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人脐静脉内皮细胞外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制

易佳荣 李泽楠 谢慧清 陈舒悦 蒋碧梅 钱利 徐立新 李海红 雷少榕 陈志钊 周建大

衡雪, 李昌敏, 刘薇, 等. 连续性肾脏替代治疗对严重烧伤合并急性肾损伤患者的疗效及影响因素分析[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2024, 40(5): 468-475. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240207-00052.
引用本文: 易佳荣, 李泽楠, 谢慧清, 等. 人脐静脉内皮细胞外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(11): 1023-1033. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220622-00254.
Heng X,Li CM,Liu W,et al.Analysis of effects and influencing factors of continuous renal replacement therapy in severe burn patients complicated with acute kidney injury[J].Chin J Burns Wounds,2024,40(5):468-475.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20240207-00052.
Citation: Yi JR,Li ZN,Xie HQ,et al.Effects and mechanism of human umbilical vein endothelial cells-derived exosomes on wound healing in diabetic rabbits[J].Chin J Burns Wounds,2022,38(11):1023-1033.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220622-00254.

人脐静脉内皮细胞外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制

doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20220622-00254
基金项目: 

上海王正国创伤医学发展基金会生长因子复兴计划 SZYZ-TR-16

详细信息
    通讯作者:

    谢慧清,Email:xiaoxiang0733@126.com

Effects and mechanism of human umbilical vein endothelial cells-derived exosomes on wound healing in diabetic rabbits

Funds: 

Shanghai Wang Zhengguo Foundation for Traumatic Medicine Growth Factor Rejuvenation Plan SZYZ-TR-16

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  • 摘要:   目的  探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制。  方法  采用实验研究方法。取中南大学湘雅三医院2019年6月收治的2例糖尿病溃疡患者(男49岁、女58岁)手术切除溃疡周边皮肤组织,提取原代血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF),通过形态观察和流式细胞术成功鉴定。采用超速离心法提取HUVEC外泌体,通过形态观察、粒径检测和蛋白质印迹法检测成功鉴定。取20只3个月龄雌性新西兰兔,背部两侧分别制作1个2型糖尿病全层皮肤缺损创面,将创面分成外泌体组和磷酸盐缓冲液(PBS)组并进行相应处理,每组20个创面,观察创面组织完全覆盖时间。伤后14 d,行苏木精-伊红染色或Masson染色,观察血管生成或胶原纤维增生情况(样本数为20)。观察VEC和HSF与HUVEC外泌体共培养24 h对HUVEC外泌体的摄取情况。将VEC与HSF均分成采用HUVEC外泌体或PBS处理的外泌体组和PBS组,采用细胞计数试剂盒8检测培养4 d细胞增殖情况,采用划痕试验检测并计算划痕后24、48 h细胞迁移率,采用Transwell实验检测培养24 h细胞迁移数,采用实时荧光定量反转录PCR法检测核因子红细胞系2相关因子2(NRF2)、转录激活因子3(ATF3)的mRNA表达,行成管实验观测VEC培养12 h血管分支点数和成管长度(样本数均为3)。取VEC及HSF,分成同前处理的PBS组、外泌体组和采用相应基因干扰的NRF2干扰组、ATF3干扰组、空载干扰组,同前检测2种细胞增殖、迁移和VEC的血管形成(样本数均为3)。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、独立样本t检验及LSD检验。  结果  外泌体组创面组织完全覆盖时间为(17.9±1.9)d,明显短于PBS组的(25.2±2.3)d,t=4.54,P<0.05。伤后14 d,PBS组创面血管密度明显低于外泌体组(t=10.12,P<0.01),胶原纤维生成少于外泌体组。培养24 h,HUVEC外泌体成功被VEC和HSF摄取。培养4 d,外泌体组HSF和VEC增殖活力均明显强于PBS组(t值分别为54.73、7.05,P<0.01)。划痕后24、48 h,外泌体组HSF迁移率(t值分别为3.42、11.87,P<0.05或P<0.01)和VEC迁移率(t值分别为21.42、5.49,P<0.05或P<0.01)均明显高于PBS组。培养24 h,外泌体组VEC、HSF迁移数均明显多于PBS组(t值分别为12.31、16.78,P<0.01)。培养12 h,外泌体组HSF和VEC中NRF2的mRNA表达均明显高于PBS组(t值分别为7.52、5.78,P<0.05或P<0.01),ATF3的mRNA表达均明显低于PBS组(t值分别为13.44、8.99,P<0.01)。培养12 h,外泌体组VEC血管分支点数明显多于PBS组(t=17.60,P<0.01),成管长度明显长于PBS组(t=77.30,P<0.01)。培养4 d,NRF2干扰组HSF和VEC增殖活力均较PBS组和外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01);ATF3干扰组HSF和VEC增殖活力均较PBS组显著增加(P<0.05或P<0.01),均较外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01)。划痕后24、48 h,ATF3干扰组HSF和VEC的迁移率均较PBS组显著增加(P<0.05或P<0.01),均较外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01)。划痕后24、48 h,NRF2干扰组HSF和VEC的迁移率均较PBS组和外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01)。培养24 h,ATF3干扰组VEC和HSF的迁移数均明显多于PBS组(P<0.05),均明显少于外泌体组(P<0.05或P<0.01);NRF2干扰组VEC和HSF的迁移数均明显少于PBS组和外泌体组(P<0.01)。培养12 h,NRF2干扰组VEC血管长度、分支点数均较PBS组和外泌体组明显减少(P<0.01);ATF3干扰组VEC血管长度、分支点数均较PBS组明显增加(P<0.01),均较外泌体组明显减少(P<0.01)。  结论  HUVEC外泌体通过促进VEC和HSF的增殖、迁移,从而促进糖尿病兔创面愈合,而NRF2 和 ATF3 在这个过程中明显受到外泌体的影响,是外泌体作用的可能靶点。

