Effects of exosomes from hepatocyte growth factor-modified human adipose mesenchymal stem cells on full-thickness skin defect in diabetic mice
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摘要:
目的 探讨肝细胞生长因子（HGF）修饰的人脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面的作用及其机制。 方法 采用实验研究方法。取2021年2—5月于空军军医大学第一附属医院整形科行腹部手术的3名健康女性（10~25岁）废弃脂肪组织，采用胶原酶消化法获取原代ADSC，培养7 d，用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第3代ADSC，转染HGF慢病毒，培养5 d，采用成像系统观察细胞荧光情况并计算转染率。取第3~6代ADSC和第3~6代转染HGF的ADSC，均分别采用密度梯度离心法提取其外泌体，即为ADSC外泌体和HGF-ADSC外泌体。采用透射电子显微镜观察外泌体微观形态，采用流式细胞仪检测外泌体的CD9、CD63、CD81阳性表达。取24只6周龄雄性昆明小鼠，制作糖尿病模型后，在其背部制作全层皮肤缺损创面。按照随机数字表法将小鼠分为磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组和HGF-ADSC外泌体组，每组6只，分别作相应处理。伤后3、7、10、14 d，观察创面愈合情况并计算其愈合率，使用多普勒血流仪检测创基血流强度并计算伤后10 d创基相对血流强度百分比。伤后10 d，采用免疫荧光法检测创面中Ki67阳性细胞数，采用免疫组织化学法检测创面中CD31阳性染色且成管样结构的新生血管数，采用蛋白质印迹法检测创面中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）的蛋白表达并计算p-PI3K与PI3K比值及p-Akt与Akt比值。伤后14 d，采用苏木精-伊红染色法、Masson染色法分别检测创面皮肤组织缺损长度及胶原新生情况，并计算胶原容积分数（CVF）。样本数均为3。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析及Tukey检验。 结果 原代ADSC培养7 d，细胞呈梭形，生长密集后呈旋涡状排列。培养5 d后，第3代转染HGF的ADSC携带绿色荧光，转染率为85%。ADSC外泌体及HGF-ADSC外泌体微观形态相似，均呈囊泡状结构，平均粒径分别为103、98 nm，均呈CD9、CD63、CD81阳性。伤后3 d，4组小鼠创面的创周均红肿且有少量渗液；伤后7 d，HGF-ADSC外泌体组创面逐渐缩小，其余3组创面缩小不明显；伤后10 d，4组创面均缩小、结痂；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面基本愈合，其余3组均有残余创面。伤后3 d，4组创面愈合率接近（P>0.05）；伤后7、10 d，HGF-ADSC外泌体组创面愈合率均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为13.11、13.11、11.89，12.85、11.28、7.74，P<0.01）；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面愈合率明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为15.50、11.64、6.36，P值均<0.01）。伤后3 d，4组小鼠创基均无明显血运；伤后7 d，HGF-ADSC外泌体组创基开始有微血管形成，其余3组创基仅创缘充血；伤后10 d，除PBS组创基仍无明显血运外，其余3组均有微血管形成；伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创基血流信号强于其余3组且分布均匀。伤后10 d，HGF-ADSC外泌体组创基相对血流强度百分比明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为23.73、19.32、9.48，P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中Ki67阳性细胞数及新生血管数均明显多于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为19.58、18.20、11.04，20.68、13.79、8.12，P<0.01）。伤后10 d，HGF-ADSC外泌体组创面中eNOS蛋白表达水平明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为53.23、42.54、26.54，P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中p-PI3K与PI3K的比值及p-Akt与Akt的比值均分别明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为16.11、11.78、6.08，65.54、31.63、37.86，P<0.01）。