Effects of interleukin-4-modified gold nanozymes on the full-thickness skin defects in diabetic mice
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摘要:
目的 探讨白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒（IL-4-AuNP）对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的作用及其机制。 方法 采用实验研究方法。改进文献中的方法合成金纳米酶颗粒（AuNP）及IL-4-AuNP，采用透射电子显微镜拍摄2种颗粒形貌并计算其粒径，采用纳米粒度电位仪和粒度分析仪分别检测2种颗粒的表面电位和水合粒径。采用过氧化氢检测试剂盒和超氧阴离子检测试剂盒检测IL-4-AuNP的过氧化氢清除率和超氧阴离子清除率。取小鼠成纤维细胞系3T3细胞，采用随机数字表法（下同）将其分为空白对照组、仅使用过氧化氢处理的单纯过氧化氢组、先使用IL-4-AuNP处理0.5 h再使用过氧化氢处理的过氧化氢+IL-4-AuNP组，培养24 h后，采用免疫荧光法检测细胞活性氧水平，采用细胞计数试剂盒8检测细胞相对存活率。取Raw264.7小鼠巨噬细胞，将其分为空白对照组和用IL-4-AuNP处理的IL-4-AuNP组，培养24 h后，采用免疫荧光法观测细胞中精氨酸酶1（Arg-1）的表达。取12只8~10周龄雄性BALB/c小鼠（小鼠周龄、性别、品系下同），分为IL-4-AuNP组和空白对照组，分别作相应处理。在分组处理第16天，采集小鼠全血分析全血中白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白水平与血小板计数和天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、尿素与肌酐水平；采用苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠心、肝、脾、肺和肾组织的炎症、出血或坏死情况。另取36只鼠，制作糖尿病模型后，在其背部制作全层皮肤缺损创面，将创面分为空白对照组、单纯AuNP组和IL-4-AuNP组，每组12只鼠，分别进行相应处理。于分组处理第0（即刻）、4、9、15天，观察创面情况并计算创面面积。分组处理第9天，采用HE染色检测创面中新生上皮长度和肉芽组织厚度。分组处理第15天，采用免疫荧光法检测创面组织中活性氧水平及Arg-1阳性细胞数。样本数均为6。对数据行独立样本t检验、校正t检验、Tukey检验或Dunnett T3检验。 结果 AuNP及IL-4-AuNP大小均匀，其粒径、表面电位、水合粒径分别为（13.0±2.1）、（13.9±2.5）nm及（-45.8±3.2）、（-20.3±2.2）mV与（14±3）、（16±4）nm。IL-4-AuNP的过氧化氢清除率和超氧阴离子清除率分别为（69±4）%和（52±5）%。分组培养24 h后，单纯过氧化氢组3T3细胞活性氧水平明显高于空白对照组（q=26.12，P<0.05）；过氧化氢+IL-4-AuNP组细胞活性氧水平明显低于单纯过氧化氢组（q=25.12，P<0.05），而与空白对照组接近（P>0.05）。分组培养24 h后，过氧化氢+IL-4-AuNP组3T3细胞相对存活率明显高于单纯过氧化氢组（t=51.44，P<0.05）。分组培养24 h后，IL-4-AuNP组Raw264.7细胞Arg-1的表达明显高于空白对照组（t'=8.83，P<0.05）。分组处理第16天，空白对照组和IL-4-AuNP组小鼠的WBC、RBC、血红蛋白水平与血小板计数和AST、ALT、尿素与肌酐水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）；IL-4-AuNP组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器中均未观察到明显的炎症、出血或坏死，与空白对照组相比，无明显变化。分组处理第0、4天，空白对照组、单纯AuNP组和IL-4-AuNP组糖尿病小鼠创面面积比较差异均无统计学意义（P>0.05）。分组处理第9天，单纯AuNP组和IL-4-AuNP组创面面积均明显小于空白对照组（q值分别为9.45、14.87，P<0.05），IL-4-AuNP组创面面积显著小于单纯AuNP组（q=5.42，P<0.05）。分组处理第15天，单纯AuNP组和IL-4-AuNP组创面面积均明显小于空白对照组（q值分别为4.84、20.64，P<0.05），IL-4-AuNP组创面面积显著小于单纯AuNP组（q=15.80，P<0.05）；且IL-4-AuNP组创面部位红、肿等炎症反应较其他2组明显减轻。分组处理第9天，相比于空白对照组和单纯AuNP组，IL-4-AuNP组糖尿病小鼠创面中新生上皮长度明显更长（P值均<0.05），创面中的肉芽组织厚度显著增厚（q值分别为11.33、9.65，P值均<0.05）。分组处理第15天，相比于空白对照组，单纯AuNP组和IL-4-AuNP组糖尿病小鼠创面组织的活性氧水平均明显降低（P<0.05）。分组处理第15天，IL-4-AuNP组糖尿病小鼠创面中Arg-1阳性的细胞数显著多于空白对照组和单纯AuNP组（P值均<0.05）。 结论 IL-4-AuNP在体使用安全，可以通过清除活性氧改善氧化微环境和诱导巨噬细胞向M2表型极化，促进糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面高效愈合与修复再生。 Abstract:Objective To investigate the effects and mechanism of interleukin-4-modified gold nanoparticle (IL-4-AuNP) on the wound healing of full-thickness skin defects in diabetic mice. Methods Experimental research methods were adopted. Gold nanoparticle (AuNP) and IL-4-AuNP were synthesized by improving the methods described in published literature. The morphology of those two particles were photographed by transmission electron microscopy, and their particle sizes were calculated. The surface potential and hydration particle size of the two particles were detected by nanoparticle potentiometer and particle size analyzer, respectively. The clearance rate of IL-4-AuNP to hydrogen peroxide and superoxide anion was measured by hydrogen peroxide and superoxide anion kits, respectively. Mouse fibroblast line 3T3 cells were used and divided into the following groups by the random number table (the same below): blank control group, hydrogen peroxide alone group treated with hydrogen peroxide only, hydrogen peroxide+IL-4-AuNP group treated with IL-4-AuNP for 0.5 h and then treated with hydrogen peroxide. After 24 h of culture, the reactive oxygen species (ROS) levels of cells were detected by immunofluorescence method; cell count kit 8 was used to detect relative cell survival rate. The macrophage Raw264.7 mouse cells were then used and divided into blank control group and IL-4-AuNP group that treated with IL-4-AuNP. After 24 h of culture, the expression of arginase 1 (Arg-1) in cells was observed by immunofluorescence method. Twelve male BALB/c mice (mouse age, sex, and strain, the same below) aged 8 to 10 weeks were divided into IL-4-AuNP group and blank control group, treated accordingly. On the 16th day of treatment, whole blood samples were collected from mice for analysis of white blood cell count (WBC), red blood cell count (RBC), hemoglobin level, or platelet count and the level of aspartate aminotransferase (AST), alanine transaminase (ALT), urea, or creatinine. The inflammation, bleeding, or necrosis in the heart, liver, spleen, lung, and kidney tissue of mice were detected by hematoxylin-eosin (HE). Another 36 mice were selected to make diabetic model, and the full-thickness skin defect wounds were made on the back of these mice. The wounds were divided into blank control