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人脐静脉内皮细胞外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制

易佳荣 李泽楠 谢慧清 陈舒悦 蒋碧梅 钱利 徐立新 李海红 雷少榕 陈志钊 周建大

佟琳, 张万福, 韩飞, 等. 自体刃厚皮移植预制尿道联合阴囊皮瓣修复尿道中段缺损伴阴茎缺损的临床效果[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2023, 39(3): 215-220. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20221021-00465.
引用本文: 易佳荣, 李泽楠, 谢慧清, 等. 人脐静脉内皮细胞外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制[J]. 中华烧伤与创面修复杂志, 2022, 38(11): 1023-1033. DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220622-00254.
Tong L,Zhang WF,Han F,et al.Clinical effects of autologous split-thickness skin grafting for prefabricating urethra combined with scrotal flap in repairing middle urethral defect with penile defect[J].Chin J Burns Wounds,2023,39(3):215-220.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20221021-00465.
Citation: Yi JR,Li ZN,Xie HQ,et al.Effects and mechanism of human umbilical vein endothelial cells-derived exosomes on wound healing in diabetic rabbits[J].Chin J Burns Wounds,2022,38(11):1023-1033.DOI: 10.3760/cma.j.cn501225-20220622-00254.

人脐静脉内皮细胞外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制

doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20220622-00254
基金项目: 

上海王正国创伤医学发展基金会生长因子复兴计划 SZYZ-TR-16

详细信息
    通讯作者:

    谢慧清,Email:xiaoxiang0733@126.com

Effects and mechanism of human umbilical vein endothelial cells-derived exosomes on wound healing in diabetic rabbits

Funds: 

Shanghai Wang Zhengguo Foundation for Traumatic Medicine Growth Factor Rejuvenation Plan SZYZ-TR-16