伤后14 d，HGF-ADSC外泌体组创面皮肤中组织缺损长度明显短于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为20.51、18.50、11.99，P值均<0.01）；HGF-ADSC外泌体组创面中CVF明显高于PBS组、单纯HGF组及单纯ADSC外泌体组（q值分别为31.31、28.52、12.35，P值均<0.01）。 结论 人HGF-ADSC外泌体可增加创基组织新生血管形成，从而显著促进糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合，其机制可能与HGF-ADSC外泌体通过激活PI3K/Akt信号通路从而促进创面中eNOS的表达增高有关。 Abstract:Objective To investigate the effects and mechanism of exosomes from hepatocyte growth factor (HGF)-modified human adipose mesenchymal stem cells (ADSCs) on full-thickness skin defect wounds in diabetic mice. Methods The experimental study method was adopted. Discarded adipose tissue of 3 healthy females (10-25 years old) who underwent abdominal surgery in the Department of Plastic Surgery of First Affiliated Hospital of Air Force Medical University from February to May 2021 was collected, and primary ADSCs were obtained by collagenase digestion method and cultured for 7 days. Cell morphology was observed by inverted phase contrast microscope. The ADSCs of third passage were transfected with HGF lentivirus and cultured for 5 days, and then the fluorescence of cells was observed by imaging system and the transfection rate was calculated. The exosomes of ADSCs of the third to sixth passages and the HGF transfected ADSCs of the third to sixth passages were extracted by density gradient centrifugation, respectively, and named, ADSC exosomes and HGF-ADSC exosomes. The microscopic morphology of exosomes was observed by transmission electron microscopy, and the positive expressions of CD9, CD63, and CD81 of exosomes were detected by flow cytometry, respectively. Twenty-four 6-week-old male Kunming mice were selected to make the diabetic models, and full-thickness skin defect wounds were made on the backs of mice. According to the random number table method, the mice were divided into phosphate buffer solution (PBS) group, HGF alone group, ADSC exosome alone group, and HGF-ADSC exosome group, with 6 mice in each group, and treated accordingly. On post injury day (PID) 3, 7, 10, and 14, the wounds were observed and the wound healing rate was calculated; the blood flow intensity of wound base was detected by Doppler flowmeter and the ratio of relative blood flow intensity on PID 10 was calculated. On PID 10, the number of Ki67 positive cells in wounds was detected by immunofluorescence method, and the number of new-vascularity of CD31 positive staining and tubular neovascularization in the wounds was detected by immunohistochemistry method; the protein expressions