Effects of advanced platelet-rich fibrin on deep partial-thickness burn wounds in nude mice
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摘要:
目的 探讨改良型富血小板纤维蛋白（A-PRF）对裸鼠深Ⅱ度烧伤创面的作用及其机制。 方法 采用实验研究方法。招募苏北人民医院40名健康志愿者，包括32名女性、8名男性，年龄为60~72岁，抽取静脉血后制备富白细胞血小板纤维蛋白（L-PRF）和A-PRF膜片，采用场发射扫描电子显微镜观察2种富血小板纤维蛋白（PRF）膜片的微观结构。以下实验样本数均为3。将L-PRF、A-PRF膜片分别设为L-PRF组、A-PRF组并进行培养，采用酶联免疫吸附测定法检测培养1、3、7、14 d上清液中血小板衍生生长因子AB（PDGF-AB）和血管内皮生长因子（VEGF）的释放浓度。取小鼠L929成纤维细胞（Fb），分为L-PRF组、A-PRF组，并分别加入L-PRF或A-PRF条件培养基培养，于培养1、3、7 d采用噻唑蓝法检测细胞增殖活性，采用划痕试验检测并计算划痕后24 h细胞迁移率。取36只6~8周龄雄性BALB/c裸鼠，于一侧后腿皮肤制作1个深Ⅱ度烧伤创面后，按随机数字表法分为生理盐水组、L-PRF组、A-PRF组，每组12只。生理盐水组裸鼠创面仅行生理盐水冲洗，L-PRF组、A-PRF组裸鼠创面另覆盖相应PRF膜片，3组裸鼠创面均用敷料包扎固定。治疗4、7、14 d，观察创面愈合情况并计算创面愈合率，取创面组织行Masson染色观察新生胶原情况，行免疫组织化学染色检测创面CD31阳性细胞百分比。对数据行独立样本 t检验、重复测量方差分析、析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验。 结果 L-PRF膜片由粗大的纤维蛋白束构成致密的网状结构，散在分布形态完整的白细胞及血小板。A-PRF膜片由细小的纤维蛋白束构成疏松的网状结构，散在分布少量变形的白细胞及血小板。培养1 d，A-PRF组PRF培养上清液中PDGF-AB释放浓度明显高于L-PRF组（ t=5.73， P<0.05），2组PRF培养上清液中VEGF释放浓度相近（ P>0.05）；培养3、7、14 d，A-PRF组PRF培养上清液中PDGF-AB、VEGF释放浓度均明显高于L-PRF组（ t值分别为6.93、7.45、5.49，6.97、8.97、13.64， P<0.05）。培养3、7、14 d，2组PRF培养上清液中PDGF-AB、VEGF释放浓度均明显高于组内前一时间点（ P<0.05）。培养1、3、7 d，A-PRF组小鼠Fb增殖活性分别为0.293±0.034、0.582±0.054、0.775±0.040，均明显强于L-PRF组的0.117±0.013、0.390±0.036、0.581±0.037（ t值分别为8.38、5.14、6.16， P<0.05）。划痕后24 h，A-PRF组小鼠Fb迁移率为（60.9±2.2）%，明显高于L-PRF组的（39.1±2.3）%（ t=11.74， P<0.05）。治疗4 d，L-PRF组和A-PRF组裸鼠创面渗液较少且未见明显感染迹象，生理盐水组裸鼠创面有较多渗液。治疗7 d，L-PRF组和A-PRF组裸鼠创面干燥结痂，生理盐水组裸鼠创面仍有少量渗液。治疗14 d，A-PRF组裸鼠创面趋于愈合，L-PRF组裸鼠仍残留小部分创面，生理盐水组裸鼠创面仍有未脱落焦痂。治疗4、7、14 d，L-PRF组裸鼠创面愈合率与CD31阳性细胞百分比均明显高于生理盐水组（ P<0.05）；与生理盐水组和L-PRF组相比，A-PRF组裸鼠创面愈合率均明显升高（ P<0.05），新生胶原排列有序、分布均匀且未见过度沉积，CD31阳性细胞百分比均明显升高（ P<0.05）。 结论 A-PRF稳定的纤维蛋白网状结构能维持生长因子持续释放、加快细胞增殖、促进细胞迁移，以缩短裸鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合时间且改善愈合质量。 Abstract:Objective To explore the effects of advanced platelet-rich fibrin (A-PRF) on deep partial-thickness burn wounds in nude mice and its mechanism. Methods The experimental study method was adopted. Forty healthy volunteers in Subei People's Hospital were recruited, including 32 females and 8 males, aged 60 to 72 years. Leukocyte platelet-rich fibrin (L-PRF) and A-PRF membranes were prepared after venous blood was extracted from them. The microstructure of two kinds of platelet-rich fibrin (PRF) membranes was