     

  • (1)证实连续性肾脏替代治疗(CRRT)可显著改善严重烧伤合并急性肾损伤(AKI)患者肾功能、缓解肾脏损伤等。

    (2)筛选出肾前性AKI是导致严重烧伤合并AKI患者CRRT无效的主要独立影响因素。

    Highlights:

    (1)It was confirmed that the continuous renal replacement therapy (CRRT) could significantly improve renal function and alleviate renal injury in severe burn patients complicated with acute kidney injury (AKI).

    (2)Prerenal AKI was screened out as the main independent influencing factor leading to ineffective CRRT in severe burn patients complicated with AKI.

    休克、脓毒症、高肌红蛋白血症等引起的急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是烧伤患者最常见的并发症1。一篇包括20项研究的系统评价显示,合并AKI的烧伤患者病死率高达43%2。肾脏替代治疗(renal replacement therapy,RRT)可通过弥散、对流等原理平衡电解质、清除体内毒性物质和过多水分等,是针对AKI最有效、最常用的治疗手段。约8.34%的烧伤患者接受RRT,且约37.05%的烧伤合并AKI患者接受RRT3。根据持续时间不同,RRT可分为连续性RRT(continuous renal replacement therapy,CRRT)、间歇性RRT;根据治疗原理不同,CRRT可分为连续性静脉-静脉血液滤过、连续性静脉-静脉血液透析、连续性静脉-静脉血液透析滤过等模式4, 5, 6。随着RRT在重症领域的广泛应用,其适应证已从单纯的肾功能替代,拓展到炎症和应激因子清除、液体容量管理、内环境稳定等7。虽然RRT在治疗严重烧伤患者、合并脓毒症休克和AKI的烧伤患者、合并休克的烧伤患者中显示出临床获益,但接受RRT的烧伤合并AKI患者病死率仍较高8, 9, 10。这可能与RRT的启动时机、抗凝方式、模式选择等治疗细节方面尚无公认标准和共识有关。为此,本研究基于11年的临床经验和数据,回顾性分析CRRT在严重烧伤合并AKI患者中的应用效果,筛选出严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的影响因素,并对比分析不同AKI病因对CRRT临床疗效的影响,以期为CRRT在严重烧伤合并AKI患者中的应用提供参考。