group, AuNP alone group, and IL-4-AuNP group, with 12 mice in each group, and treated accordingly. On the 0 (immediately), 4th, 9th, and 15th day of treatment, the wound condition was observed and the wound area was calculated. On the 9th day of treatment, HE staining was used to detect the length of neonatal epithelium and the thickness of granulation tissue in the wound. On the 15th day of treatment, immunofluorescence method was used to detect ROS level and the number of Arg-1 positive cells in the wound tissue. The number of samples was 6 in all cases. Data were statistically analyzed with independent sample t test, corrected t test, Tukey test, or Dunnett T3 test. Results The size of prepared AuNP and IL-4-AuNP were uniform. The particle size, surface potential, and hydration particle size of AuNP and IL-4-AuNP were (13.0±2.1) and (13.9±2.5) nm, (-45.8±3.2) and (-20.3±2.2) mV, (14±3) and (16±4) nm, respectively. For IL-4-AuNP, the clearance rate to hydrogen peroxide and superoxide anion were (69±4)% and (52±5)%, respectively. After 24 h of culture, the ROS level of 3T3 in hydrogen peroxide alone group was significantly higher than that in blank control group (q=26.12, P<0.05); the ROS level of hydrogen peroxide+IL-4-AuNP group was significantly lower than that in hydrogen peroxide alone group (q=25.12, P<0.05) and close to that in blank control group (P>0.05). After 24 h of culture, the relative survival rate of 3T3 cells in hydrogen peroxide+IL-4-AuNP group was significantly higher than that in hydrogen peroxide alone group (t=51.44, P<0.05). After 24 h of culture, Arg-1 expression of Raw264.7 cells in IL-4-AuNP group was significantly higher than that in blank control group (t'=8.83, P<0.05).On the 16th day of treatment, there were no significant statistically differences in WBC, RBC, hemoglobin level, or platelet count and the level of AST, ALT, urea, or creatinine of mice between blank control group and IL-4-AuNP group (P>0.05). No obvious inflammation, bleeding or necrosis was observed in the heart, liver, spleen, lung, and kidney of important organs in IL-4-AuNP group, and no significant changes were observed compared with blank control group. On the 0 and 4th day of treatment, the wound area of diabetic mice in blank control group, AuNP alone group, and IL-4-AuNP group had no significant difference (P>0.05). On the 9th day of treatment, the wound areas both in AuNP alone group and IL-4-AuNP group were significantly smaller than that in blank control group (with q values of 9.45 and 14.87, respectively, P<0.05), the wound area in IL-4-AuNP group was significantly smaller than that in AuNP alone group (q=5.42, P<0.05). On the 15th day of treatment, the wound areas both in AuNP alone group and IL-4-AuNP group were significantly smaller than that in blank control group (with q values of 4.84 and 20.64, respectively, P<0.05), the wound area in IL-4-AuNP group was significantly smaller than that in AuNP alone group (q=15.80, P<0.05); moreover, inflammations such as redness and swelling were significantly reduced in IL-4-AuNP group compared with the other two groups. On the 9th day of treatment, compared with blank control group and AuNP alone group, the length of neonatal epithelium in the wound of diabetic mice in IL-4-AuNP group was significantly longer (all P<0.05), and the thickness of the granulation tissue in the wound was significantly increased (with q values of 11.33 and 9.65, respectively, all P<0.05). On the 15th day of treatment, compared with blank control group, ROS levels in wound tissue of diabetic mice in AuNP alone group and IL-4-AuNP group were significantly decreased (P<0.05). On the 15th day of treatment, the number of Arg-1 positive cells in the wounds of diabetic mice in IL-4-AuNP group was significantly more than that in blank control group and AuNP alone group, respectively (all P<0.05). Conclusions IL-4-AuNP is safe in vivo, and can improve the oxidative microenvironment by removing ROS and induce macrophage polarization towards M2 phenotype, thus promote efficient diabetic wound healing and regeneration of full-thickness skin defects in diabetic mice. -
Key words:
- Diabetes mellitus, experimental /
- Interleukin-4 /
- Reactive oxygen species /
- Macrophages /
- Skin /
- Gold nanozymes /
- Wound repair
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(1)表明氧化应激参与了高压电烧伤大鼠伤后肾脏损伤的病理过程,且肾脏损伤呈进行性加重,为高压电烧伤后肾脏损伤的机制研究提供了新思路。
(2)表明灯盏花素可以减轻高压电烧伤大鼠伤后肾脏氧化应激损伤,为高压电烧伤后肾脏损伤的临床治疗提供了依据。
Highlights:
(1)It showed that oxidative stress was involved in the pathological process of kidney injuries in rats after high-voltage electric burns, and the kidney injury was progressively aggravated, which provided a new idea for studying the mechanism of kidney injury after high-voltage electric burns.