of protein endothelial nitric oxide synthase (eNOS), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), phosphorylated PI3K (p-PI3K), protein kinase B (Akt) and phosphorylated Akt (p-Akt) in wounds were detected by Western blotting, and the ratios of p-PI3K to PI3K and p-Akt to Akt were calculated. On PID 14, the defect length and collagen regeneration of wound skin tissue were detected by hematoxylin and eosin staining and Masson staining, respectively, and the collagen volume fraction (CVF) was calculated. The number of samples is 3 in all cases. Data were statistically analyzed with repeated measurement analysis of variance, one-way analysis of variance, and Tukey test. Results After 7 days of culture, the primary ADSCs were spindle shaped and arranged in vortex shape after dense growth. After 5 days of culture, HGF transfected ADSCs of the third passage carried green fluorescence, and the transfection rate was 85%. The ADSC exosomes and HGF-ADSC exosomes were similar in microscopic morphology, showing vesicular structures with an average particle size of 103 nm and 98 nm respectively, and both were CD9, CD63, and CD81 positive. On PID 3, the wounds of mice in the 4 groups were all red and swollen, with a small amount of exudate. On PID 7, the wounds of HGF-ADSC exosome group were gradually reduced, while the wounds of the other three groups were not significantly reduced. On PID 10, the wounds in the 4 groups were all reduced and scabbed. On PID 14, the wounds in HGF-ADSC exosome group were basically healed, while the residual wounds were found in the other three groups. On PID 3, the healing rates of wounds in the four groups were similar (P>0.05); On PID 7 and 10, the wound healing rates in HGF-ADSC exosome group were significantly higher than those in PBS group, HGF alone group, and ADSC exosome alone group, respectively (with q values of 13.11, 13.11, 11.89, 12.85, 11.28, and 7.74, respectively, all P<0.01); on PID 14, the wound healing rate in HGF-ADSC exosome group was significantly higher than that in PBS group, HGF alone group, and ADSC exosome alone group (with q values of 15.50, 11.64, and 6.36, respectively, all P<0.01). On PID 3, there was no obvious blood supply in wound base of mice in the 4 groups. On PID 7, microvessels began to form in the wound base of HGF-ADSC exosome group, while the wound base of the other three groups was only congested at the wound edge. On PID 10, microvessel formation in