    本回顾性病例系列研究获陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院伦理委员会批准,批号:KY2021122,并豁免知情同意。

    纳入标准:(1)年龄≥18岁;(2)因火焰、爆炸、热液、化学、电导致的烧伤;(3)住院期间接受CRRT;(4)根据2012版《改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease: Improving Global Outcomes,KDIGO)急性肾损伤临床实践指南》中制订的AKI诊断标准11诊断为AKI。排除标准:(1)有肾脏基础疾病史;(2)使用CRRT的原因为脓毒症、脓毒症休克等非AKI并发症;(3)临床资料不完整。

    2010年1月—2020年12月,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院收治79例符合入选标准的接受CRRT的严重烧伤合并AKI患者。主要观察指标为全部患者和不同AKI病因分组患者的CRRT整体效果。次要观察指标为全部患者和不同AKI病因分组患者的院内病死率和住院天数。

    收集全部患者的一般资料,包括性别、年龄、体重指数、烧伤面积(烧伤总面积、Ⅲ度烧伤面积)、烧伤指数、致伤原因、是否合并吸入性损伤、入院时急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)和脓毒症相关性器官功能衰竭评价(sepsis-related organ failure assessment,SOFA)评分、烧伤后入院时间和入院后发生AKI时间;CRRT整体效果,包括总体有效率、完全有效率、部分有效率、无效率、恶化率,治疗前后的肌酐、尿素、胱抑素C、液体超载率,院内病死率、基于Baux评分模型的预测病死率、最常见的死亡原因、住院天数。其中按照CRRT前后,以《KDIGO AKI临床实践指南》中的AKI诊断标准为依据的AKI分期变化,将患者肾功能改善情况分为完全有效、部分有效、无效和恶化4个等级,完全有效为治疗后AKI已完全恢复正常,部分有效为治疗后AKI已降期但未完全恢复正常,无效为治疗后AKI分期无变化,恶化为治疗后AKI分期升高11, 12, 13;液体超载以百分率表示,液体超载率=[每日入量(L)-每日出量(L)]÷入院时体重(kg)×100%14;Baux评分=年龄(岁)+烧伤总面积(%TBSA)+[17×是否合并吸入性损伤(是=1,否=0)];基于Baux评分模型的预测病死率(%)=e-8.816 3+(0.077 5×Baux评分)÷(1+e-8.816 3+(0.077 5×Baux评分)15

    根据CRRT效果,将患者分为有效组(42例)和无效组(37例),其中完全有效和部分有效均被认定为CRRT有效,无效和恶化被认定为CRRT无效。比较2组患者一般资料和发生AKI后启动CRRT时间、CRRT持续时间、AKI病因、CRRT启动前AKI分期、CRRT模式、抗凝剂种类、院内病死率。

    根据《中国AKI临床实践指南》和《脓毒症相关AKI共识》中AKI病因16, 17,将患者分为肾前性组(22例)和肾性组(57例),比较2组患者一般资料和发生AKI后启动CRRT时间、CRRT持续时间和CRRT整体效果(最常见的死亡原因除外)。

    采用SPSS 26.0统计软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料数据以x¯±s表示,组间比较行独立样本t检验;不符合正态分布的计量资料数据以MQ1Q3)表示,组间比较行Wilcoxon秩和检验;计数资料数据以频数、百分率表示,组间比较行χ2检验或Fisher确切概率法检验;等级资料数据以频数表示,组间比较行Mann-Whitney U检验。对有效组与无效组患者统计指标进行单因素分析,选取单因素分析结果中P<0.1的指标作为自变量,以CRRT是否有效(赋值:有效=1、无效=0)为因变量,进行多因素logistic回归分析,筛选严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的独立影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

    79例患者中,男73例、女6例,年龄(46±14)岁,体重指数(24.0±2.9)kg/m2,烧伤总面积(69±26)%TBSA,Ⅲ度烧伤面积(44±25)%TBSA,烧伤指数57(36,76)。火焰烧伤者36例、电烧伤者19例、热液烫伤者16例、爆炸伤者6例、化学烧伤者2例,39例患者合并吸入性损伤,入院时APACHE Ⅱ评分16(12,18)分、SOFA评分11(5,13)分,烧伤后0(0,2)d入院,入院后0(0,6)d发生AKI,47例(59.49%)患者在入院48 h内发生AKI。