(2)It showed that breviscapine could alleviate renal oxidative stress injuries in rats with high-voltage electric burns, which provided the basis for the clinical treatment of kidney injuries after high-voltage electric burns.
电力技术的不断进步,促使电力在工业生产、家庭生活以及其他社会各类活动中得到广泛应用,因此电烧伤的发病率呈上升趋势。尽管电烧伤患者只占所有烧伤患者的9.1%[1],但相较于热力烧伤其损害程度更重。多项研究表明,相较于低压电烧伤,高压电烧伤通常会对组织造成更深层次、更广泛的损害,并更容易导致脏器损伤[2, 3, 4, 5]。近年来的研究显示,高压电烧伤可导致渐进性微循环障碍及血管、肌肉的进行性损伤[6, 7, 8]。本课题组先前的研究证实,高压电烧伤后过度的氧化应激反应会造成心、肝、脑损伤[9, 10, 11]。肾脏作为对缺血缺氧敏感的重要脏器[12],易受高压电烧伤的影响并发生损伤,但目前相关研究较少。灯盏花素是一种从灯盏花中提取的黄酮类有效成分,具有抗氧化、抗炎以及改善循环等作用[13]。本研究旨在探讨高压电烧伤后大鼠肾脏氧化应激损伤的特点,并观测灯盏花素对高压电烧伤大鼠肾损伤的干预效果。
1. 材料与方法
本实验研究经河北医科大学第三医院动物实验伦理委员会审批通过,遵循河北医科大学第三医院和国家有关实验动物管理和使用的相关规定。
1.1 动物和主要试剂及仪器来源
160只健康清洁级8~10周龄、体重270~320 g雄性SD大鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号：SCXK（冀）2019-0008。肌酐测定试剂盒、尿素氮测试盒、过氧化氢酶（catalase,CAT）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所,大鼠晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein product,AOPP）ELISA试剂盒、大鼠Klotho ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司,灯盏花素注射液（每5毫升注射液中含20 mg灯盏花素）购自运城市石药银湖制药有限公司。TC-30-20KVA型调压器和YDJ-10KVA型实验变压器购自武汉市得福电气有限公司,PG270A型数字钳型电流表购自杭州申华电工仪表有限公司,M200PRO型酶标仪购自瑞士TECAN集团公司,CenLee4K型低速离心机购自湖南湘立科学仪器有限公司,KZ-III-F低温型研磨仪购自武汉赛维尔生物科技有限公司,HLD-5003型电子天平购自杭州友恒称重设备有限公司,BX43型光学显微镜购自日本OLYMPUS株式会社。
1.2 动物分组与处理
将160只大鼠按随机数字表法分为假伤组、电烧伤组、盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组,其中假伤组、电烧伤组各60只大鼠,余4组各10只大鼠。将假伤组和电烧伤组大鼠按伤后0 h（即刻）、8 h、24 h、48 h、72 h和1周6个时间点,分为每个时间点10只。
按照本课题组的高压电烧伤大鼠模型制作方法[8, 9],将6组大鼠经腹腔按10 mg/kg剂量注射30 g/L戊巴比妥钠溶液麻醉后剃除左前肢及右后肢毛发,仰卧位固定于绝缘动物实验台上,连接调压器及实验变压器,大鼠左前肢连接电流入口电极板,右后肢连接电流出口电极板。除假伤组大鼠不通电致假伤外,余5组大鼠均接受输出电压3 kV、电流强度（1.92±0.24）A持续通电3 s,造成电流入口和出口处各1 cm×1 cm的高压电烧伤创面,深达肌肉、筋膜。伤后立即对6组大鼠经腹腔按5 mL/kg剂量注射生理盐水行液体复苏1次,对盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠分别另经腹腔按5 mL/kg剂量注射生理盐水及0.4、1.6、4.0 g/L灯盏花素,每24小时1次,至伤后72 h。模型制作成功后14只大鼠死亡,包括伤后24 h、48 h、72 h、1周电烧伤组各1、2、2、1只,伤后72 h盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组各4、1、2、1只。将各个时间点各组存活大鼠分别行下腔静脉采血2 mL后处死。
1.3 指标检测
1.3.1 肾/体比
将大鼠处死前称体重,处死后立即取下双侧肾脏组织,去除周围脂肪及包膜,纱布吸干表面液体后,迅速放于电子天平上称重,并计算肾/体比,肾/体比=肾脏质量÷体重×100%。
1.3.2 肾脏组织病理学变化和肾小管与肾间质损伤评分
取假伤组,伤后8 h、24 h、48 h、72 h和1周的电烧伤组,伤后72 h的盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组各4只大鼠的左肾上极组织,制备石蜡切片（厚5 μm）后行HE染色,于光学显微镜200倍放大倍数下观察肾脏组织病理学变化。
取每只大鼠1张切片,每张切片选2个视野,采用半定量病理评分系统[14, 15]行肾小管与肾间质损伤评分,评分标准：以出现肾小管上皮细胞肿胀、空泡样变性、坏死脱落和间质炎症细胞浸润、出血为肾小管与肾间质损伤。其中0分为无肾小管与肾间质损伤,1分为肾小管与肾间质损伤病变范围<25%,2分为肾小管与肾间质损伤病变范围为25%~50%,3分为肾小管与肾间质损伤病变范围>50%。评分取均值。
1.3.3 血清肌酐和尿素氮水平