More Information
  • 摘要:   目的  探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)外泌体对糖尿病兔创面愈合的作用及其机制。  方法  采用实验研究方法。取中南大学湘雅三医院2019年6月收治的2例糖尿病溃疡患者(男49岁、女58岁)手术切除溃疡周边皮肤组织,提取原代血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF),通过形态观察和流式细胞术成功鉴定。采用超速离心法提取HUVEC外泌体,通过形态观察、粒径检测和蛋白质印迹法检测成功鉴定。取20只3个月龄雌性新西兰兔,背部两侧分别制作1个2型糖尿病全层皮肤缺损创面,将创面分成外泌体组和磷酸盐缓冲液(PBS)组并进行相应处理,每组20个创面,观察创面组织完全覆盖时间。伤后14 d,行苏木精-伊红染色或Masson染色,观察血管生成或胶原纤维增生情况(样本数为20)。观察VEC和HSF与HUVEC外泌体共培养24 h对HUVEC外泌体的摄取情况。将VEC与HSF均分成采用HUVEC外泌体或PBS处理的外泌体组和PBS组,采用细胞计数试剂盒8检测培养4 d细胞增殖情况,采用划痕试验检测并计算划痕后24、48 h细胞迁移率,采用Transwell实验检测培养24 h细胞迁移数,采用实时荧光定量反转录PCR法检测核因子红细胞系2相关因子2(NRF2)、转录激活因子3(ATF3)的mRNA表达,行成管实验观测VEC培养12 h血管分支点数和成管长度(样本数均为3)。取VEC及HSF,分成同前处理的PBS组、外泌体组和采用相应基因干扰的NRF2干扰组、ATF3干扰组、空载干扰组,同前检测2种细胞增殖、迁移和VEC的血管形成(样本数均为3)。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、独立样本t检验及LSD检验。  结果  外泌体组创面组织完全覆盖时间为(17.9±1.9)d,明显短于PBS组的(25.2±2.3)d,t=4.54,P<0.05。伤后14 d,PBS组创面血管密度明显低于外泌体组(t=10.12,P<0.01),胶原纤维生成少于外泌体组。培养24 h,HUVEC外泌体成功被VEC和HSF摄取。培养4 d,外泌体组HSF和VEC增殖活力均明显强于PBS组(t值分别为54.73、7.05,P<0.01)。划痕后24、48 h,外泌体组HSF迁移率(t值分别为3.42、11.87,P<0.05或P<0.01)和VEC迁移率(t值分别为21.42、5.49,P<0.05或P<0.01)均明显高于PBS组。培养24 h,外泌体组VEC、HSF迁移数均明显多于PBS组(t值分别为12.31、16.78,P<0.01)。培养12 h,外泌体组HSF和VEC中NRF2的mRNA表达均明显高于PBS组(t值分别为7.52、5.78,P<0.05或P<0.01),ATF3的mRNA表达均明显低于PBS组(t值分别为13.44、8.99,P<0.01)。培养12 h,外泌体组VEC血管分支点数明显多于PBS组(t=17.60,P<0.01),成管长度明显长于PBS组(t=77.30,P<0.01)。培养4 d,NRF2干扰组HSF和VEC增殖活力均较PBS组和外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01);ATF3干扰组HSF和VEC增殖活力均较PBS组显著增加(P<0.05或P<0.01),均较外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01)。划痕后24、48 h,ATF3干扰组HSF和VEC的迁移率均较PBS组显著增加(P<0.05或P<0.01),均较外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01)。划痕后24、48 h,NRF2干扰组HSF和VEC的迁移率均较PBS组和外泌体组显著降低(P<0.05或P<0.01)。培养24 h,ATF3干扰组VEC和HSF的迁移数均明显多于PBS组(P<0.05),均明显少于外泌体组(P<0.05或P<0.01);NRF2干扰组VEC和HSF的迁移数均明显少于PBS组和外泌体组(P<0.01)。培养12 h,NRF2干扰组VEC血管长度、分支点数均较PBS组和外泌体组明显减少(P<0.01);ATF3干扰组VEC血管长度、分支点数均较PBS组明显增加(P<0.01),均较外泌体组明显减少(P<0.01)。  结论  HUVEC外泌体通过促进VEC和HSF的增殖、迁移,从而促进糖尿病兔创面愈合,而NRF2 和 ATF3 在这个过程中明显受到外泌体的影响,是外泌体作用的可能靶点。

     

  • (1)自体刃厚皮具有容易切取、取材范围广、成活率高等特点,此前鲜见关于将其作为移植物预制缺损尿道的报道。

    阴茎作为男性主要生殖器官,具有性交、排尿和射精等功能。阴茎位置较隐蔽,一般情况下不易受伤,一旦损伤则会给患者造成巨大的心理和生理障碍 1。手术是目前唯一能有效治疗因外伤致阴茎缺损伴尿道损伤的手段。文献报道,尿道中段缺损的手术方法多种多样 2,但尚无一种公认的令人满意的术式。尤其是外伤致严重尿道中段缺损伴重度畸形,手术难度大、术后并发症多 3, 4, 5,术者往往需要综合考虑致伤原因、缺损长度、局部组织条件等多方面因素,才能确定最适合患者的手术方式 6, 7

    临床上,尿道成形术和端端吻合术 8是尿道损伤的典型干预措施。然而,对于缺损长度≥3 cm、存在局部并发症的复杂尿道缺损患者,往往需要行局部或游离组织移植 9,临床中常用的自体移植物包括皮瓣或口腔黏膜(颊黏膜、舌黏膜和唇黏膜) 10, 11, 12。研究表明,皮瓣的获取和移植技术要求高,较皮片移植更为复杂,且皮瓣移植术后并发症多,患者并不倾向于采用这种治疗方法 13。有些患者可能存在口腔疾病或损伤,导致供体组织(如颊黏膜或其他黏膜移植物)不充足或者不可用。临床研究显示,将口腔黏膜组织作为移植物,取材范围不能超过8 cm×6 cm 14,且需要受区条件适宜,如新鲜的创基或良好的血运等,且口腔黏膜组织移植术后2周内都影响患者进食 15。本课题组实践表明,对于一些复杂且损伤程度较重的尿道中段缺损伴阴茎缺损,自体刃厚皮移植预制尿道联合阴囊皮瓣修复是一种较佳的选择。

