介素1β，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条图横坐标下和条带图上方1、2、3分别为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+肉碱组；图2A中3组间NLRP3、caspase-1、消皮素D、IL-1β总体比较，F值分别为1 141.59、1 652.32、644.00、144.40，P值均<0.001；图2A中与假伤组比较，aP<0.01；与单纯烫伤组比较，bP<0.01；图2C中3组间NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N、剪切型IL-1β蛋白总体比较，F值分别为146.94、373.25、77.72、91.26、220.51，P值均<0.001；图2C中与假伤组比较，aP<0.01，与单纯烫伤组比较，bP<0.01
3 假伤组与2个严重烫伤组大鼠伤后72 h肝组织中内质网应激相关标志物表达水平。3A. 实时荧光定量反转录PCR条图（样本数均为5，
注：GRP78为葡萄糖调节蛋白78，CHOP为CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条图横坐标下和条带图上方的1、2、3分别为假伤组、单纯烫伤组、烫伤+肉碱组；图3A中3组间GRP78、CHOP总体比较，F值分别为268.17、160.76，P值均<0.001；图3A中与假伤组比较，aP<0.01，与单纯烫伤组比较，bP<0.01；图3C中3组间GRP78、CHOP总体比较，F值分别为164.63、30.88，P值均<0.001；图3C中与假伤组比较，aP<0.01，与单纯烫伤组比较，bP<0.01
4 培养24 h后5组HepG2细胞活力比较（样本数均为5，
注：DMSO为二甲基亚砜；图中横坐标下方1、2、3、4、5分别为DMSO组、0.1 μmol/L衣霉素组、0.2 μmol/L衣霉素组、0.4 μmol/L衣霉素组、0.8 μmol/L衣霉素组；5组间总体比较F=107.08，P<0.001；与DMSO组比较，aP<0.01
5 3组HepG2细胞培养24 h后内质网应激相关标志物蛋白表达水平比较。5A、5B.分别为条带图及其对应的条图（样本数均为3，
注：GRP78为葡萄糖调节蛋白78，CHOP为CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；图5A条带上方及图5B横坐标下方的1、2、3分别为二甲基亚砜组、单纯衣霉素组、衣霉素+肉碱组；图5B中3组间GRP78、CHOP总体比较，F值分别为69.72、318.45，P值均<0.001；图5B中与DMSO组比较，aP<0.01；与单纯衣霉素组比较，bP<0.05，cP<0.01
6 3组HepG2细胞培养24 h后细胞焦亡相关标志物蛋白表达水平比较。6A、6B.分别为条带图及其对应条图（样本数均为3，
注：NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3，caspase-1为胱天蛋白酶1，IL-1β为白细胞介素1β，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；图6A条带上方及图6B横坐标下方的1、2、3分别指二甲基亚砜（DMSO）组、单纯衣霉素组、衣霉素+肉碱组；图6B中3组间NLRP3、caspase-1、caspase-1/p20、消皮素D-N和剪切型IL-1β总体比较，F值分别为306.32、0.44、5.28、464.71、4.90，P值分别为<0.001、0.664、0.048、<0.001、0.055；图6B中与DMSO组比较，aP<0.01；与单纯衣霉素组比较，bP<0.01
表1 实时荧光定量反转录PCR法检测大鼠肝组织中内质网应激与细胞焦亡相关标志物mRNA的引物序列及产物大小
基因名称 引物序列（5'→3'） 产物大小（bp） GRP78 上游：GATGTAGGCACGGTGGTTGG下游：GTGAAGGCCACATACGACGG 131 CHOP 上游：AAGCCCTCGCTCTCCAGATT下游：TCCTTCATGCGCTGTTTCCC 132 NLRP3 上游：CAGCGATCAACAGGCGAGAC下游：AGAGATATCCCAGCAAACCTATCCA 141 caspase-1 上游：GACAAGATCCTGAGGGCAAA下游：GGTCTCGTGCCTTTTCCATA 163 消皮素D 上游：GGCAGCATCCTTGAGTGTCT下游：ATGGGGTGCTCTGTTCCAAG 199 IL-1β 上游：AGGCTTCCTTGTGCAAGTGT下游：TGAGTGACACTGCCTTCCTG 230 GAPDH 上游：AGACAGCCGCATCTTCTTGT下游：CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT 207 注：GRP78为葡萄糖调节蛋白78，CHOP为CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白，NLRP3为核苷酸结合寡聚化结构域蛋白样受体热蛋白结构域相关蛋白3，caspase-1为胱天蛋白酶1，IL-1β为白细胞介素1β，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶 
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表2 假伤组与2个严重烫伤组大鼠伤后72 h血清中AST和ALT含量比较（U/L，
组别 鼠数（只） AST ALT 假伤组 5 106±13 42±6 单纯烫伤组 5 640±22 157±8 烫伤+肉碱组 5 519±50 121±10 F值 372.98 252.14 P值 <0.001 <0.001 t1值 -46.78 -25.98 P1值 <0.001 <0.001 t2值 4.93 6.06 P2值 0.001 <0.001 注：AST为天冬氨酸转氨酶，ALT为丙氨酸转氨酶；F值、P值为3组间各指标总体比较所得；t1值、P1值为单纯烫伤组与假伤组各指标比较所得；t2值、P2值为烫伤+肉碱组与单纯烫伤组各指标比较所得
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