取大鼠下腔静脉血2 mL,于离心半径13.5 cm、3 000 r/min离心10 min,分离得到血清样本。将血清样本平均分为2份,一份按照肌酐测定试剂盒说明书,通过肌氨酸氧化酶法检测血清肌酐水平；一份按照尿素氮测试盒说明书,通过脲酶法检测血清尿素氮水平。以上实验均重复2次,结果取均值。
1.3.4 肾组织上清液中CAT活力、AOPP水平及Klotho蛋白水平
取大鼠右肾皮质50 mg,按照组织重量与生理盐水体积比例为1∶9,采用研磨仪制备成组织匀浆,取组织匀浆上清液,按照CAT测定试剂盒说明书,通过钼酸铵法检测大鼠肾组织上清液中CAT活力。取大鼠右肾皮质100 mg,按照组织重量与生理盐水体积比例为1∶10,采用研磨仪制备成组织匀浆,将组织匀浆上清液平均分为2份,一份按照大鼠AOPP ELISA试剂盒说明书、一份按照大鼠Klotho ELISA试剂盒说明书,通过ELISA法分别检测大鼠肾组织上清液中AOPP水平、Klotho蛋白水平。以上实验均重复2次,结果取均值。
1.4 统计学处理
采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料数据用
2. 结果
2.1 肾/体比
伤后8 h、48 h、72 h、1周,电烧伤组大鼠肾/体比均明显高于假伤组（t值分别为-0.52、-3.75、-4.05、-2.25,P值分别为<0.001、0.002、0.001、0.038）；电烧伤组大鼠肾/体比组内各时间点比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。
Table 1. 2组大鼠伤后各时间点肾/体比比较（%,组别 0 h 8 h 24 h 48 h 72 h 1周 假伤组 0.79±0.07 0.76±0.03 0.79±0.04 0.78±0.04 0.81±0.04 0.82±0.10 电烧伤组 0.84±0.08 0.87±0.06a 0.83±0.06 0.87±0.05a 0.93±0.08a 0.95±0.14a 注：假伤组大鼠不通电致假伤,各时间点样本数均为10；电烧伤组大鼠致高压电烧伤,伤后0 h（即刻）、8 h、24 h、48 h、72 h和1周样本数分别为10、10、9、8、8、9；处理因素主效应,F=43.43,P<0.001；时间因素主效应,F=3.88,P=0.003；两者交互作用,F=1.09,P=0.370；与假伤组比较,aP<0.05 伤后72 h,电烧伤组、盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠肾/体比分别为（0.93±0.08）%、（0.92±0.07）%、（0.90±0.05）%、（0.88±0.05）%、（0.81±0.05）%,组间总体比较,差异有统计学意义（F=5.52,P=0.001）。与电烧伤组、盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组比较,高灯盏花素组大鼠肾/体比明显降低（P值分别为<0.001、0.001、0.002、0.013）；与电烧伤组、盐水组比较,低灯盏花素组（P值分别为0.383、0.144）、中灯盏花素组（P值分别为0.617、0.287）大鼠肾/体比无明显变化；低灯盏花素组与中灯盏花素组、电烧伤组与盐水组大鼠肾/体比比较,差异均无统计学意义（P值分别为0.517、0.764）。
2.2 肾脏组织病理学变化和肾小管与肾间质损伤评分
与假伤组比较,电烧伤组大鼠伤后8 h~1周肾小球出现系膜基质增多、毛细血管充血和系膜细胞增生,肾小管出现上皮细胞肿胀、空泡样变性和坏死脱落,肾间质出现炎症细胞浸润和出血,且损伤程度随时间延长而加重。伤后72 h,与电烧伤组和盐水组比较,低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠上述肾组织损伤程度减轻,其中高灯盏花素组大鼠肾组织损伤减轻最为明显。见图1。
图 1 6组大鼠伤后各时间点肾脏组织病理学变化 苏木精-伊红×200。1A.假伤组大鼠肾小管上皮细胞排列整齐、大小一致、染色均匀、界限清楚,未见水肿征象,肾间质中未见炎症细胞浸润；1B、1C、1D、1E、1F.分别为电烧伤组伤后8 h、24 h、48 h、72 h、1周情况,相较于图1A,图1B~1F出现不同程度肾小球系膜细胞增生和基质增多、肾小管上皮细胞坏死脱落、肾间质炎症细胞浸润；1G、1H、1I、1J.分别为盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组伤后72 h情况,相较于图1E、1G,图1H~1J肾小球系膜细胞增生和基质增多、肾小管上皮细胞坏死脱落、肾间质炎症细胞浸润程度减轻注：假伤组大鼠仅不通电致假伤,电烧伤组、盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠均致高压电烧伤,其中电烧伤组大鼠不进行药物干预,盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠分别经腹腔注射生理盐水或低、中、高浓度灯盏花素电烧伤组伤后8 h、24 h、48 h、72 h和1周及假伤组大鼠肾小管与肾间质损伤评分依次为1.0（0,1.0）、1.0（0,1.0）、1.0（1.0,2.0）、1.5（1.0,2.0）、2.0（1.0,2.0）、0（0,1.0）分,组间总体比较,差异有统计学意义（H=13.03,P=0.023）。与假伤组比较,电烧伤组大鼠伤后48 h、72 h、1周肾小管与肾间质损伤评分均明显升高（P值分别为0.044、0.011、0.032）,伤后8、24 h肾小管与肾间质损伤评分无明显变化（P值均为0.320）；与电烧伤组伤后8 h比较,电烧伤组大鼠伤后1周肾小管与肾间质损伤评分明显升高（P=0.038）,伤后24、48、72 h肾小管与肾间质损伤评分无明显变化（P值分别为>0.999、0.306、0.122）；与电烧伤组伤后24 h比较,电烧伤组大鼠伤后1周肾小管与肾间质损伤评分明显升高（P=0.038）,伤后48、72 h肾小管与肾间质损伤评分无明显变化（P值分别为0.306、0.122）；与电烧伤组伤后48 h比较,电烧伤组大鼠伤后72 h、1周肾小管与肾间质损伤评分无明显变化（P值分别为0.599、0.293）；与电烧伤组伤后72 h比较,电烧伤组大鼠伤后1周肾小管与肾间质损伤评分无明显变化（P=0.599）。