    79例患者中,CRRT总体有效率53.16%(42/79)完全有效率30.38%(24/79)、部分有效率22.78%(18/79)、无效率31.65%(25/79)、恶化率15.19%(12/79)。患者治疗后的肌酐和尿素分别为139.50(92.70,195.00)μmol/L和13.00(8.37,23.78)mmol/L,均明显低于治疗前的230.50(124.60,341.30)μmol/L和19.70(12.22,26.55)mmol/L(Z值分别为-3.26、-2.54,P值分别为0.001、0.011);治疗后的胱抑素C和液体超载率分别为1.70(1.25,2.70)mg/L和4.58%(2.41%,6.63%),与治疗前的2.05(1.60,3.50)mg/L和5.24%(3.33%,8.71%)比较,差异均无统计学意义(Z值分别为-1.61、-1.37,P值分别为0.107、0.169)。患者院内病死率17.72%(14/79),基于Baux评分模型的预测病死率75.10%(18.94%,91.84%),最常见的死亡原因为MOF,住院天数39.43(11.52,110.58)d。

    2.3.1   单因素分析

    有效组和无效组患者Ⅲ度烧伤面积、CRRT持续时间、AKI病因比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其余指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1

    表1  有效组和无效组严重烧伤合并AKI患者的一般资料和CRRT相关资料比较
    表1.  Comparison of general data and CRRT-related data in the severe burn patients complicated with AKI between effective group and ineffective group
    组别例数性别(例)年龄(岁,x¯±s体重指数(kg/m2x¯±s烧伤总面积(%TBSA,x¯±sⅢ度烧伤面积[%TBSA,MQ1Q3)]烧伤指数[MQ1Q3)]
    有效组4239347±1224.3±3.169±2942(26,75)58(36,82)
    无效组3734346±1624.3±4.364±2537(20,52)51(34,73)
    统计量值t=0.30t=-0.01t=1.22Z=-1.99Z=-1.59
    P>0.9990.7610.9930.2250.0460.111
    注:有效组患者CRRT效果等级为完全有效或部分有效,无效组患者CRRT效果等级为无效或恶化;AKI为急性肾损伤,CRRT为连续性肾脏替代治疗,TBSA为体表总面积,APACHE Ⅱ为急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ,SOFA为脓毒症相关性器官功能衰竭评价,CVVH为连续性静脉-静脉血液滤过,CVVHDF为连续性静脉-静脉血液透析滤过;“—”表示无此项;CRRT模式中其他为混合使用CVVH和CVVHDF或单独使用连续性静脉-静脉血液透析,抗凝剂种类中其他为混合使用肝素或枸橼酸抗凝剂或使用除这2种抗凝剂之外的抗凝剂
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    2.3.2   多因素logistic回归分析

    选取2.3.1单因素分析中P<0.1的4个因素,即AKI病因、Ⅲ度烧伤面积、发生AKI后启动CRRT时间、CRRT持续时间。将AKI病因进行变量赋值(肾前性=0、肾性=1),其余3个指标以原始值代入,进行多因素logistic回归分析。结果显示,AKI病因和Ⅲ度烧伤面积均是严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的独立影响因素(P<0.05)。见表2

    表2  影响79例严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的多因素logistic回归分析结果
    表2.  Results of multivariate logistic regression analysis affecting the efficacy of CRRT in 79 severe burn patients complicated with AKI
    项目与分类比值比95%置信区间P
    常量0.070.002
    AKI病因
    肾性AKI(以肾前性AKI为参照)4.211.20~14.800.025
    Ⅲ度烧伤面积(%TBSA)1.031.00~1.050.024
    发生AKI后启动CRRT时间(h)1.330.87~2.030.182
    CRRT持续时间(h)1.000.99~1.000.186
    注:AKI为急性肾损伤,CRRT为连续性肾脏替代治疗,TBSA为体表总面积;“—”表示无此项
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    肾前性组和肾性组患者的烧伤总面积、烧伤指数、致伤原因、烧伤后入院时间、入院后发生AKI时间、发生AKI后启动CRRT时间、CRRT总体有效率和基于Baux评分模型的预测病死率比较,差异均有统计学意义(P<0.05);肾性组患者治疗前的尿素和胱抑素C均明显高于肾前性组(P<0.05),液体超载率明显低于肾前性组(P<0.05);肾性组患者治疗后的胱抑素C明显高于肾前性组(P<0.05);其余指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表34