    本回顾性观察性研究符合《赫尔辛基宣言》的基本原则。根据空军军医大学第一附属医院伦理委员会政策,可以在不泄露患者身份的前提下对其临床资料进行使用及分析。患者或其家属签署知情同意书。

    纳入标准:(1)年龄14~60岁,男性;(2)热力烧伤、电击伤、交通伤等外伤导致尿道中段缺损伴阴茎缺损形成尿瘘的患者;(3)尿道缺损长3~5 cm者;(4)接受尿道及阴茎重建手术治疗及长期随访者。排除标准:临床资料不全者。

    2015年1月—2022年1月,空军军医大学第一附属医院收治8例符合入选标准的外伤致尿道中段缺损伴阴茎缺损形成尿瘘男性患者。患者年龄14~58岁,其中2例未成年患者年龄分别为14、16岁,尿道缺损长度为3~5 cm。致伤原因包括热力烧伤(4例)、电击伤(2例)、交通伤(2例),部分患者伤后3个月因瘢痕挛缩伴有阴茎偏曲。患者于伤后48~96 h入院。

    1.3.1   术前准备

    术前充分与患者或其家属沟通,告知治疗方法、治疗过程及术后注意事项等。根据致伤原因,予抗感染、控制血糖、纠正电解质紊乱、营养支持治疗,改善全身一般状况。行尿道创面分泌物标本微生物培养,根据药物敏感试验结果选用敏感抗生素并静脉给药。术前1 d或手术当天进手术室前对术区行常规剃毛。

    1.3.2   手术方法

    所有患者手术由同一位经验丰富的主任医师主刀完成。手术分2期进行:Ⅰ期行自体皮移植预制缺损段尿道,Ⅱ期行尿道吻接及单侧阴囊皮瓣转移重建尿道及阴茎。

    Ⅰ期手术于全身麻醉下进行,术区常规碘伏消毒、铺巾,留置导尿管。用电动取皮刀切取大腿外侧与缺损尿道长度相当的自体刃厚皮,其宽度为导尿管的周径,大腿继发创面用油纱覆盖包扎。将所取的刃厚皮修剪后,包裹在由2个末端拼接的导尿管形成的尿道模具外面,以6-0可吸收缝线缝合,形成自体刃厚皮卷管。将卷管植入一侧阴囊肉膜内,预制成缺损段尿道,以3-0缝线间断缝合。术后24 h内应用头孢类、喹诺酮类抗生素或根据术前尿道创面分泌物标本微生物培养结果及药物敏感试验结果选用抗生素抗感染,术后10 d拆除缝线。Ⅰ期术后1个月行Ⅱ期手术,Ⅰ、Ⅱ期手术期间每隔2周更换1次导尿管。

    Ⅱ期手术于气管插管全身麻醉及仰卧位下进行。切除损伤尿道周围瘢痕,充分暴露新鲜尿道组织,尽量保留尿道海绵体及阴茎海绵体,避免损伤阴茎背侧血管束,于海绵体内注入生理盐水使阴茎勃起。清创后,阴茎缺损创面的面积为5.0 cm×2.5 cm~7.0 cm×5.5 cm。按创面面积切取皮瓣,依次切开阴囊皮肤、皮下组织及肉膜,在肉膜下潜行分离,且保留足够长的肉膜作为血管蒂,形成单侧阴囊皮瓣。阴囊皮瓣的面积为6.0 cm×3.0 cm~8.0 cm×6.0 cm。分离预制尿道,勿伤及成型的卷管,彻底止血,确保所预制的尿道与单侧阴囊皮瓣为一体转移至阴茎腹侧创面上。取出卷管内的尿道模具,更换导尿管,并将导尿管由阴茎头端穿过预置尿道至膀胱内。将自体刃厚皮卷管与原尿道缺损断端桥接吻合,将吻合口两端剪成斜面,用4-0可吸收缝线内翻缝合,恢复尿道的连续性,检查无张力即可。旋转阴囊皮瓣后,用阴囊肉膜修复尿道海绵体,同时包裹外露的阴茎海绵体,彻底止血,依次分层缝合,恢复阴茎的连续性,完成阴茎重建。将供瓣区创面直接缝合,受区放置引流片。将阴茎部依次用油纱、湿纱布、干纱布覆盖并打包包扎。术后24~48 h拔除阴囊部引流片,术后3周拔除导尿管。自术后72 h起,嘱患者每日至少自主排尿1次。术后10 d拆除术区缝线、局部敷料。