wound base was observed in the other 3 groups except in PBS group, which had no obvious blood supply. On PID 14, the blood flow intensity of wound base in HGF-ADSC exosome group was stronger than that in the other 3 groups, and the distribution was uniform. On PID 10, the ratio of wound base relative blood flow intensity in HGF-ADSC exosome group was significantly higher than that in PBS group, HGF alone group, and ADSC exosome alone group (with q values of 23.73, 19.32, and 9.48, respectively, all P<0.01); The numbers of Ki67-positive cells and new-vascularity of wounds in HGF-ADSC exosome group were significantly higher than those in PBS group, HGF alone group, and ADSC exosome alone group, respectively (with q values of 19.58, 18.20, 11.04, 20.68, 13.79, and 8.12, respectively, P<0.01). On PID 10, the protein expression level of eNOS of wounds in HGF-ADSC exosome group was higher than that in PBS group, HGF alone group, and ADSC exosome alone group (with q values of 53.23, 42.54, and 26.54, respectively, all P<0.01); the ratio of p-PI3K to PI3K and the ratio of p-Akt to Akt of wounds in HGF-ADSC exosome group were significantly higher than those in PBS group, HGF alone group, and ADSC exosome alone group, respectively (with q values of 16.11, 11.78, 6.08, 65.54, 31.63, and 37.86, respectively, P<0.01). On PID 14, the length of skin tissue defect in the wounds of HGF-ADSC exosome group was shorter than that in PBS group, HGF alone group, and ADSC exosome alone group (with q values of 20.51, 18.50, and 11.99, respectively, all P<0.01); the CVF of wounds in HGF-ADSC exosome group was significantly higher than that in PBS group, HGF alone group and ADSC exosome alone group (with q values of 31.31, 28.52, and 12.35, respectively, all P<0.01). Conclusions Human HGF-ADSC exosomes can significantly promote wound healing in diabetic mice by increasing neovascularization in wound tissue, and the mechanism may be related to the increased expression of eNOS in wounds by activating PI3K/Akt signaling pathway. -
组织损伤是人类生存中不可避免的问题，由于人体的再生能力有限，大面积组织损伤往往难以自愈，需要通过组织或器官移植方式进行治疗。但是，治疗方案能否实施受限于损伤的程度、供体数量以及术后排异等因素。组织工程学旨在将生物学和工程学技术相结合，开发受损组织的实用替代物，从而帮助挽救生命和提高生活质量。
三维生物打印是组织工程技术中的重要手段，是将沉积的材料和细胞以层堆叠方式构建成复杂组织模型。三维生物打印能构建出具有分层结构的皮肤模型，且模型内部具有相互连接的孔隙，适合气体和营养物质的运输，满足细胞间和细胞内的信号传递，更接近于人体的病理生理状态。2004年，研究者首次采用三维生物打印技术打印了人皮肤Fb，为皮肤模型构建技术的发展奠定了基础 ［ 1］ 。三维生物打印除了可以构建定制图案的皮肤模型，还可以在创面上进行原位打印，直接将生物体作为生物反应器，诱导组织分化成熟，提高组织修复效果 ［ 2］ 。