伤后72 h,电烧伤组、盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠肾小管与肾间质损伤评分依次为2.0（1.0,2.0）、1.5（1.0,2.0）、1.0（1.0,2.0）、1.0（1.0,2.0）、1.0（0,1.0）分,组间总体比较,差异无统计学意义（H=3.83,P=0.281）。
2.3 血清肌酐和尿素氮水平
伤后8 h、24 h、48 h、72 h、1周,电烧伤组大鼠血清肌酐和尿素氮水平均明显高于假伤组（Z值分别为-2.00、-2.37、-2.62、-2.67、-3.67和-2.34、-3.11、-3.43、-3.11、-3.51,P值分别为0.045、0.018、0.009、0.008、<0.001和0.019、0.001、0.001、0.001、<0.001）。与电烧伤组伤后0 h比较,电烧伤组大鼠伤后72 h、1周血清肌酐水平均明显升高（P<0.05）；与电烧伤组伤后8 h比较,电烧伤组大鼠伤后72 h、1周血清肌酐水平均明显升高（P<0.05）；与电烧伤组伤后24 h比较,电烧伤组大鼠伤后1周血清肌酐水平明显升高（P<0.05）。电烧伤组大鼠组内各时间点血清尿素氮水平比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。
Table 2. 2组大鼠伤后各时间点血清肌酐和尿素氮水平比较[M（min,max）]组别与指标 0 h 8 h 24 h 48 h 72 h 1周 假伤组 肌酐（μmol/L） 46（35,64） 45（33,63） 45（31,63） 51（31,66） 46（30,64） 47（30,59） 尿素氮（mmol/L） 9.0（6.4,11.4） 8.6（5.0,10.5） 7.9（5.2,11.4） 8.7（7.0,11.4） 8.1（6.4,12.6） 8.2（4.1,12.6） 电烧伤组 肌酐（μmol/L） 55（37,79） 55（45,80）a 59（54,88）a 66（57,89）a 78（7,95）abc 74（62,102）abcd 尿素氮（mmol/L） 10.1（6.7,30.5） 13.7（6.8,20.4）a 12.6（9.3,44.4）a 16.3（10.9,30.9）a 13.9（8.9,45.6）a 18.8（11.2,37.4）a 注：假伤组大鼠不通电致假伤,各时间点样本数均为10；电烧伤组大鼠致高压电烧伤,伤后0 h（即刻）、8 h、24 h、48 h、72 h和1周样本数分别为10、10、9、8、8、9；与假伤组比较,aP<0.05；与电烧伤组伤后0 h比较,bP<0.05；与电烧伤组伤后8 h比较,cP<0.05；与电烧伤组伤后24 h比较,dP<0.05 伤后72 h,5组电烧伤大鼠血清肌酐水平组间总体比较,差异无统计学意义（P>0.05）；与电烧伤组比较,低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠血清尿素氮水平均明显降低（P<0.05）；与盐水组比较,中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠血清尿素氮水平均明显降低（P<0.05）。见表3。
Table 3. 5组电烧伤大鼠伤后72 h血清肌酐和尿素氮水平比较[M（min,max）]组别 样本数 肌酐（μmol/L） 尿素氮（mmol/L） 电烧伤组 8 78（7,95） 13.9（8.9,45.6） 盐水组 6 80（18,91） 12.5（8.9,30.5） 低灯盏花素组 9 74（6,92） 10.5（7.0,11.9）a 中灯盏花素组 8 61（50,95） 8.6（7.3,16.9）ab 高灯盏花素组 9 57（43,89） 8.7（7.5,13.0）ab H值 8.97 15.37 P值 0.062 0.004 注：5组大鼠均致高压电烧伤,其中电烧伤组大鼠不进行药物干预,盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠分别经腹腔注射生理盐水或低、中、高浓度灯盏花素；H值、P值为组间各指标总体比较所得；与电烧伤组比较,aP<0.05；与盐水组比较,bP<0.05 2.4 肾组织上清液中CAT活力、AOPP水平及Klotho蛋白水平
伤后48 h、72 h、1周,电烧伤组大鼠肾组织上清液中CAT活力均明显低于假伤组（Z值分别为-2.22、-2.13、-3.51,P值分别为0.026、0.034、<0.001）；伤后8 h、24 h、48 h、72 h、1周,电烧伤组大鼠肾组织上清液中AOPP水平均明显高于假伤组（Z值分别为-2.00、-3.15、-2.71、-2.04、-2.33,P值分别为0.045、0.002、0.007、0.041、0.020）；伤后0 h~1周,假伤组与电烧伤组大鼠肾组织上清液中Klotho蛋白水平比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。与电烧伤组伤后0 h比较,电烧伤组大鼠伤后72 h和1周肾组织上清液中CAT活力及伤后48 h、72 h、1周肾组织上清液中Klotho蛋白水平均明显降低（P<0.05）；与电烧伤组伤后8 h比较,电烧伤组大鼠伤后72 h和1周肾组织上清液中CAT活力及伤后48 h、72 h、1周肾组织上清液中Klotho蛋白水平均明显降低（P<0.05）；与电烧伤组伤后24 h比较,电烧伤组大鼠伤后72 h和1周肾组织上清液中CAT活力均明显降低（P<0.05）；与电烧伤组伤后48 h比较,电烧伤组大鼠伤后1周肾组织上清液中CAT活力明显降低（P<0.05）。电烧伤组大鼠组内各时间点肾组织上清液中AOPP水平比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。见表4。