    观察并记录Ⅱ期术后7 d皮瓣成活情况。Ⅱ期术后3周,采用尿流率检测仪测定患者尿流率(尿流率>15 mL/s为排尿通畅) 16,观察有无尿瘘、勃起功能,采用本研究团队自行设计的疗效满意度调查表 17对患者进行疗效满意度调查,调查表包括身体约束度、舒适度及认可度3个指标,总分为0~15分,分数越高表示对疗效越满意。Ⅱ期术后,每3个月门诊复查1次,1年后每年复查1次,随访时观察皮瓣受区外观,采用温哥华瘢痕量表(VSS) 18评估供皮区及供瓣区瘢痕情况,同前检测尿流率,观察有无尿道狭窄、尿瘘及勃起功能,调查患者对疗效的满意度。

    采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析。计量资料数据均不符合正态分布,以 MQ 1Q 3)表示。

    8例患者Ⅱ期术后7 d皮瓣完全成活。Ⅱ期术后3周,患者尿流率为25.3(18.0,38.5)mL/s,排尿通畅,无尿瘘,有勃起功能,对疗效的满意度评分为14.3(14.0,15.0)分。随访1~7年,8例患者皮瓣受区外形饱满、不臃肿,质地柔软,颜色与周围组织相近,供皮区VSS评分为11.5(10.0,13.0)分,供瓣区VSS评分为10.5(9.3,12.0)分,尿流率为24.6(17.7,34.1)mL/s,无尿道狭窄、尿瘘及勃起功能受限,对疗效的满意度评分为13.5(13.3,14.8)分。

    患者男,14岁,因火焰烧伤全身多处伴疼痛于伤后48 h被收入空军军医大学第一附属医院。入院时体格检查显示:全身除腹部、左下肢及背部部分皮肤外,其余皮肤均被烧伤,烧伤总面积为85%TBSA,大部分烧伤创面表皮脱落,创基多红白相间,部分呈苍白色,头皮部分烧焦,四肢末梢血运尚可。入院后予抗感染、抗休克、营养支持治疗,纠正电解质紊乱,改善全身一般状况后,分次有计划地植皮封闭创面。全身创面基本封闭后,同前行2期手术。尿道缺损长度为4 cm,清创后阴茎缺损创面面积为7.0 cm×5.0 cm。伤后2个月,Ⅰ期行自体皮移植预制缺损段尿道;伤后3个月,Ⅱ期行尿道吻接及单侧阴囊皮瓣(面积为8.0 cm×5.5 cm)转移重建尿道及阴茎。Ⅱ期术后24 h,拔除阴囊部引流片。Ⅱ期术后7 d,阴囊皮瓣存活良好;Ⅱ期术后3周,患者站立式排尿,尿流率为29.0 mL/s,排尿通畅,无尿瘘,有勃起功能,对疗效的满意度评分为14.0分。随访7年,患者未出现尿瘘、尿道狭窄,尿流率为32.0 mL/s,排尿功能及勃起功能正常,供皮区瘢痕VSS评分为10.0分,供瓣区VSS评分为8.0分,阴茎、阴囊发育正常,对疗效的满意度评分为13.0分。见 图1