    表3  肾前性组和肾性组严重烧伤合并AKI患者一般资料和CRRT相关时间参数比较
    表3.  Comparison of general data and CRRT-related time indexes in the severe burn patients complicated with AKI between prerenal group and renal group
    组别例数性别(例)年龄(岁,x¯±s体重指数(kg/m2x¯±s烧伤总面积[%TBSA,MQ1Q3)]Ⅲ度烧伤面积[%TBSA,MQ1Q3)]烧伤指数[MQ1Q3)]致伤原因(例)
    火焰烧伤电烧伤爆炸伤化学烧伤热液烫伤
    肾前性组2220246±1224.4±2.890(70,95)54(34,70)73(54,80)130216
    肾性组5753446±1424.2±4.062(40,86)34(20,59)47(32,67)23194110
    统计量值t=-0.09t=0.15Z=2.46Z=1.82Z=2.43χ2=12.59
    P>0.9990.9240.8770.0160.0720.0170.007
    注:肾前性和肾性为AKI病因;AKI为急性肾损伤,CRRT为连续性肾脏替代治疗,TBSA为体表总面积,APACHE Ⅱ为急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ,SOFA为脓毒症相关性器官功能衰竭评价;“—”表示无此项
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    表4  肾前性组和肾性组严重烧伤合并AKI患者CRRT效果比较
    表4.  Comparison of efficacy of CRRT in the severe burn patients complicated with AKI between prerenal group and renal group
    组别例数总体有效情况[例(%)]CRRT效果等级[例(%)]
    完全有效部分有效无效恶化
    肾前性组227(31.82)4(18.18)3(13.64)11(50.00)4(18.18)
    肾性组5735(61.40)20(35.09)15(26.32)14(24.56)8(14.04)
    统计量值χ2=5.58χ2=-1.92
    P0.0240.054
    注:肾前性和肾性为AKI病因;AKI为急性肾损伤,CRRT为连续性肾脏替代治疗
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    AKI是严重烧伤患者常见的并发症之一,发病率和病死率分别高达30%和80%18,而CRRT是治疗AKI的最终有效手段。近年研究显示,CRRT不仅具有肾脏替代作用,而且可清除代谢物、降低炎症应激反应、精确控制容量等,进而改善患者预后。因此,CRRT适应证已扩展到横纹肌溶解、脓毒症休克、水电解质紊乱、自身免疫系统疾病甚至急性脑损伤19, 20, 21。治疗细节包括CRRT的不同模式、启动时机、剂量、抗凝剂选择等方面22, 23, 24, 25, 26,但目前均缺乏统一标准。本研究回顾性分析了CRRT在烧伤合并AKI患者中的应用效果,筛选出了可能影响CRRT效果的因素。

    本研究显示,CRRT可明显降低严重烧伤合并AKI患者肌酐、尿素和液体超载率,这与前期多项研究结果27, 28, 29, 30较类似,进一步证实了CRRT可明显改善严重烧伤合并AKI患者肾功能、避免液体超载、缓解肾脏损伤。但是,本研究人群的病死率仍较高,其可能原因如下:(1)烧伤损伤机制和治疗的复杂性高,严重烧伤患者的成功救治几乎涉及机体每个系统,而造成死亡的原因常常是心脏、肺脏、肝脏、循环等多个功能障碍,而不单单是AKI,事实上本研究中1/2死亡人群的死亡原因为MOF。(2)入组患者年龄大、烧伤总面积大、烧伤病情危重,本身病死率就比较高;实际上基于Baux评分模型预测出本研究患者的病死率中位数为75.10%,明显高于实际病死率。(3)47例(59.49%)患者在入院48 h内发生AKI,提示大多数患者可能为外院并发AKI后转院过来,存在一定的病情延误。