Table 4. 2组大鼠伤后各时间点肾组织上清液中CAT活力、AOPP水平及Klotho蛋白水平比较[M（min,max）]组别与指标 0 h 8 h 24 h 48 h 72 h 1周 假伤组 CAT活力（U/mgprot） 36.2（17.9,109.1） 40.0（13.7,94.6） 37.5（3.6,124.4） 44.6（15.1,61.5） 38.5（3.6,140.2） 43.0（14.7,120.9） AOPP水平（μmol/L） 43.8（7.2,117.4） 44.4（16.3,92.4） 50.5（25.7,60.1） 47.2（38.3,74.4） 48.6（36.5,96.0） 46.3（8.9,92.4） Klotho蛋白水平（ng/mL） 1.8（0.3,3.5） 2.2（0.3,3.6） 1.4（0.1,5.5） 1.8（0.2,4.1） 1.8（0.3,5.4） 1.6（0,7.8） 电烧伤组 CAT活力（U/mgprot） 45.9（9.7,84.9） 47.2（17.3,89.6） 31.8（18.0,43.6） 27.3（11.7,35.0）a 14.6（12.6,23.6）abcd 9.0（3.9,21.9）abcde AOPP水平（μmol/L） 53.1（42.4,88.7） 72.7（38.5,127.3）a 64.9（52.7,116.3）a 71.3（46.8,97.6）a 76.0（32.6,88.7）a 75.2（55.9,92.5）a Klotho蛋白水平（ng/mL） 1.8（1.1,3.5） 2.3（1.5,2.8） 1.8（1.2,2.2） 1.2（0.6,1.8）bc 0.7（0.5,2.0）bc 0.7（0.2,2.7）bc 注：假伤组大鼠不通电致假伤,各时间点样本数均为10；电烧伤组大鼠致高压电烧伤,伤后0 h（即刻）、8 h、24 h、48 h、72 h和1周样本数分别为10、10、9、8、8、9；CAT为过氧化氢酶,AOPP为晚期氧化蛋白产物；与假伤组比较,aP<0.05；与电烧伤组伤后0 h比较,bP<0.05；与电烧伤组伤后8 h比较,cP<0.05；与电烧伤组伤后24 h比较,dP<0.05；与电烧伤组伤后48 h比较,eP<0.05 伤后72 h,5组电烧伤大鼠肾组织上清液中Klotho蛋白水平组间总体比较,差异无统计学意义（P>0.05）；与电烧伤组比较,低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠肾组织上清液中CAT活力均明显升高（P<0.05）,中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠肾组织上清液中AOPP水平均明显降低（P<0.05）；与盐水组比较,中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠肾组织上清液中CAT活力均明显升高（P<0.05）,AOPP水平均明显降低（P<0.05）；与低灯盏花素组比较,高灯盏花素组大鼠肾组织上清液中CAT活力明显升高（P<0.05）。见表5。
Table 5. 5组电烧伤大鼠伤后72 h肾组织上清液中CAT活力、AOPP水平及Klotho蛋白水平比较[M（min,max）]组别 样本数 CAT活力（U/mgprot） AOPP水平（μmol/L） Klotho蛋白水平（ng/mL） 电烧伤组 8 14.6（12.6,23.6） 76.0（32.6,88.7） 0.7（0.5,2.0） 盐水组 6 15.7（13.7,25.6） 75.7（47.0,82.9） 0.8（0.7,1.2） 低灯盏花素组 9 20.5（18.0,39.8）a 59.0（46.9,82.9） 0.7（0.5,1.2） 中灯盏花素组 8 24.9（14.7,28.9）ab 54.1（48.8,76.6）ab 0.7（0.2,0.9） 高灯盏花素组 9 28.0（21.9,39.1）abc 52.7（46.8,71.6）ab 0.7（0.2,0.9） H值 23.90 13.00 4.31 P值 <0.001 0.011 0.366 注：5组大鼠均致高压电烧伤,其中电烧伤组大鼠不进行药物干预,盐水组、低灯盏花素组、中灯盏花素组、高灯盏花素组大鼠分别经腹腔注射生理盐水或低、中、高浓度灯盏花素；CAT为过氧化氢酶,AOPP为晚期氧化蛋白产物；H值、P值为组间各指标总体比较所得；与电烧伤组比较,aP<0.05；与盐水组比较,bP<0.05；与低灯盏花素组比较,cP<0.05 3. 讨论
氧化应激是指机体受到有害刺激时,体内活性氧生成过度,导致机体内氧化系统和抗氧化防御系统之间的平衡失调,使平衡更偏向于氧化状态,从而引起机体组织或细胞功能的紊乱[16]。烧伤可通过凋亡[17]、炎症[18]、微循环障碍[19]、横纹肌溶解[20]、线粒体损伤[21]引起肾损伤,其中氧自由基与上述过程均有重要联系,因此推测氧化应激反应在高压电烧伤引起的肾损伤中发挥重要作用。