    1  自体皮移植预制尿道联合阴囊皮瓣修复烧伤患者尿道中段缺损伴阴茎缺损。1A.伤后1个月,下腹部至双大腿仅有少量正常皮肤,会阴周围均为Ⅲ度烧伤创面;1B.Ⅰ期术前(伤后2个月)会阴周围瘢痕形成,尿道中段缺损伴阴茎部分缺损;1C.用自体刃厚皮制备卷管,植入单侧阴囊前;1D.预制尿道植入阴囊并缝合后;1E.Ⅱ期术前(伤后3个月),会阴周围瘢痕增生明显,阴囊术区愈合良好;1F.Ⅱ期术中寻找并游离预制自体刃厚皮卷管;1G.Ⅱ期术中将自体刃厚皮卷管两端与原尿道缺损断端吻合;1H.Ⅱ期术后7 d,皮瓣存活良好,创面愈合良好;1I.术后1年随访,阴囊皮瓣存活良好,站立式排尿,排尿通畅,无尿道狭窄;1J.术后7年随访,勃起功能正常,阴茎、阴囊发育正常

    外伤导致的尿道损伤的修复困难重重,随着尿道修复技术的发展,重建尿道的方式多种多样,但手术失败率仍较高 19。目前国内外均认为自体组织游离移植是尿道中段损伤修复最可靠的方法 20, 21, 22,包括皮肤游离移植、黏膜组织游离移植。为确保移植后口腔黏膜成活 23, 24,用口腔黏膜修复的缺损长度不宜超过5 cm。Mundy 25提出将颊黏膜作为移植物修复尿道,但术后仍存在移植物收缩问题,针对该情况他改用薄层自体刃厚皮修复尿道,防止了因术后移植物收缩而导致的尿道狭窄。因此对于外伤导致的尿道损伤患者,自体皮移植成为较佳的选择。本研究选用自体刃厚皮移植进行尿道重建,具有皮片容易切取、取材范围广、成活率高等特点。外伤后缺损的尿道有较多的定植菌,分泌物较多,感染概率高,不仅可导致移植物存活不良而且可引起再造尿道狭窄。本研究中8例患者随访未出现尿道狭窄,这可能与自体皮移植后组织血管化较好有关。黏膜抗感染能力差,而将无血运的刃厚皮Ⅰ期埋植于阴囊肉膜内寄养,不损伤包裹睾丸和精索的被膜,Ⅱ期随阴囊皮瓣修复重建尿道,降低感染概率。有研究者采用邻近尿道的包皮、睾丸鞘膜、阴囊皮肤组织制作皮管,Ⅱ期转移修复缺损的尿道,尿瘘、尿道狭窄等并发症少 26。然而对于热力烧伤、电击伤、交通伤等外伤导致尿道中段缺损形成尿瘘的复合伤患者,原有的包皮损伤且通常伴有瘢痕,导致会阴区无可利用的组织。采用大腿自体刃厚皮移植预制尿道联合阴囊皮瓣修复缺损尿道,可避免利用因外伤导致受区周围条件差的组织及再造尿道因移植组织量不足影响修复效果。本研究中8例患者采用自体皮移植预制缺损尿道联合阴囊皮瓣修复尿道后,无尿瘘及尿道狭窄,其中2例未成年患者随年龄的增长,阴茎及阴囊正常发育,勃起功能正常,排尿通畅。

    阴囊皮瓣血供丰富、抗感染能力强,移植该皮瓣后,创面可以在相对较短的时间内愈合,且该皮瓣可受神经支配对外界刺激做出反应,是修复尿道及阴茎缺损的较佳选择之一。预制尿道在阴囊皮瓣内寄养1个月后,与周围结构一体化,更易存活。阴囊皮瓣取材面积大,旋转角度较灵活,既可以为受区提供良好的血供,又相当于在尿道外增加了一层组织,可预防尿瘘的发生。阴囊皮肤在质地、颜色和纹理上与阴茎皮肤高度相似,且供区位置隐蔽,不会遗留明显的手术瘢痕。本研究中8例患者术区阴囊未见明显瘢痕,受区颜色、质地与周围正常皮肤相近。移植阴囊皮瓣后,不仅填补了筋膜结构的缺失,而且恢复了阴茎悬韧带的连续性,保留了重建后的阴茎勃起功能。阴囊是男性阴茎根部下方容纳和保护睾丸及附睾的多层结构囊袋,其皮肤有聚成小皱襞的能力,用阴囊皮瓣转移重建阴茎,不仅可使阴茎恢复收缩功能,还保留了其深层感觉。术后及随访观察到,本研究中8例患者阴囊皮瓣完全成活,排尿通畅,均有勃起功能,对疗效的满意度高。