目前，三维生物打印技术发展还未成熟，打印出的产品大多也只是处于实验室研究阶段。如何延长打印皮肤组织使用寿命、打印组织的血管化以及打印血管化皮肤组织移植后与创面的整合等问题，均是该领域需要解决的技术难点。因此，基于三维生物打印技术在皮肤再生领域的应用潜力，本文介绍该技术打印过程中涉及的打印策略以及常用生物墨水，分享最新的三维生物打印皮肤研究进展，并对目前存在的一些技术难点进行分析。
1. 三维生物打印策略
常见的三维生物打印可分为4类：基于喷墨技术的三维生物打印、基于挤压技术的三维生物打印、基于激光辅助技术的三维生物打印和基于立体光刻技术的三维生物打印。
1.1 基于喷墨技术的三维生物打印
基于喷墨技术的三维生物打印是将低黏度悬浮生物材料和活细胞混合成生物墨水后沉积在“生物纸”（例如水凝胶基质和培养皿等）上，最终得到理想的图案。该打印方式较简单、价格低廉且打印平台建设简单；但是该技术要求打印材料黏度不能过低，且打印喷头易堵塞，打印过程中无法精确地控制液滴形状，打印精度在50 μm左右。有研究者使用基于喷墨技术的三维生物打印，将水凝胶包裹的自体真皮Fb和表皮KC直接输送到人全层皮肤缺损创面的特定位置，进行原位生物打印，结果显示，与未处理的同型对照相比，创面愈合加速、收缩减少且再上皮化加速 ［ 3］ 。也有研究者使用改进的喷墨打印机将毛细血管样内皮网络整合到真皮-表皮中构建了双层皮肤模型，随后将皮肤模型植入到无胸腺裸鼠背部的全层皮肤缺损创面中，14~16 d后观察到创面基本愈合 ［ 4］ 。
1.2 基于挤压技术的三维生物打印
基于挤压技术的三维生物打印是将生物墨水在压力的作用下高精度挤出，再以逐层堆叠的方式构建三维模型。该打印方式可用材料范围广，可同时使用多种生物材料及高黏度的生物墨水打印，但是打印过程中存在过度的应力，可造成细胞结构破坏，且打印喷头易堵塞。该方法打印精度较低，通常低于100 μm。有研究者使用基于挤压技术的三维生物打印方式，以明胶/海藻酸钠/甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）为生物材料，打印了包含3层Fb和1层KC的皮肤模型，该皮肤模型可加速小鼠全层皮肤缺损创面愈合，促进创面皮肤再上皮化。也有研究者将纤维蛋白水凝胶与明胶、甘油、抑肽酶和透明质酸混合作为生物材料，将KC、黑素细胞、Fb、真皮微血管内皮细胞、毛囊真皮乳头细胞和脂肪细胞悬浮在上述生物材料中，使用基于挤压技术的三维生物打印方式成功构建了3层皮肤模型；与打印的水凝胶（不含细胞）和空白对照相比，该皮肤模型有利于小鼠全层皮肤缺损创面的闭合，同时可促进上皮形成 ［ 5］ 。结合上述技术特性，基于挤压技术的三维生物打印方式更适合于打印皮肤这种具有特殊分层结构的模型。
1.3 基于激光辅助技术的三维生物打印
基于激光辅助技术的三维生物打印的设备主要由脉冲激光源、激光能量吸收层、生物样品层（靶板）和接受基板组成，其打印过程就是将包裹细胞的生物墨水沉积到接受基板上的过程。该打印方式具有高精度和高分辨率等优点，可对高密度细胞样品进行沉积，打印精度可达30~100 μm，且不存在喷口堵塞的问题；但是打印速度慢、打印材料制备过程复杂且价格昂贵。有研究者采用基于激光辅助技术的三维生物打印创建了完全细胞化的皮肤模型，该皮肤模型含有构建到ADM之上的20层包裹Fb的胶原和20层包裹KC的胶原。小鼠全层皮肤缺损模型实验结果显示，移植该皮肤模型后11 d，移植物与创面周围组织完全连接 ［ 6］ 。
1.4 基于立体光刻技术的三维生物打印
基于立体光刻技术的三维生物打印是一种基于面投影光固化原理的高精度三维生物打印技术。该技术通过将构成三维模型的二维离散图案投影到光敏树脂表面，激发局部光固化反应的方式，逐层叠加组建三维结构。基于立体光刻技术的三维生物打印技术打印样本制备容易，打印精度相对较高（约为50 μm），打印成本较低；但对墨水的要求较高，一般使用具备光敏特性的生物墨水，后期处理过程相对复杂，可用于三维水凝胶内部微通道创建，如毛细血管网络构建等。研究人员开发了一种基于数字光处理的立体光刻技术，通过三维生物打印制造出了一个内部由GelMA凝胶包裹人脐静脉内皮细胞模仿骨髓空间，外周含有磷酸八钙模仿骨皮质的三维水凝胶结构。这种结构模仿了骨组织的仿生双环结构，可应用于骨组织构建 ［ 7］ 。
以上4种打印策略打印精度各异，适用的范围也不同。所以实际研究过程中，可以根据不同需求，选择合适的打印策略。
2. 皮肤模型三维生物打印常用生物墨水
确定好打印策略之后，选择具有合适物理、化学性质的生物墨水至关重要。生物墨水包含细胞及生物相容性材料2个部分，下面举例介绍一些常用于皮肤模型打印的细胞和水凝胶。
2.1 细胞
通常三维生物打印皮肤组织的细胞来源可分为3类：（1）人体组织分离的原代细胞；（2）永生化皮肤细胞系；（3）诱导干细胞。
2.1.1 人体组织分离的原代细胞
常用于皮肤模型构建的原代皮肤细胞有Fb和KC。有研究者使用胰酶消化法分离了人原代Fb和KC，结合人Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白进行三维生物打印，将构建的双层皮肤模型（Fb为真皮层、KC为表皮层）在免疫缺陷小鼠全层皮肤缺损创面上应用后，观察到表皮层分化良好 ［ 8］ 。
2.1.2 永生化皮肤细胞系
原代皮肤细胞在使用过程中存在细胞种群倍增数量有限及衰老等问题。为了克服原代细胞使用的局限性，研究人员改造得到了永生化皮肤细胞系。有研究者通过将纳米纤维素与海藻酸盐、羧甲基纤维素结合，包裹人皮肤Fb形成真皮层，再在上层覆盖人永生化表皮细胞HaCaT，所构建的皮肤模型成为一种皮肤组织工程药物筛选的有力工具 ［ 9］ 。
2.1.3 诱导干细胞