本研究首先对高压电烧伤大鼠肾脏结构及功能的损伤程度进行评估,观察到电烧伤组大鼠伤后8 h、48 h、72 h、1周肾/体比均明显高于假伤组；伤后8 h~1周肾小球、肾小管及肾间质较假伤组出现不同程度损伤,且损伤程度随时间延长而加重；伤后48 h、72 h、1周肾小管与肾间质损伤评分较假伤组明显升高。血清肌酐和尿素氮水平通常反映肾小球滤过功能[22]。本研究显示,与假伤组相比,电烧伤组大鼠伤后血清肌酐和尿素氮水平均呈现上升趋势；电烧伤组大鼠伤后1周血清肌酐水平较组内伤后0、8、24 h均明显升高,电烧伤组大鼠伤后72 h血清肌酐水平较组内伤后0、8 h升高,提示高压电烧伤后大鼠发生肾小球滤过功能障碍。
以上假伤组与电烧伤组各时间点的肾/体比、组织病理学变化、肾小管与肾间质损伤评分、血清肌酐和尿素氮水平结果共同说明,高压电烧伤后肾脏结构损伤与功能障碍程度随伤后时间的延长,呈进行性加重变化。
CAT是重要的抗氧化酶,可以保护细胞膜结构及功能[23],当发生氧化应激反应时,CAT活性可呈现先升高后降低或只降低的趋势[24, 25]。在本研究中,大鼠发生高压电烧伤后肾组织上清液中CAT活性开始下降,且随时间延长呈进行性下降,本课题组认为这是由于高压电烧伤后持续生成的自由基过多导致CAT无法清除,CAT活性逐渐降低。这一结果说明高压电烧伤后产生的氧化物质抑制抗氧化物质活性,导致机体处于氧化状态,从而引发过度氧化应激反应。
AOPP是血浆蛋白被体内活性氧攻击后形成的氧化修饰产物,被认为是烧伤引起的氧化应激反应中的新型氧化物质[26],其含量增多会诱导更多的活性氧产生,加重氧化应激,由此形成一个正反馈机制相互促进,故使机体呈现持续氧化应激状态[27]。研究显示,大鼠在接受电离辐射后会产生氧化应激反应,AOPP水平升高,同时造成脏器损伤[28]。上述结果与本研究结果一致,高压电烧伤后大鼠肾组织上清液中AOPP水平升高,证明大鼠高压电烧伤后其肾脏发生氧化应激反应,减少AOPP可以通过减轻氧化应激反应的途径保护肾脏。
Klotho主要来源于肾脏,在正常肾小管上皮细胞中高表达可发挥抗氧化作用[29]。当发生急性肾损伤时,Klotho蛋白水平降低,1周后可通过自身调节作用恢复至正常水平[30]。在本研究中,当大鼠发生高压电烧伤后肾组织上清液中Klotho蛋白水平随伤后时间的延长呈现逐渐降低趋势,考虑是由于高压电烧伤后肾小管上皮细胞随时间出现变性、坏死脱落等现象使Klotho蛋白无法正常表达；且Klotho蛋白作为抗氧化物质,也会因高压电烧伤后大鼠肾脏发生的氧化应激反应而表达降低。
研究表明,灯盏花素能够降低心脏和肾脏等重要脏器中的氧化物质水平,并提高抗氧化酶活性,从而在氧化应激反应中发挥抗氧化作用,保护脏器[31, 32]。目前采用灯盏花素治疗肾脏疾病的研究多集中在糖尿病肾病[33]和肾脏纤维化[34]方面,在烧伤方面主要是对角膜的治疗,关于肾脏的研究较少。一项关于灯盏花素毒性剂量的研究显示,对大鼠经尾静脉注射最大剂量（120 mg/kg）的灯盏花素,未导致其肾脏结构损伤；而对比格犬经尾静脉注射100 mg/kg剂量的灯盏花素,比格犬出现了肾脏结构损伤[35]。根据赵丽雅等[32]的研究,采用灌胃给药方案治疗庆大霉素所致的大鼠急性肾损伤时,灯盏花素的剂量包括6、12、24 mg/kg。考虑到腹腔注射吸收速度较灌胃更快,因此,本实验选择的经腹腔注射灯盏花素的剂量分别为2、8、20 mg/kg,这些剂量均为安全有效的治疗剂量。在本实验中,大鼠高压电烧伤后应用灯盏花素,其肾功能及肾组织病理损伤均得到有效改善,CAT活力略有恢复,AOPP水平降低,且高灯盏花素组大鼠此改变更为明显。这表明灯盏花素的抗氧化作用,可以对抗高压电烧伤引起的氧化应激反应。因此,早期应用灯盏花素有望减轻高压电烧伤引起的肾功能受损和肾组织病理损伤,同时改善预后并减少不良反应,具有积极的临床意义。
综上所述,结合高压电烧伤后大鼠肾功能损伤、肾组织病理结构改变、CAT活性降低及AOPP水平升高的情况,证明了高压电烧伤会通过氧化应激引起肾脏损伤。肾脏损伤程度、血清肌酐水平、肾组织CAT活性和Klotho蛋白水平与伤后时间密切相关,伤后48 h、72 h及1周时损伤往往较烧伤早期更为严重,这表明高压电烧伤导致的大鼠肾脏损伤随着时间的延长呈进行性加重。在此背景下,灯盏花素的应用有效改善了肾功能和肾组织病理损伤,因此,灯盏花素可以作为治疗高压电烧伤所致肾脏损伤的有效药物。但本研究中未针对肌红蛋白等其他因素对肾脏损伤造成的影响进行检测,需在今后的研究中进一步完善。
姚梦云：酝酿和设计实验，起草文章，实验研究，采集数据，分析、解释数据，获取研究经费；张宁、张庆、卢毅飞：实验研究，分析、解释数据，对文章的知识性内容作批评性审阅；黄勇、贺登峰、陈云霞：实验研究，采集数据；罗高兴：酝酿和设计实验，对文章的知识性内容作批评性审阅，获取研究经费，行政、技术或材料支持，指导性贡献所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 金纳米酶颗粒和白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒（IL-4-AuNP）形貌 透射电子显微镜×25 000。1A.金纳米酶颗粒大小均匀；1B.IL-4-AuNP大小均匀，其粒径略大于图1A
2 3组小鼠成纤维细胞系3T3细胞培养24 h后活性氧水平 2,7-二氯荧光素二乙酸酯×200。2A.空白对照组细胞活性氧水平低；2B.单纯过氧化氢组细胞活性氧水平较图2A明显升高；2C.过氧化氢+白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒组细胞活性氧水平较低，与图2A相当
注：绿色荧光反映细胞活性氧水平，且呈正相关
3 2组Raw264.7小鼠巨噬细胞培养24 h后精氨酸酶1的定位与表达 Alexa Fluor 594-4′,6-二脒基-2-苯基吲哚×600。3A、3B、3C.分别空白对照组细胞精氨酸酶1、细胞核及复合染色情况，图3A红色荧光弱；3D、3E、3F.分别为白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒组细胞精氨酸酶1、细胞核及复合染色情况，图3D红色荧光强度明显高于图3A