    本术式注意事项:(1)将吻合口两端剪成斜面,在无张力下精细严格地内翻对位缝合,避免术后出现吻合口瘘;(2)术中需彻底止血,以减少血肿的形成和感染的发生;(3)充分游离、切除纤维化或形成了瘢痕的尿道及周围组织,改善重建后尿道狭窄及阴茎偏曲;(4)若同期行阴茎背侧瘢痕松解植皮,植皮区加压包扎敷料的首次更换时间不宜过早,避免影响新生血管重建的数量和速度,以术后10 d为宜 27;(5)尽量避开瘢痕纤维化明显的部位取阴囊皮瓣,减少切口愈合过程中瘘的发生,保留一侧肉膜作为血管蒂,减小皮瓣旋转牵拉的角度,便于移植物覆盖;(6)由于此类患者致病因素的特殊性,手术需分期进行,临床上也可根据患者阴茎发育情况、阴茎瘢痕挛缩程度、尿道缺损长短来综合判断是否需行分期手术。

    本研究为单中心回顾性研究,采用自体刃厚皮游离移植重建复杂性尿道中段缺损,手术方法简便实用,具有临床可行性,手术成功率高,术后效果好;阴囊皮瓣血运可靠、组织层次多、厚度佳、有一定收缩功能、转移灵活。自体皮游离移植联合阴囊皮瓣修复缺损尿道及阴茎,不仅重建了尿道结构及阴茎外形,而且恢复了阴茎的感觉及勃起功能,术后并发症少、瘢痕增生不明显、患者满意度高,值得临床推广。

    易佳荣、李泽楠:实验设计与实施、数据收集、文章起草;谢慧清、周建大:获取研究经费、对文章的知识性内容作批评性审阅;陈舒悦、陈志钊:技术和材料支持;蒋碧梅、钱利、徐立新、李海红、雷少榕:数据整理与统计分析
    所有作者均声明不存在利益冲突
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  • 1  从糖尿病足溃疡患者创面周围组织提取的原代血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)形态 光学显微镜×400。1A.原代VEC呈菱形或多角形;1B.原代HSF呈纺锤形或者多角形扁平状

    2  采用3种方法进行人脐静脉内皮细胞(HUVEC)外泌体的鉴定。2A.颗粒呈囊状或球形 电子显微镜×100 000;2B.粒度分析显示颗粒直径为70~100 nm;2C.蛋白质印迹法检测显示,较于人胚肾细胞293,HUVEC来源的颗粒高表达CD63和TSG101,低表达钙连蛋白

    注:图2C为横坐标经过lg处理的数据形成的描记图,该图上方1、2分别为人胚肾细胞293与HUVEC来源外泌体;TSG101为肿瘤易感基因101

    3  外泌体组和磷酸盐缓冲液(PBS)组全层皮肤缺损兔伤后各时间点创面愈合情况。3A、3B、3C.分别为伤后0(即刻)、14、30 d创面愈合情况,每张图中左侧标记A的为外泌体组,右侧标记B的为PBS组,外泌体组创面伤后14、30 d均较PBS组愈合快

    4  外泌体组和磷酸盐缓冲液(PBS)组全层皮肤缺损兔伤后14 d血管新生和胶原纤维增生情况。4A、4B.分别为外泌体组和PBS组血管新生情况 苏木精-伊红×200,图4A新生血管较图4B多;4C、4D.分别为外泌体组和PBS组胶原纤维增生情况 Masson×200,图4C胶原纤维增生较图4D多