由于体细胞的分化功能有限，癌细胞系具有风险性，所以也可以掺入干细胞进行复杂皮肤模型的构建。例如有研究者将羊水干细胞和骨髓间充质干细胞包裹在纤维蛋白水凝胶中，在小鼠全层皮肤缺损创面上原位打印，促进了创面闭合及再上皮化 ［ 10］ 。然而，由于干细胞的分化是无方向性的，用其构建的组织可能具有发育畸形及发生其他不良反应的风险。
2.2 水凝胶
水凝胶是一种具有亲水性和三维网状交联结构的高分子网络体系，与ECM具有相似性，是用于三维生物打印的良好生物相容性材料。根据材料来源不同，可将水凝胶分为天然水凝胶和合成水凝胶。
2.2.1 天然水凝胶
天然水凝胶来源广泛，且不易诱发炎症，是用于生物打印的最佳水凝胶。常见的天然水凝胶有胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖等。
2.2.1 .1 胶原
胶原是哺乳动物ECM中的主要结构蛋白，具有良好的生物相容性，被广泛应用于生物医学领域。有研究者将胶原、明胶、纤维蛋白和弹性蛋白混合，包裹新生儿真皮Fb打印真皮层，上面覆盖由层粘连蛋白/肌动蛋白构成的基底层和由KC构成的表皮层，成功构建了最小横向组织收缩的全层皮肤模型 ［ 11］ 。
2.2.1 .2 明胶
将胶原在酸性或碱性条件下水解即可得到明胶。明胶属于热敏性材料，在温度高于40 ℃时溶解，冷却至30 ℃以下时变为凝胶状态，可用于三维生物打印。有研究人员以明胶/海藻酸盐为原料进行三维生物打印，之后使用冷冻干燥技术进行打印后基质的固化，提高模型的机械性能，构建好的模型在医疗领域可作为创面敷料使用 ［ 12］ 。然而，明胶因其难以优化的生理温度及黏度，多与其他聚合物组成复合材料应用。此外，明胶的化学交联修饰形式也适用于生物打印，例如GelMA是双键改性的明胶，其温敏性、机械性及黏弹性良好，是三维生物打印领域应用广泛的生物材料。有研究者将GelMA、胶原和酪氨酸酶混合，包裹人黑素细胞、HaCaT和Fb，进行三维生物打印，形成稳定的三维皮肤组织模型 ［ 13］ 。
2.2.1 .3 纤维蛋白和纤维蛋白原
纤维蛋白是一种类似于胶原的聚合物，是创面愈合的关键调节剂，由纤维蛋白原在凝血酶的作用下酶促聚合形成。纤维蛋白原和纤维蛋白在临床上可被用于生产具有止血功能的敷料，修复受损创面。有研究者使用纤维蛋白+胶原包裹人Fb和KC，使用三维生物打印的方式构建分层皮肤结构，直接敷于小鼠受损创面位置，2周后创面完全愈合 ［ 14］ 。
2.2.1 .4 透明质酸
透明质酸，也称糖醛酸，由以 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰氨基葡萄糖为单位的线性多糖组成，具有调节血管壁的通透性、保持皮肤中的水分及促进创面愈合的作用，适用于三维生物打印。有研究者使用由藻酸盐、纤维蛋白、胶原和透明质酸组成的生物材料，通过手持式皮肤打印机打印出类似于天然皮肤结构的3层皮肤组织片，该打印材料可加速小鼠和猪全层皮肤缺损模型的创面愈合 ［ 15］ 。
2.2.2 合成水凝胶
除了天然水凝胶以外，聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸和聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）等一些碳氢化合物聚合物，也被广泛应用于组织工程皮肤模型的构建。这些聚合物也可与胶原和壳聚糖等天然水凝胶结合使用，形成性能更佳的生物材料。
2.2.2 .1 聚乙二醇
聚乙二醇具有无毒性、无免疫原性、水溶性好等优点，是当今常用的高分子材料之一，已通过美国食品药品监督管理局（FDA）批准，可供静脉注射、口服和皮肤外用。有研究者以京尼平为交联剂，甘油和聚乙二醇为增塑剂，采用三维生物打印技术制备了交联壳聚糖基质膜。该膜具有黏附到上皮表面的能力，有望成为治疗慢性创面的敷料 ［ 16］ 。
2.2.2 .2 聚己内酯
聚己内酯作为一种潜在的生物降解材料，具有无免疫原性、生物相容性好、柔韧性强、力学强度高等诸多优点，是FDA批准的适用于组织修复的材料。有研究者使用基于挤压技术的三维生物打印方法，将用胶原包裹的Fb和KC构建到无细胞的聚己内酯+胶原层上，经气液界面培养，得到仿真的全层皮肤模型 ［ 17］ 。
2.2.2 .3 聚乳酸或PLGA
聚乳酸，是指以乳酸为主要原料聚合得到的聚酯类聚合物，属于新型可再生生物降解材料。有研究者使用三维生物打印方法制造出聚乳酸和β-磷酸三钙支架，并将其与胶原、海藻酸钠壳聚糖等结合，构建的三维支架具有组织修复和再生能力 ［ 18］ 。乳酸和羟基乙酸随机聚合可组成PLGA，PLGA也是一种可降解的高分子有机化合物，具有良好的成型性。有研究者将构建的三维PLGA支架嵌入胶原支架中，构建出多层PLGA-胶原-壳聚糖支架，该模型在大鼠全层皮肤缺损创面的应用中表现出良好的促愈合效果 ［ 19］ 。
总之，天然水凝胶具有良好的生物相容性且来源丰富，在皮肤模型打印方面应用广泛，但不足是稳定性较差、易降解等。合成水凝胶的机械性能可经物理交联或化学交联的方式得以强化，这弥补了天然水凝胶的不足。因此，实际打印时可混合多种生物材料，获得具有合适的刚度、生物活性以及降解能力的生物墨水。
3. 三维生物打印技术在皮肤组织工程中的应用
近年来，三维生物打印技术在皮肤模型构建、创面修复、再生医学方面显示出巨大的应用潜力。下面，主要对三维生物打印技术在皮肤组织工程中的应用进行归纳介绍。
3.1 皮肤模型构建
使用三维生物打印方式可以构建不同种类的皮肤模型。有研究者设计并打印了一种双层支架，该支架上层和下层分别由PLGA和海藻酸盐水凝胶组成，分别模仿了皮肤表皮层和真皮层。该支架可以促进大鼠全层皮肤缺损创面愈合，适合作为创面敷料或皮肤替代物 ［ 20］ 。还有研究者通过基于挤压技术的三维生物打印方法，以无细胞脂肪基质和纤维蛋白原为材料构建皮下层，Fb混合真皮基质构建真皮层，将包裹人脐静脉内皮细胞的明胶和凝血酶作为血管通道，通过喷墨打印将KC打印在支架上层，最终构建的全层血管化皮肤模型与原生人体皮肤具有良好的相似性 ［ 21］ 。