observed by field emission scanning electron microscope. The number of samples was 3 in the following experiments. The L-PRF and A-PRF membranes were divided into L-PRF group and A-PRF group and cultured, and then the release concentrations of platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in culture supernatant were determined by enzyme-linked immunosorbent assay on culture day 1, 3, 7, and 14. Mice L929 fibroblasts (Fbs) were divided into L-PRF group and A-PRF group, and cultured with L-PRF or A-PRF conditioned medium, respectively. On culture day 1, 3, and 7, the cell proliferation activity was detected by thiazole blue method. The cell migration rate was detected and calculated at 24 h after scratching by scratch test. Thirty-six male BALB/c nude mice aged 6-8 weeks were selected to make a deep partial-thickness burn wound on one hind leg, and then divided into normal saline group, L-PRF group, and A-PRF group, according to the random number table, with 12 mice in each group. The wounds of nude mice in normal saline group were only washed by normal saline, while the wounds of nude mice in L-PRF group and A-PRF group were covered with the corresponding membranes in addition. The wounds of nude mice in the 3 groups were all bandaged and fixed with dressings. On treatment day 4, 7, and 14, the wound healing was observed and the wound healing rate was calculated. Masson staining was used to observe the new collagen in wound tissue, and immunohistochemical staining was used to detect the percentage of CD31 positive cells in the wound. Data were statistically analyzed with independent sample t test, analysis of variance for repeated measurement, analysis of variance for factorial design, one-way analysis of variance, and least significant difference test. Results L-PRF membrane's dense network structure was composed of coarse fibrin bundles, with scattered white blood cells and platelets with complete morphology. A-PRF membrane's loose network structure was composed of fine fibrin bundles, with scattered small amount of deformed white blood cells and platelets. On culture day 1, the release concentration of PDGF-AB in PRF culture supernatant in A-PRF group was significantly higher than that in L-PRF group ( t=5.73, P<0.05), while the release concentrations of VEGF in PRF