    5  从糖尿病足溃疡患者创面周围组织提取的血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)培养24 h成功摄取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)外泌体 PKH67-鬼笔环肽-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×200。5A、5B.分别为VEC及HSF胞质染色(红色)、胞核染色(蓝色)、外泌体染色(绿色)合并图,2种细胞均成功摄取外泌体

    6  划痕试验观察2组人皮肤成纤维细胞(HSF)和血管内皮细胞(VEC)培养各时间点划痕情况 光学显微镜×200。6A、6B.分别为磷酸盐缓冲液(PBS)组和外泌体组HSF培养0 h(即刻);6C、6D.分别为PBS组和外泌体VEC培养0 h;6E、6F和6G、6H.分别为PBS组、外泌体组HSF和VEC培养48 h,外泌体组2种细胞培养48 h剩余划痕面积均小于PBS组

    7  Transwell实验观察2组血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)培养24 h的迁移情况 结晶紫×200。7A.磷酸盐缓冲液(PBS)组VEC;7B.外泌体组VEC,迁移数明显多于图7A;7C.PBS组HSF;7D.外泌体组HSF,穿膜数明显多于图7C

    8  2组血管内皮细胞培养12 h血管分支点数和成管长度。8A、8B.分别为磷酸盐缓冲液(PBS)组和外泌体组血管生成情况,图8B新生血管数明显多于图8A 光学显微镜×400;8C、8D.分别为2组血管分支点数和成管长度比较(样本数为3,x¯±s

    注:与PBS组比较,aP<0.01

    9  2组人皮肤成纤维细胞(HSF)和血管内皮细胞(VEC)培养12 h的核转录因子红系2相关因子2 (NRF2) 和转录激活因子3 (ATF3) mRNA表达比较(样本数为3,x¯±s)。9A.HSF;9B.VEC

    注:与磷酸盐缓冲液(PBS)组比较,aP<0.01,bP<0.05

    10  划痕试验观察5组人皮肤成纤维细胞(HSF)和血管内皮细胞(VEC)划痕后各时间点迁移情况 光学显微镜×200。10A、10B、10C、10D、10E及10F、10G、10H、10I、10J.分别为磷酸盐缓冲液(PBS)组、外泌体组、核转录因子红系2相关因子2 (NRF2) 干扰组、转录激活因子3 (ATF3) 干扰组、空载干扰组HSF划痕后0(即刻)、48 h;10K、10L、10M、10N、10O及10P、10Q、10R、10S、10T.分别为PBS组、外泌体组、NRF2干扰组、ATF3干扰组、空载干扰组VEC划痕后0、48 h

    11  Transwell实验观察5组血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)培养24 h的迁移情况 结晶紫×200。11A、11B、11C、11D、11E.分别为磷酸盐缓冲液(PBS)组、外泌体组、核转录因子红系2相关因子2 (NRF2) 干扰组、转录激活因子3 (ATF3) 干扰组、空载干扰组VEC,图11C迁移数少于图11A和11B,图11D迁移数多于图11A、少于11B;11F、11G、11H、11I、11J.分别为PBS组、外泌体组、NRF2干扰组、ATF3干扰组、空载干扰组HSF,图11H迁移数少于图11F和11G,图11I迁移数多于图11F、少于图11G

    12  5组VEC和HSF培养24 h的迁移数比较(样本数为3,x¯±s)。12A.人皮肤成纤维细胞;12B.血管内皮细胞

    注:横坐标下1、2、3、4、5分别代表磷酸盐缓冲液(PBS)组、外泌体组、核转录因子红系2相关因子2(NRF2)干扰组、转录激活因子3(ATF3)干扰组、空载干扰组;5组血管内皮细胞(VEC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)总体比较,差异均明显(F值分别为11.43、21.10,P值分别为0.008、<0.001);与PBS组比较,aP<0.01,cP<0.05;与外泌体组比较,bP<0.01,dP<0.05