3.2 疾病模型构建
黑色素瘤和银屑病等疾病模型可以通过三维生物打印的方式来构建。有研究者将黑色素瘤细胞系或原发黑色素瘤患者来源的黑色素瘤细胞、Fb、间充质干细胞和内皮细胞嵌入琼脂糖-Ⅰ型胶原蛋白水凝胶中，经三维生物打印构建了黑色素瘤模型，该模型中细胞增殖和代谢活性良好，为研究黑色素瘤的治疗及重塑肿瘤微环境提供了实验基础 ［ 22］ 。还有研究者将牛皮癣患者的极化Th1/Th17和趋化因子受体6阳性皮肤淋巴细胞抗原阳性T细胞加入由Ⅰ型胶原包裹的人KC和Fb组成的全层皮肤模型中，之后检测该模型具有银屑病表皮表型，并表达银屑病相关特征性细胞因子，表明成功建立了银屑病三维皮肤模型 ［ 23］ 。
3.3 皮肤创面敷料
当三维生物打印技术以含有促进创面愈合的生物材料为打印原料时，即可构建皮肤创面敷料。有研究者使用三维生物打印技术构建了一种基于噬菌体的具有抗菌功效的创面敷料，该敷料可以缓慢释放游离噬菌体，维持人表皮创面处噬菌体数量，具有抗菌作用 ［ 24］ 。还有研究者基于三维生物打印技术，开发出了糖尿病足溃疡辅助治疗药物。他们使用含有脂肪干细胞的猪皮肤ECM和内皮祖细胞打印了三维皮肤贴片，应用于糖尿病足溃疡创面后，可较基于胶原的三维皮肤贴片加速创面愈合，增强上皮再生 ［ 25］ 。
3.4 化妆品功效评估
三维皮肤模型被广泛应用于化妆品功效检测中。有研究者使用Fb和KC，以及外周血单个核细胞诱导的M1/M2型巨噬细胞，构建了促炎/抗炎的三维皮肤模型（其中用M1型巨噬细胞构建促炎模型，M2型巨噬细胞构建抗炎模型），该类模型可用于化妆品成分分析及药物筛选 ［ 26］ 。也有研究者在重建人表皮模型和三维生物打印的全层皮肤模型上应用化妆品，通过测定组织活力、上皮电阻和细胞因子分泌情况，分析受试化合物对皮肤模型的刺激及致敏性，测试化妆品功效 ［ 27］ 。
4. 展望
皮肤组织工程的目标是生理皮肤的再生及功能恢复 ［ 28］ 。而三维生物打印技术因具有可定制构建含多细胞复杂分层结构皮肤模型的优势，在再生医学和药物筛选方面具有巨大的应用潜力。三维生物打印技术在过去十几年迅速发展，然而面对不同打印需求时，如何提高打印分辨率、开发功能性打印材料，以及实现高通量打印，这些都是新的挑战 ［ 29］ 。为了解决这些问题，研究人员做了很多研究，例如开发了基于碘克沙醇的生物墨水，可以提高基于数字光处理技术的三维生物打印分辨率。聚氨酯是一种可生物降解材料，应用于基于立体光刻和数字光处理技术的三维生物打印中时，可实现较高分辨率打印，在软骨细胞、肌肉和神经支架的三维模型构建中具有巨大应用潜力。此外，基于纳米材料开发的具有导电性质的生物墨水以及混合了生物活性分子的生物墨水，都为构建功能性三维组织模型提供了新的方向。三维生物打印技术方兴未艾，四维生物打印技术也带着它新的技术特点应运而生。四维生物打印不仅包含三维的长、宽和高3个维度，更增加了一个时间维度，使打印出的物体可以随着时间推移在形态结构上自我调整，最终达到预先设计要求。四维生物打印使用的刺激响应性材料是一种用于创面修复的新兴材料，其结构特性可受磁场、温度、氧化还原状态、pH值和光等各种刺激调控 ［ 30］ 。多功能的新型四维生物墨水系统的建立也会在组织工程中开辟许多应用领域。
最后，由于生物打印过程的复杂性，未来的目标可能是机器学习的应用和计算方法集合。机器学习可以将组织模型以三维的形式展现出来，并且可以预测模型构建时所用材料的兼容性。临床上三维生物打印的数据来源可以是不同的诊断图像、实验数据和科学文献，这些都可以使用机器学习来整合 ［ 31］ 。总之，三维生物打印技术凭借其无法比拟的成型技术优势，成为皮肤组织工程研究的热点之一，希望能加快实现皮肤组织工程相关的三维生物打印技术的临床前研究和转化应用。
曹涛：实施研究、采集数据、分析数据与撰写论文；肖丹、计鹏：酝酿并设计实验、采集数据、分析数据、修改文章；张智、蔡维霞：实施研究与起草文章；韩超、李雯：实施研究、采集数据；陶克：酝酿并设计研究、分析数据、修改文章与获取研究经费所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 原代培养7 d的人脂肪间充质干细胞（ADSC）形态及转染肝细胞生长因子的第5代ADSC的鉴定。1A.ADSC呈梭状生长，胞核呈球形、核质分界清晰 倒置相差显微镜×20；1B.大部分转染细胞携带绿色荧光 异硫氰酸荧光素×40
2 人脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体微观形态和肝细胞生长因子（HGF）修饰的ADSC外泌体（简称HGF-ADSC外泌体）微观形态及其粒径。2A.ADSC外泌体呈囊泡状结构 透射电子显微镜×40 000；2B.HGF-ADSC外泌体外观与图2A相似 透射电子显微镜×40 000；2C.HGF-ADSC外泌体粒径分布在60~160 nm之间
注：图2C横坐标为经过lg处理后的数据
3 4组糖尿病小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合情况。3A、3B、3C、3D.分别为PBS组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组及HGF-ADSC外泌体组伤后10 d创面，4组创面均结痂；3E、3F、3G、3H.分别为PBS组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组及HGF-ADSC外泌体组伤后14 d创面，均分别较图3A、3B、3C、3D明显缩小，其中图3H中创面基本愈合、新生上皮致密