culture supernatant in the two groups were similar ( P>0.05). On culture day 3, 7, and 14, the release concentrations of PDGF-AB and VEGF in PRF culture supernatant in A-PRF group were significantly higher than those in L-PRF group (with t values of 6.93, 7.45, 5.49, 6.97, 8.97, and 13.64, respectively, P<0.05). On culture day 3, 7, and 14, the release concentrations of PDGF-AB and VEGF in PRF culture supernatant in the two groups were all significantly higher than those in the previous time points within the group ( P<0.05). On culture day 1, 3, and 7, the proliferation activity of mice Fbs in A-PRF group was 0.293±0.034, 0.582±0.054, and 0.775±0.040, respectively, which were significantly stronger than 0.117±0.013, 0.390±0.036, and 0.581±0.037 in L-PRF group (with t values of 8.38, 5.14, and 6.16, respectively, P<0.05). At 24 h after scratching, the migration rate of mice Fbs in A-PRF group was (60.9±2.2)%, which was significantly higher than (39.1±2.3)% in L-PRF group ( t=11.74, P<0.05). On treatment day 4, the wound exudates of nude mice in L-PRF group and A-PRF group were less with no obvious signs of infection, while the wounds of nude mice in normal saline group showed more exudation. On treatment day 7, the wounds of nude mice in L-PRF group and A-PRF group were dry and crusted, while there was still a small amount of exudate in the wounds of nude mice in normal saline group. On treatment day 14, the wounds of nude mice in A-PRF group tended to heal; a small portion of wounds remained in nude mice in L-PRF group; the wound of nude mice was still covered with eschar in normal saline group. On treatment day 4, 7, and 14, the wound healing rate and percentage of CD31 positive cells of nude mice in L-PRF group were all significantly higher than those in normal saline group ( P<0.05); compared with those in normal saline group and L-PRF group, the wound healing rate of nude mice in A-PRF group was significantly increased ( P<0.05), the newborn collagen was orderly and evenly distributed, with no excessive deposition, and the percentage of CD31 positive cells was significantly increased ( P<0.05). Conclusions The stable fibrin network structure of A-PRF can maintain the sustained release of growth factors, accelerate cell proliferation, and promote cell migration, so as to shorten the healing time and improve the healing quality of deep partial-thickness burn wounds in nude mice. -