    13  5组血管内皮细胞培养12 h血管分支点数和成管长度 光学显微镜×400。13A、13B、13C、13D、13E.分别为磷酸盐缓冲液组、外泌体组、核因子红细胞系2相关因子2干扰组、转录激活因子干扰组、空载干扰组,图13C成管长度和分支点数均较图13A、13B减少,图13D成管长度和分支点数均较图13A增加,较图13B减少

    14  5组血管内皮细胞血管长度及分支数目比较(样本数为3,x¯±s)。14A、14B.分别为分支点数、成管长度

    注:横坐标下1、2、3、4、5分别代表磷酸盐缓冲液(PBS)组、外泌体组、核转录因子红系2相关因子2干扰组、转录激活因子3 干扰组、空载干扰组;5组血管分支点数和成管长度总体比较差异均明显(F值分别为7.51、9.12,P值分别为0.011、0.005);与PBS组比较,aP<0.01,与外泌体组比较,bP<0.01

    表1  2组VEC和HSF划痕后各时间点迁移率比较(%,x¯±s

    组别样本数HSFVEC
    24 h48 h24 h48 h
    外泌体组342.1±1.3a72.2±0.9b48.2±1.6b87.1±2.3b
    PBS组326.1±1.344.2±1.030.1±1.663.2±1.5
    注:人皮肤成纤维细胞(HSF)时间因素主效应,F=33.20,P=0.020;处理因素主效应,F=134.80,P=0.012;两者交互作用,F=95.10,P=0.021;血管内皮细胞(VEC)时间因素主效应,F=37.10,P=0.010;处理因素主效应,F=191.70,P=0.007;两者交互作用,F=45.10,P=0.009;与磷酸盐缓冲液(PBS)组比较,aP<0.05,bP<0.01
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    表2  5组血管内皮细胞和人皮肤成纤维细胞培养4 d增殖活力比较(x¯±s

    组别样本数人皮肤成纤维细胞血管内皮细胞
    PBS组30.904±0.0051.047±0.046
    外泌体组31.205±0.0111.311±0.010
    NRF2干扰组30.813±0.006ab0.896±0.005ad
    ATF3干扰组31.003±0.005bc1.192±0.014ad
    空载干扰组30.915±0.0041.072±0.045
    F7.986.02
    P0.0140.004
    注:NRF2为核转录因子红系2相关因子2,ATF3为转录激活因子3;与磷酸盐缓冲液(PBS)组比较,aP<0.05,cP<0.01;与外泌体组比较,bP<0.01,dP<0.05
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    表3  5组血管内皮细胞和人皮肤成纤维细胞划痕后各时间点迁移率比较(%,x¯±s

    组别样本数人皮肤成纤维细胞血管内皮细胞
    24 h48 h24 h48 h
    PBS组325.2±0.941.2±1.031.2±2.061.2±1.0
    外泌体组340.8±1.169.2±0.749.8±1.086.0±2.0
    NRF2干扰组321.0±0.8ab37.0±1.2bd26.0±0.9ab54.0±1.2bd
    ATF3干扰组333.0±0.7ac56.0±1.2cd38.0±0.7ab71.0±1.3bd
    空载干扰组325.0±0.740.0±1.130.0±1.060.0±1.0
    注:NRF2为核转录因子红系2相关因子2,ATF3为转录激活因子3;人皮肤成纤维细胞时间因素主效应,F=33.20,P=0.022,处理因素主效应,F=104.60,P=0.003,两者交互作用,F=125.10,P=0.019;血管内皮细胞时间因素主效应,F=19.10,P=0.036,处理因素主效应,F=221.10,P=0.005,两者交互作用,F=45.10,P=0.009;与磷酸盐缓冲液(PBS)组比较,aP<0.05,dP<0.01;与外泌体组比较,bP<0.01,cP<0.05
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  • 收稿日期:  2022-06-22

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