注：PBS为磷酸盐缓冲液，HGF为肝细胞生长因子，ADSC为脂肪间充质干细胞；各图中的外环起固定小鼠创周皮肤作用
4 激光多普勒血流仪检测4组糖尿病小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面中血流强度变化情况。4A、4B、4C、4D.分别为磷酸盐缓冲液（PBS）组伤后3、7、10、14 d创基及创周血运情况，创基血运均较差；4E、4F、4G、4H.分别为单纯肝细胞生长因子（HGF）组伤后3、7、10、14 d创基及创周血运情况，除伤后7 d创周血流强度增强外，其余时间点的创基血运均不佳；4I、4J、4K、4L.分别为单纯脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体组伤后3、7、10、14 d创基及创周血运情况，均分别较图4E、4F、4G、4H与图4A、4B、4C、4D血流信号强；4M、4N、4O、4P.分别为HGF-ADSC外泌体组伤后3、7、10、14 d创基及创周血运情况，伤后7 d该组创基血流强度明显高于同时间点其余3组，伤后10 d创基血流强度最强，伤后14 d创基血运反而下降
注：颜色越接近红色表示血流强度越高，颜色越接近蓝色表示血流强度越低
5 4组糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面免疫荧光染色及免疫组织化学染色情况。5A、5B、5C、5D.分别为PBS组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组及HGF-ADSC外泌体组创面组织伤后10 d的Ki67染色情况，图5D中阳性细胞数多于其余3图 花青素3-4′，6- 二脒基-2-苯基吲哚×100；图5E、5F、5G、5H分别为PBS组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组及HGF-ADSC外泌体组创基组织CD31免疫组织化学染色情况，其中图5H阳性染色且成管样结构的新生血管数量多于其余3图 辣根过氧化物酶-苏木精×100
注：PBS为磷酸盐缓冲液，HGF为肝细胞生长因子，ADSC为脂肪间充质干细胞；Ki67阳性细胞染色为红色，CD31阳性细胞染色为棕色
6 4组糖尿病小鼠伤后10 d全层皮肤缺损创面中eNOS的表达及PI3K与Akt的磷酸化水平
注：eNOS为内皮型一氧化氮合酶，Akt为蛋白激酶B，p-Akt为磷酸化AKT，PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶，p-PI3K为磷酸化PI3K，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带上方1、2、3、4分别指磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯肝细胞生长因子（HGF）组、单纯脂肪间充质干细胞（ADSC）外泌体组、HGF-ADSC外泌体组
7 4组糖尿病小鼠伤后14 d全层皮肤缺损创面上皮化情况及胶原新生情况。7A、7B、7C、7D.分别为PBS组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组及HGF-ADSC外泌体组创面，图7D的创面缺损较长度明显短于其余3图 苏木精-伊红×20；7E、7F、7G、7H.分别为PBS组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组及HGF-ADSC外泌体组创面，图7H较其余3图的蓝染面积更大，胶原排列更疏松有序 Masson×100
注：PBS为磷酸盐缓冲液，HGF为肝细胞生长因子，ADSC为脂肪间充质干细胞；图7A、7B、7C、7D中黑色线段为创面缺损长度；图7E、7F、7G、7H中胶原阳性染色为蓝色
表1 4组糖尿病小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损创面愈合率比较（%，
组别 鼠数（只） 3 d 7 d 10 d 14 d HGF-ADSC外泌体组 3 10.7±0.6 27.0±1.1 76.1±0.7 89.7±0.4 PBS组 3 10.3±0.8 18.5±1.7 54.4±3.0 70.5±3.0 单纯HGF组 3 10.1±0.3 18.5±1.0 57.0±1.8 75.3±2.1 单纯ADSC外泌体组 3 10.8±0.6 19.3±0.3 63.0±2.0 81.8±2.2 F值 0.93 40.67 65.59 45.21 P1值 0.472 <0.001 <0.001 <0.001 q1值 0.90 13.11 12.85 15.50 P2值 0.708 <0.001 <0.001 <0.001 q2值 1.31 13.11 11.28 11.64 P3值 0.458 <0.001 <0.001 <0.001 q3值 0.07 11.89 7.74 6.36 P4值 0.100 <0.001 <0.001 0.008 注：HGF为肝细胞生长因子，ADSC为脂肪间充质干细胞，PBS为磷酸盐缓冲液；处理因素主效应，F=73.43，P<0.001；时间因素主效应，F=8 679.77，P<0.001；两者交互作用，F=38.18，P<0.001；F值、P1值为4组间各时间点总体比较所得；q1值、P2值，q2值、P3值，q3值、P4值分别为HGF-ADSC外泌体组与PBS组、单纯HGF组、单纯ADSC外泌体组各时间点比较所得 
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