Key words:
- Burns /
- Wound healing /
- Cell proliferation /
- Platelet-rich fibrin /
- Growth factor
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烧伤是常见的损伤之一，我国每年有数十万人因为烧伤而致残或致畸。烧伤后病理性瘢痕组织的形成是烧伤患者康复过程中的重要并发症之一，不仅严重影响患者的外观，而且可引起器官及组织的功能障碍，严重影响患者生活质量及身心健康［1］。对于瘢痕产生的机制，目前在微观方面的研究仅涉及细胞因子、ECM等，而其分子机制尚不十分明确［2］。
有研究显示，青光眼滤过术后使用表观遗传修饰可减少瘢痕组织的产生［3］，表明瘢痕产生的过程中可能存在表观遗传改变。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰机制，可在不改变DNA序列的情况下改变基因表达量［4, 5］。甲基化水平的高低会显著影响蛋白的最终翻译。生物信息学分析是一项新兴的研究方法，可结合测序数据进行全基因组分析，有针对性地寻找与疾病相关的基因或基因集［6, 7］。甲基化研究在瘢痕中较为常见，但检索显示以生物信息学为基础，探究甲基化与瘢痕形成关系的研究罕见，因此以生物信息学为基础探讨甲基化与瘢痕形成的关系显得十分必要。
加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）可对大量芯片来源的基因数据进行有效分析，是生物信息学研究的重要工具［8］。本观察性研究使用WGCNA对正常组织和瘢痕组织的mRNA表达谱进行分析并结合甲基化数据集对选定模块内的基因进行甲基化状态判断，对烧伤后瘢痕组织形成的分子机制进行探讨，并使用支持向量机（support vector machine，SVM）模型进行进一步验证，为临床治疗烧伤后瘢痕组织提供新思路。
1. 资料及方法
1.1 数据收集
从美国国家生物技术信息中心基因表达综合数据库（
https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ）内检索并下载相关数据集，即检索基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）中烧伤后瘢痕组织相关数据集，结果显示mRNA数据集GSE136906及甲基化数据集GSE137134是同一批次的12个样本（均由澳大利亚大学生物医学院烧伤研究组上传，每个数据集均为6个样本），分别进行了mRNA测序和甲基化测序，因此纳入本研究；数据集GSE108110在剩余数据集中样本量相对较大，因此纳入SVM及建模分析（表1）。表1 烧伤后瘢痕组织相关数据集的详细信息数据集 测序平台 Affymetrix eneChip文件 样本数（个） 瘢痕数（个） GSE137134 GPL13534-11288 1 6 6 GSE136906 GPL16686 2 6 6 GSE108110 GPL570 3 9 9 注：1、2、3分别为Illumina HumanMethylation450 BeadChip (HumanMethylation450_15017482)、[HuGene-2_0-st] Affymetrix Human Gene 2.0 ST Array [transcript (gene) version]、[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 1.2 GEO数据集的分析
下载GSE137134与GSE136906数据集并将数据集中的探针代码转换成基因符号。使用R语言中的“Limma”软件包寻找GSE137134中瘢痕组织与正常组织的差异甲基化基因（differentially methylated genes，DMG）和GSE136906中的差异表达基因（differently expressed genes，DEG），即寻找P<0.05相关基因并记录，将这些基因纳入WGCNA分析。
1.3 WGCNA构建及临床相关性分析
使用R语言软件中的“FlashClust”软件包对样本进行聚类分析。使用“pickSoftThreshold”函数来调节参数β的权重以尽量符合无尺度网络。使用WGCNA软件包将有相关性和相邻关系的DMG计算成为拓扑重叠矩阵（opological overlap matrix， TOM）并计算其相应的相异度1-TOM。使用1-TOM作为距离度量，进行分层聚类以识别模块。设定模块内最少的基因个数为30个，将高度相似的模块通过聚类标记并合并。使用“plotDendroAndColors”函数对基因模块进行可视化，并选取模块内基因绘制热图。将临床特征和模块内的基因联合分析，寻找与瘢痕组织密切相关的模块并探究模块内基因的生物学意义，对生成模块与临床特征之间的相关性热图进行聚类。
1.4 模块内基因功能富集分析