注：精氨酸酶1阳性染色为红色，细胞核阳性染色为蓝色
4 2组小鼠分组处理第16天主要脏器组织学分析 苏木精-伊红×200。4A、4B、4C、4D、4E.依次为空白对照组小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织切片染色情况，显示无明显炎症、出血或坏死；4F、4G、4H、4I、4J.依次为白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒组小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织切片染色情况，分别与图4A、4B、4C、4D、4E相似
5 3组糖尿病小鼠构建全层皮肤缺损创面模型后不同时间点愈合情况观察。5A、5B、5C、5D.依次为空白对照组小鼠分组处理第0（即刻）、4、9、15天的创面，周围长期有红肿渗液，愈合速度缓慢；5E、5F、5G、5H.依次为单纯金纳米酶颗粒组小鼠分组处理第0、4、9、15天的创面，其中图5G、5H创面面积分别较图5C、5D有所减小；5I、5J、5K、5L.依次为白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒组小鼠分组处理第0、4、9、15天的创面，其中图5K、5L红肿渗液减少，愈合速度均明显分别较图5G、5H加快
注：图中黑色卡片为参照圆片，直径为6 mm
6 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损分组处理第9天创面组织新生上皮长度和肉芽组织厚度 苏木精-伊红×40。6A.空白对照组创面中新生上皮长度短，肉芽组织的厚度薄；6B.单纯金纳米酶颗粒组创面中新生上皮较长，肉芽组织较厚；6C.白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒组创面中新生上皮长度较图6A、6B显著增加，肉芽组织厚度较图6A、6B明显增厚
注：图中黑色双向箭头长度指示新生上皮长度，绿色双向箭头长度指示肉芽组织厚度
7 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损分组处理第15天创面组织中活性氧水平 二氢乙锭-4′,6-二脒基-2-苯基吲哚×400。7A、7B、7C.分别为空白对照组创面组织中活性氧、细胞核及复合染色情况，图7A红色荧光强度高；7D、7E、7F.分别为单纯金纳米酶颗粒组创面组织中活性氧、细胞核及复合染色情况，图7D红色荧光强度明显低于图7A；7G、7H、7I.分别为白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒组创面中活性氧、细胞核及复合染色情况，图7G红色荧光强度较图7A弱
注：二氢乙锭荧光探针阳性染色为红色，反映活性氧水平，且呈正相关；细胞核阳性染色为蓝色
8 3组糖尿病小鼠全层皮肤缺损分组处理第15天创面组织中精氨酸酶1表达情况 Alexa Fluor 594-4′,6-二脒基-2-苯基吲哚×200。8A、8B、8C.分别为空白对照组、单纯金纳米酶颗粒组、白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒组创面，图8C红色荧光细胞数明显较图8A、8B增多
注：精氨酸酶1阳性染色为红色，细胞核阳性染色为蓝色
表1 空白对照组和IL-4-AuNP组小鼠分组处理第16天血常规及血生化主要指标比较（
组别 鼠数（只） WBC（×109/L） RBC（×1012/L） 血红蛋白水平（×102 g/L） PLT（×1011/L） ALT（U/L） AST（U/L） 尿素（mmol/L） 肌酐（μmol/L） 空白对照组 6 8.6±1.2 8.5±0.4 1.45±0.12 8.4±0.6 37±12 101±15 8.3±0.7 13.7±1.9 IL-4-AuNP组 6 8.9±1.0 8.7±0.5 1.49±0.18 8.6±0.7 33±7 103±11 8.4±0.9 13.3±2.1 t值 0.41 0.62 0.63 0.35 0.70 0.22 0.06 0.30 P值 0.688 0.551 0.543 0.736 0.506 0.834 0.952 0.775 注：IL-4-AuNP为白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒；WBC为白细胞计数，RBC为红细胞计数，PLT为血小板计数，ALT为丙氨酸转氨酶，AST为天冬氨酸转氨酶 
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表2 3组糖尿病小鼠分组处理不同时间点全层皮肤缺损未愈合面积比较（mm2，
组别 鼠数（只） 0 d 4 d 9 d 15 d 空白对照组 6 43.3±3.5 41.2±2.8 39.3±3.2 25.3±2.5 单纯AuNP组 6 44.1±3.9 41.1±2.8 29.9±2.0a 21.3±2.1a IL-4-AuNP组 6 44.7±3.4 40.9±2.3 24.4±2.0ab 8.3±1.2ab F值 0.23 0.02 56.61 116.48 P值 0.800 0.983 <0.001 <0.001 注：AuNP为金纳米酶颗粒；IL-4为白细胞介素4；处理因素主效应，F=15.03，P<0.001；时间因素主效应，F=1 143.93，P<0.001；二者交互作用，F=72.16，P<0.001；与空白对照组相比，aP<0.05；与单纯AuNP组相比，bP<0.05
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