    本研究将肾脏改善情况和部分远期指标(院内病死率、住院天数等)作为结局指标,以便从多个维度反映CRRT的效果。其中考虑到远期治疗效果的混杂因素较多,本研究将肾功能改善作为主要观察指标。现有研究显示,肌酐、尿素、尿量等可能受到容量、代谢等影响,单一指标并不能准确评价肾损伤程度,而KDIGO标准(主要包括肌酐和尿量)为近年来反映肾损伤程度的公认指标,比单一指标更为准确。为了减少CRRT启动时肾脏损伤程度不同的影响,本研究将KDIGO分期的变化情况作为疗效评价指标,同时结合肌酐、尿素等绝对值的变化,从不同角度反映CRRT对AKI的效果。

    本研究通过单因素分析和多因素logistic回归分析得出,AKI病因和Ⅲ度烧伤面积是严重烧伤合并AKI患者CRRT效果的独立影响因素,其中肾前性AKI的比值比为4.21,而Ⅲ度烧伤面积的比值比仅为1.03,接近1,说明Ⅲ度烧伤面积对CRRT效果影响小,因此肾前性AKI是严重烧伤合并AKI患者CRRT无效的主要独立影响因素。亚组分析也支持,肾前性组患者的CRRT总体有效率明显低于肾性组的结论。可能原因为CRRT可代替肾性AKI患者受损的肾功能,而肾前性AKI患者除了需要CRRT进行肾功能替代外,更需要着重去除导致AKI的病因。严重烧伤患者由于创面体液的大量丢失,容易出现机体有效循环容量降低,肾脏血流灌注不足,这是引起肾前性AKI的常见病因。因此,需要在CRRT基础上,大量补液以尽快补充有效血容量是促进肾前性AKI恢复的关键手段。此外,液体超载也会加重肾脏负担,导致AKI。Ⅲ度烧伤面积越大,烧伤病情越重,可能使患者AKI的损伤程度更重,导致给予CRRT后患者KDIGO分期改善的幅度更为明显。

    本研究也存在一定的局限性,样本量较少,但已纳入本单位近11年的数据,这可能与近年来严重烧伤发病率降低有关,后续仍然需要大规模、多中心、前瞻性临床研究来解决这一问题。

    综上,本研究表明,CRRT可明显改善严重烧伤合并AKI患者肾功能、避免液体超载、缓解肾脏损伤等。肾前性AKI是严重烧伤合并AKI患者CRRT无效的独立影响因素。

    易佳荣、李泽楠:实验设计与实施、数据收集、文章起草;谢慧清、周建大:获取研究经费、对文章的知识性内容作批评性审阅;陈舒悦、陈志钊:技术和材料支持;蒋碧梅、钱利、徐立新、李海红、雷少榕:数据整理与统计分析
    所有作者均声明不存在利益冲突
  • 参考文献(31)

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  • 1  从糖尿病足溃疡患者创面周围组织提取的原代血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)形态 光学显微镜×400。1A.原代VEC呈菱形或多角形;1B.原代HSF呈纺锤形或者多角形扁平状

    2  采用3种方法进行人脐静脉内皮细胞(HUVEC)外泌体的鉴定。2A.颗粒呈囊状或球形 电子显微镜×100 000;2B.粒度分析显示颗粒直径为70~100 nm;2C.蛋白质印迹法检测显示,较于人胚肾细胞293,HUVEC来源的颗粒高表达CD63和TSG101,低表达钙连蛋白

    注:图2C为横坐标经过lg处理的数据形成的描记图,该图上方1、2分别为人胚肾细胞293与HUVEC来源外泌体;TSG101为肿瘤易感基因101

    3  外泌体组和磷酸盐缓冲液(PBS)组全层皮肤缺损兔伤后各时间点创面愈合情况。3A、3B、3C.分别为伤后0(即刻)、14、30 d创面愈合情况,每张图中左侧标记A的为外泌体组,右侧标记B的为PBS组,外泌体组创面伤后14、30 d均较PBS组愈合快