使用Metascape数据库和基因探针富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）软件对模块内的基因进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析和注释。
1.5 模块内基因甲基化状态的探究
基于瘢痕组织mRNA数据集GSE136906及其甲基化数据集GSE137134属于同一批次的样本，本研究利用数据集GSE136906探究模块内基因的甲基化状态。使用Funrich软件将模块内高甲基化状态的基因与低表达的基因取交集，将模块内低甲基化状态的基因与高表达的基因取交集，在交集内的基因是具有异常甲基化状态的基因。
1.6 统计学处理
依据受试者操作特征（ROC）曲线下面积，评估基因的诊断价值。使用数据集GSE136906及GSE108110进行机器学习，将这2个数据集内异常甲基化基因的表达量依次纳入SVM模型并进行标准化，构建SVM分类器，使用交叉验证的方法选取惩罚参数c和核函数参数g，随机选取2/3的样本作为训练集，其余1/3则作为验证集，当SVM分类器的效能达到90%时则不再纳入新基因。
使用SPSS 22.0、GraphPad Prism 8统计软件进行数据处理及统计学分析，使用Matlab软件进行支持向量机模型构建，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 WGCNA网络构建及临床相关性分析
从数据集GSE136906中筛选出1 061个DEG，见图1。从数据集GSE137134中筛选出16 141个DMG。聚类结果显示没有明显离群的样本，因此2个数据集中12个样本均被纳入共表达网络。“pickSoftThreshold”函数的结果显示，当权重参数β=9时，log（k）与log ［p（k）］之间相关系数的平方>0.9，k表示节点的连接度，p（k）表示WGCNA网络具有无标度网络的特征。选取软阈值β=9来构建WGCNA网络（图2）。模块的相关性热图与聚类分析展示在图3中。筛选后得到10个相应的模块，临床相关性结果显示棕色模块与瘢痕组织形成相关性较高（图4），该模块内共有2 646个基因。在所有相关系数>0.7的模块中，棕色模块内基因数目最多，因此选择该模块进行进一步研究。
1 GSE136906数据集中烧伤后瘢痕和正常组织的差异表达基因火山图注： P-value为差异表达分析后未经校正的P值，Fold change为瘢痕组织与正常组织差异表达倍数；图中绿色为低表达且差异有统计学意义的基因，红色为高表达且差异有统计学意义的基因,黑色为差异无统计学意义的基因
3 加权基因共表达网络分析网络模块之间的相互作用注：MEgreen、MEbrown、MEturquoise、MEmagenta、MEpink、MEblack、MEyellow、MEblue、MEred分别表示绿、棕、蓝绿、洋红、粉、黑、黄、蓝、红色模块；图中横向刻度值为各模块聚类分析相对聚类距离；图中纵向刻度值为数据模块色值
4 烧伤后瘢痕组织临床特征与模块之间的关联注：图左侧标注为加权基因共表达网络分析结果所示颜色模块名称；模块中数据表示对应加权基因共表达网络分析模块与临床性状的相关性系数以及其对应P值，括号内为P值2.2 棕色模块中基因功能富集分析
GO分析结果显示，模块内的基因主要富集在“α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑-丙酸酯选择性谷氨酸受体活性的调控”“雄激素受体信号通路的调控”等，见图5A。KEGG通路富集分析结果显示，模块内的基因主要与“细胞因子-细胞因子受体相互作用”“过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路”等相关，见图5B。Metascape分析结果显示，模块内基因主要富集在“急性粒细胞白血病”“半胱氨酸型内肽酶抑制剂的活性”“胰岛素分泌的正调节”等方面，见图6。富集分析结果表明，这些基因可通过细胞因子受体、胰岛素受体等调节瘢痕组织。
5 对烧伤后瘢痕组织相关性高的模块通过基因探针富集分析进行基因功能和通路分析。5A.基因本体论功能富集；5B.京都基因与基因组百科全书功能富集注：图5A中的绿、棕、蓝、黑、浅棕、紫色曲线分别表示对核因子κB导入细胞核的负向调节、对白细胞介素1产生的正向调节、对α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑-丙酸酯选择性谷氨酸受体的活性调控、雄激素受体信号通路调控、脂肪酸氧化的调控、泛酸样蛋白结合酶的调节通路，图5B中的绿、棕、蓝、黑、浅棕色曲线分别表示细胞因子-细胞因子受体的相互作用、Janus激酶/信号转导与转录激活子信号通路、泛酸和辅酶A生物合成、过氧化物酶体增殖物激活受体信号途径、转化生长因子β信号途径
6 对烧伤后瘢痕组织相关性高的模块通过Metascape数据库进行基因功能和通路分析。6A.基因本体论功能富集；6B. 京都基因与基因组百科全书功能富集注：P-value为差异表达分析后未经校正的P值；图6A的红、蓝、绿、紫、橙、黄、棕、浅紫、灰、浅绿、浅黄、浅紫、浅橙色圆点分别与图6B从上至下的条带一一对应，依次表示急性粒细胞白血病、半胱氨酸型内肽酶抑制剂的活性、胰岛素分泌的正调节、突触膜、脂肪细胞分化、高尔基体膜、参与免疫反应的水解酶激活、溶酶体膜、参与免疫反应的白细胞激活、核包膜、神经发生正向调节、中毒反应、心脏发育通路2.3 棕色模块内基因甲基化状态