    4  外泌体组和磷酸盐缓冲液(PBS)组全层皮肤缺损兔伤后14 d血管新生和胶原纤维增生情况。4A、4B.分别为外泌体组和PBS组血管新生情况 苏木精-伊红×200,图4A新生血管较图4B多;4C、4D.分别为外泌体组和PBS组胶原纤维增生情况 Masson×200,图4C胶原纤维增生较图4D多

    5  从糖尿病足溃疡患者创面周围组织提取的血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)培养24 h成功摄取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)外泌体 PKH67-鬼笔环肽-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×200。5A、5B.分别为VEC及HSF胞质染色(红色)、胞核染色(蓝色)、外泌体染色(绿色)合并图,2种细胞均成功摄取外泌体

    6  划痕试验观察2组人皮肤成纤维细胞(HSF)和血管内皮细胞(VEC)培养各时间点划痕情况 光学显微镜×200。6A、6B.分别为磷酸盐缓冲液(PBS)组和外泌体组HSF培养0 h(即刻);6C、6D.分别为PBS组和外泌体VEC培养0 h;6E、6F和6G、6H.分别为PBS组、外泌体组HSF和VEC培养48 h,外泌体组2种细胞培养48 h剩余划痕面积均小于PBS组

    7  Transwell实验观察2组血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)培养24 h的迁移情况 结晶紫×200。7A.磷酸盐缓冲液(PBS)组VEC;7B.外泌体组VEC,迁移数明显多于图7A;7C.PBS组HSF;7D.外泌体组HSF,穿膜数明显多于图7C

    8  2组血管内皮细胞培养12 h血管分支点数和成管长度。8A、8B.分别为磷酸盐缓冲液(PBS)组和外泌体组血管生成情况,图8B新生血管数明显多于图8A 光学显微镜×400;8C、8D.分别为2组血管分支点数和成管长度比较(样本数为3,x¯±s

    注:与PBS组比较,aP<0.01

    9  2组人皮肤成纤维细胞(HSF)和血管内皮细胞(VEC)培养12 h的核转录因子红系2相关因子2 (NRF2) 和转录激活因子3 (ATF3) mRNA表达比较(样本数为3,x¯±s)。9A.HSF;9B.VEC

    注:与磷酸盐缓冲液(PBS)组比较,aP<0.01,bP<0.05

    10  划痕试验观察5组人皮肤成纤维细胞(HSF)和血管内皮细胞(VEC)划痕后各时间点迁移情况 光学显微镜×200。10A、10B、10C、10D、10E及10F、10G、10H、10I、10J.分别为磷酸盐缓冲液(PBS)组、外泌体组、核转录因子红系2相关因子2 (NRF2) 干扰组、转录激活因子3 (ATF3) 干扰组、空载干扰组HSF划痕后0(即刻)、48 h;10K、10L、10M、10N、10O及10P、10Q、10R、10S、10T.分别为PBS组、外泌体组、NRF2干扰组、ATF3干扰组、空载干扰组VEC划痕后0、48 h

    11  Transwell实验观察5组血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)培养24 h的迁移情况 结晶紫×200。11A、11B、11C、11D、11E.分别为磷酸盐缓冲液(PBS)组、外泌体组、核转录因子红系2相关因子2 (NRF2) 干扰组、转录激活因子3 (ATF3) 干扰组、空载干扰组VEC,图11C迁移数少于图11A和11B,图11D迁移数多于图11A、少于11B;11F、11G、11H、11I、11J.分别为PBS组、外泌体组、NRF2干扰组、ATF3干扰组、空载干扰组HSF,图11H迁移数少于图11F和11G,图11I迁移数多于图11F、少于图11G

    12  5组VEC和HSF培养24 h的迁移数比较(样本数为3,x¯±s)。12A.人皮肤成纤维细胞;12B.血管内皮细胞

    注:横坐标下1、2、3、4、5分别代表磷酸盐缓冲液(PBS)组、外泌体组、核转录因子红系2相关因子2(NRF2)干扰组、转录激活因子3(ATF3)干扰组、空载干扰组;5组血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)总体比较,差异均明显(F值分别为11.43、21.10,P值分别为0.008、<0.001);与PBS组比较,aP<0.01,cP<0.05;与外泌体组比较,bP<0.01,dP<0.05