共有35个具有异常甲基化状态的基因，其中的高表达-低甲基化基因21个（图7A、7B），低表达-高甲基化基因14个（图7C、7D）。
7 烧伤后瘢痕组织差异表达甲基化基因的热图。7A.21个高表达-低甲基化基因的热图；7B.14个低表达-高甲基化基因的热图注：“type”表示组织类型，“N”表示正常组织，“S”表示瘢痕组织2.4 统计分析结果
ROC曲线分析结果显示，CCR2、LMO7、STEAP4、NNAT、TCF7L2、ZC3H12B等基因具有较好的瘢痕诊断效能，其曲线下面积（AUC）值居于前列。见表2。
表2 烧伤后瘢痕组织与正常组织异常甲基化基因受试者操作特征曲线下面积及P值基因 曲线下面积 P值 CCR2 0.972 <0.001 LMO7 0.972 0.011 STEAP4 0.972 <0.001 NNAT 0.944 <0.001 TCF7L2 0.944 0.003 ZC3H12B 0.944 0.010 AMPD3 0.917 <0.001 BTBD17 0.917 0.039 PRICKLE1 0.917 <0.001 将这些基因按照AUC值从大到小依次纳入SVM模型中，当纳入CCR2、LMO7、STEAP4、NNAT和TCF7L2这5个基因时，惩罚参数c和核函数参数g都<0.01，此时构建的分类器模型分类准确率为93.3%，表明上述基因有较好的分类功能（图8）。
8 烧伤后瘢痕组织差异表达甲基化基因的数据展示及5个差异甲基化基因可视图。8A、8B、8C、8D、8E、8F.分别为数据的整体展示及TCF7L2、NNAT、LMO7、CCR2和STEAP4基因的分维可视化图3. 讨论
烧伤是临床上常见的疾病，其中相当一部分患者为深Ⅱ度及以上烧伤。瘢痕是烧伤后康复期患者最常见的并发症之一，该疾病会严重影响患者的外貌和生活质量。因此，探究烧伤后瘢痕组织的形成机制并寻找潜在的治疗靶点对改善烧伤患者的预后具有重要意义。本研究利用WGCNA分析寻找与烧伤后瘢痕形成相关的基因模块，并探究了模块内的基因生物功能和甲基化状态，该研究为治疗烧伤后瘢痕提供了有意义的临床参考价值。
根据富集分析的结果，棕色模块内的基因具有“雄激素受体信号通路的调控”功能，因此本研究认为雄激素受体在瘢痕组织生成过程中具有一定作用；且由于DNA甲基化状态的改变，该通路状态发生改变。而Schierle等［9］研究结果显示，雄激素受体DNA的含量在瘢痕组织与正常组织之间具有显著差异；同时指出抗雄激素物质可通过竞争结合雄激素受体导致瘢痕组织中Ⅰ型前胶原mRNA低表达，因此本研究认为抗雄激素物质具有治疗瘢痕的潜力。“细胞因子-细胞因子受体相互作用”在KEGG分析中被富集到，研究表明多种细胞因子如血管源性生长因子、IL家族等对瘢痕生成有重要影响［10, 11, 12, 13］。因此本研究认为模块内的基因可调节细胞因子受体，与微环境内的细胞因子相互作用并诱导瘢痕组织的形成。Metascape数据库的分析显示，“胰岛素分泌的正调节”被显著富集，表明这些异常甲基化的基因可能导致胰岛素相关通路的改变。因此本研究认为胰岛素在瘢痕生成方面具有重要作用，Hallam等［14］进行的一项随机对照实验显示，皮下注射胰岛素可减少瘢痕产生。因此，本研究认为胰岛素注射也可作为瘢痕治疗的潜在疗法。
在棕色模块内共显示了35个异常甲基化基因，其中CCR2、LMO7、STEAP4、NNAT和TCF7L2具有良好的瘢痕诊断效能并被纳入到SVM模型中。CCR2编码单核细胞趋化蛋白-1，Frik等［15］研究显示CCR2敲除小鼠脑损伤后单核细胞浸润减少且瘢痕形成减少。本研究中观察到瘢痕组织中CCR2是高表达的，推测CCR2可诱导瘢痕产生，是瘢痕治疗的潜在靶点。本研究结果显示LMO7在瘢痕组织中高表达，推测LMO7可促进瘢痕组织产生。Xie等［16］研究表明LMO7由TGF-β诱导并通过TGF-β途径负反馈调节在伤口愈合和瘢痕生成中发挥重要作用，这与本研究结果一致。STEAP4、NNAT和TCF7L2则未见相应报道，其在瘢痕产生中的作用可能需要进一步实验研究进行验证。
总之，本研究通过WGCNA初步分析了烧伤后瘢痕产生的分子机制和异常甲基化基因，结果显示基因CCR2、LMO7、STEAP4、NNAT和TCF7L2在瘢痕形成中具有重要作用，可作为治疗的潜在靶点。
唐黎珺：实验设计与操作、数据收集以及论文撰写；李笑眉、张筱薇：数据整理、统计学分析；罗艺、徐刚：研究指导、论文修改、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 2种富血小板纤维蛋白膜片微观结构 场发射扫描电子显微镜×5 000。1A.富白细胞血小板纤维蛋白膜片可见致密的纤维蛋白网状结构；1B.改良型富血小板纤维蛋白膜片可见疏松的纤维蛋白网状结构
2 2组小鼠L929成纤维细胞划痕后各时间点划痕情况 光学显微镜×200。2A、2B.分别为富白细胞血小板纤维蛋白（L-PRF）组和改良型富血小板纤维蛋白（A-PRF）组划痕后0 h（即刻），划痕面积相近；2C、2D.分别为L-PRF组和A-PRF组划痕后24 h，图2C剩余划痕面积大于图2D
3 3组裸鼠深Ⅱ度烧伤创面治疗各时间点愈合情况。3A、3B、3C.分别为生理盐水组治疗4、7、14 d创面情况，图3A创面湿润、焦痂下较多渗液、创缘红肿，图3B创面仍有少量渗液，图3C创面仍有少量焦痂覆盖、未见脱落迹象；3D、3E、3F.分别为富白细胞血小板纤维蛋白组治疗4、7、14 d创面情况，图3D相较图3A创面相对干燥，图3E创面被焦痂覆盖，图3F创面表面痂皮大部分脱落；3G、3H、3I.分别为改良型富血小板纤维蛋白组治疗4、7、14 d创面情况，图3G相较图3D创面渗液少，图3H创面干燥，图3I创面趋于愈合
4 3组裸鼠深Ⅱ度烧伤创面治疗各时间点组织病理学观察 Masson×200。4A、4B、4C.分别为生理盐水组治疗4、7、14 d创面胶原沉积情况，图4A、4B可见少量胶原新生，图4C中胶原排列疏松、分布不均；4D、4E、4F.分别为富白细胞血小板纤维蛋白组治疗4、7、14 d创面胶原沉积情况，图4E胶原新生较图4D增多，图4F胶原排列整齐、分布均匀；4G、4H、4I.分别为改良型富血小板纤维蛋白组治疗4、7、14 d创面胶原沉积情况，图4G、4H中胶原分别较图4D、4E致密，图4I相比图4C、4F新生胶原数量更多，排列有序、分布均匀致密且完整度高，未见胶原过度沉积
5 3组裸鼠深Ⅱ度烧伤创面治疗各时间点CD31阳性细胞（棕色）情况 二氨基联苯胺×200。5A、5B、5C.分别为生理盐水组治疗4、7、14 d创面CD31阳性细胞情况，图5C中CD31阳性细胞数明显多于图5A、5B；5D、5E、5F.分别为富白细胞血小板纤维蛋白组治疗4、7、14 d创面CD31阳性细胞情况，数量分别较图5A、5B、5C多；5G、5H、5I.分别为改良型富血小板纤维蛋白组治疗4、7、14 d创面CD31阳性细胞情况，图5I中CD31阳性细胞数明显多于图5C、5F
表1 2组富血小板纤维蛋白培养各时间点上清液中生长因子释放浓度比较（pg/mL，
组别 样本数 PDGF-AB VEGF 1 d 3 d 7 d 14 d 1 d 3 d 7 d 14 d L-PRF组 3 2 594±133 3 859±269 a 4 841±188 a 5 363±165 a 124±12 153±10 a 172±9 a 185±8 a A-PRF组 3 3 310±171 5 123±167 a 6 194±252 a 6 951±473 a 161±22 199±6 a 235±8 a 265±6 a t值 5.73 6.93 7.45 5.49 2.57 6.97 8.97 13.64 P值 0.005 0.002 0.002 0.005 0.062 0.002 0.001 <0.001 注：L-PRF为富白细胞血小板纤维蛋白，A-PRF为改良型富血小板纤维蛋白，PDGF-AB为血小板衍生生长因子AB，VEGF为血管内皮生长因子；PDGF-AB、VEGF处理因素主效应， F值分别为109.04、313.26， P值均<0.001；时间因素主效应， F值分别为213.26、52.41， P值均<0.001；两者交互作用， F值分别为3.71、3.58， P值分别为0.043、0.047；与组内前一时间点比较， a P<0.05 
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表2 3组裸鼠深Ⅱ度烧伤创面治疗各时间点愈合率比较（%，
组别 样本数 4 d 7 d 14 d 生理盐水组 3 12.9±2.4 26.0±2.0 39.4±3.2 L-PRF组 3 19.8±2.6 32.4±3.3 57.5±4.5 A-PRF组 3 32.9±4.8 54.7±4.5 81.0±6.2 F值 26.03 58.36 56.33 P值 0.001 <0.001 <0.001 P 1值 0.026 0.047 0.005 P 2值 0.003 0.001 0.001 P 3值 0.014 0.002 0.006 注：L-PRF为富白细胞血小板纤维蛋白，A-PRF为改良型富血小板纤维蛋白；时间因素主效应， F=290.35， P<0.001；处理因素主效应， F=98.71， P<0.001；两者交互作用， F=13.37， P<0.001； P 1值、 P 2值分别为生理盐水组与L-PRF组、A-PRF组各时间点比较所得； P 3值为L-PRF组与A-PRF组各时间点比较所得
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表3 3组裸鼠深Ⅱ度烧伤创面治疗各时间点CD31阳性细胞百分比比较（%，
组别 样本数 4 d 7 d 14 d 生理盐水组 3 12.1±1.2 25.2±3.1 45.8±3.8 L-PRF组 3 20.3±3.3 37.5±2.3 63.1±1.3 A-PRF组 3 32.8±4.6 53.6±5.4 80.3±2.3 F值 29.84 41.44 124.02 P值 0.001 <0.001 <0.001 P 1值 0.015 0.005 0.002 P 2值 0.002 0.001 <0.001 P 3值 0.018 0.009 <0.001 注：L-PRF为富白细胞血小板纤维蛋白，A-PRF为改良型富血小板纤维蛋白；时间因素主效应， F=355.10， P<0.001;处理因素主效应， F=160.29， P<0.001;两者交互作用， F=3.43， P=0.030； P 1值、 P 2值分别为生理盐水组与L-PRF组、A-PRF组各时间点比较所得； P 3值为L-PRF组与A-PRF组各时间点比较所得
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