    13  5组血管内皮细胞培养12 h血管分支点数和成管长度 光学显微镜×400。13A、13B、13C、13D、13E.分别为磷酸盐缓冲液组、外泌体组、核因子红细胞系2相关因子2干扰组、转录激活因子干扰组、空载干扰组,图13C成管长度和分支点数均较图13A、13B减少,图13D成管长度和分支点数均较图13A增加,较图13B减少

    14  5组血管内皮细胞血管长度及分支数目比较(样本数为3,x¯±s)。14A、14B.分别为分支点数、成管长度

    注:横坐标下1、2、3、4、5分别代表磷酸盐缓冲液(PBS)组、外泌体组、核转录因子红系2相关因子2干扰组、转录激活因子3 干扰组、空载干扰组;5组血管分支点数和成管长度总体比较差异均明显(F值分别为7.51、9.12,P值分别为0.011、0.005);与PBS组比较,aP<0.01,与外泌体组比较,bP<0.01

    表1  2组VEC和HSF划痕后各时间点迁移率比较(%,x¯±s

    组别样本数HSFVEC
    24 h48 h24 h48 h
    外泌体组342.1±1.3a72.2±0.9b48.2±1.6b87.1±2.3b
    PBS组326.1±1.344.2±1.030.1±1.663.2±1.5
    注:人皮肤成纤维细胞(HSF)时间因素主效应,F=33.20,P=0.020;处理因素主效应,F=134.80,P=0.012;两者交互作用,F=95.10,P=0.021;血管内皮细胞(VEC)时间因素主效应,F=37.10,P=0.010;处理因素主效应,F=191.70,P=0.007;两者交互作用,F=45.10,P=0.009;与磷酸盐缓冲液(PBS)组比较,aP<0.05,bP<0.01
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    表2  5组血管内皮细胞和人皮肤成纤维细胞培养4 d增殖活力比较(x¯±s

    组别样本数人皮肤成纤维细胞血管内皮细胞
    PBS组30.904±0.0051.047±0.046
    外泌体组31.205±0.0111.311±0.010
    NRF2干扰组30.813±0.006ab0.896±0.005ad
    ATF3干扰组31.003±0.005bc1.192±0.014ad
    空载干扰组30.915±0.0041.072±0.045
    F7.986.02
    P0.0140.004
    注:NRF2为核转录因子红系2相关因子2,ATF3为转录激活因子3;与磷酸盐缓冲液(PBS)组比较,aP<0.05,cP<0.01;与外泌体组比较,bP<0.01,dP<0.05
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    表3  5组血管内皮细胞和人皮肤成纤维细胞划痕后各时间点迁移率比较(%,x¯±s

    组别样本数人皮肤成纤维细胞血管内皮细胞
    24 h48 h24 h48 h
    PBS组325.2±0.941.2±1.031.2±2.061.2±1.0
    外泌体组340.8±1.169.2±0.749.8±1.086.0±2.0
    NRF2干扰组321.0±0.8ab37.0±1.2bd26.0±0.9ab54.0±1.2bd
    ATF3干扰组333.0±0.7ac56.0±1.2cd38.0±0.7ab71.0±1.3bd
    空载干扰组325.0±0.740.0±1.130.0±1.060.0±1.0
    注:NRF2为核转录因子红系2相关因子2,ATF3为转录激活因子3;人皮肤成纤维细胞时间因素主效应,F=33.20,P=0.022,处理因素主效应,F=104.60,P=0.003,两者交互作用,F=125.10,P=0.019;血管内皮细胞时间因素主效应,F=19.10,P=0.036,处理因素主效应,F=221.10,P=0.005,两者交互作用,F=45.10,P=0.009;与磷酸盐缓冲液(PBS)组比较,aP<0.05,dP<0.01;与外泌体组比较,bP<0.01,cP<0.05
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  • 收稿日期:  2022-06-22

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