间充质干细胞（MSC）因其强大的增殖、再分化潜能被广泛运用于创面修复领域，但是当前将MSC用于治疗创面仍存在诸多局限，如细胞归巢能力弱、存活率低、存在恶性分化风险等，因而寻找更加安全可行的替代疗法成为关键。MSC的组织修复功能主要依赖其旁分泌机制，且外泌体为主要功能单位。研究表明将MSC外泌体（MSC-Exo）运用于动物创面可取得良好效果 ^{［ 1］} ，有望替代亲本MSC。目前外泌体在创面修复领域的应用仍处于萌芽阶段。研究表明亲本MSC生存环境会影响外泌体生物功能，外泌体半衰期会影响创面修复疗效，经修饰的外泌体可满足特定的治疗需要。基于此，如何优化外泌体治疗方案，提高其创面修复疗效，已成为近期备受关注的热点。本文就提高MSC-Exo创面修复疗效的策略，从预处理亲本MSC、水凝胶生物支架装载外泌体、工程化外泌体3个方面进行综述，以期为后续临床研究奠定基础。

1.   MSC-Exo修复创面的研究现状

MSC-Exo是由MSC分泌的一种直径在30~150 nm范围的同质性细胞外囊泡，MSC-Exo可与靶细胞融合，递送脂质、蛋白质、核酸等生物活性因子，促进组织修复再生 ^{［ 1］} 。研究表明，MSC-Exo是MSC的主要有效旁分泌成分，其生物学效应几乎等同于亲本MSC ^{［ 2］} 。MSC-Exo在创面修复的3个阶段均发挥重要的作用。在炎症期MSC-Exo可下调组织中诱导型NOS和环氧合酶水平，上调抗炎因子如IL-10、IL-4、TGF-β等以减轻创面炎症。MSC-Exo也可促进巨噬细胞向抗炎M2表型转化，并调节B细胞、T细胞及自然杀伤细胞活动，发挥免疫调节作用 ^{［ 2］} 。在增殖阶段，MSC-Exo可释放多种血管生成因子及微小RNA（miR）促进血管形成 ^{［ 3］} 。另外，MSC-Exo还可通过激活Wnt/β-连环蛋白 ^{［ 4］} ，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和MAPK/胞外信号调节激酶 ^{［ 5］} 等信号通路，促进血管形成。在重塑阶段，MSC-Exo通过阻止Fb分化成肌Fb，调节基质金属蛋白酶3与基质金属蛋白酶抑制剂1比例改善ECM重塑，从而抑制瘢痕增生 ^{［ 6］} 。

MSC-Exo与MSC相比，具有以下优势：（1）便于储存与运输；（2）可以穿透血脑屏障；（3）可通过工程化改造获得特定功能特性；（4）较低的免疫原性和肿瘤转化风险；（5）给药浓度、剂量更加可控，安全性评估方法类似于传统药物 ^{［ 3］} 。尽管目前针对MSC-Exo的研究多局限于动物实验，但MSC-Exo在临床运用于创面修复仍具有广阔的研究前景。因此如何进一步挖掘外泌体的治疗潜力，提高外泌体修复创面疗效，更好地满足临床治疗需求，已成为颇为重要的研究方向。

2.   预处理亲本MSC

MSC-Exo具有的成分及发挥的生物学作用，与亲本MSC所处的微环境密切相关。体外预处理亲本MSC可提高MSC-Exo治疗潜力，具体方式如下。

2.1   药物预处理

药物预处理MSC可改善MSC旁分泌功能，提高MSC-Exo修复创面的疗效。有研究报道LPS刺激人脐带MSC增加了脐带MSC-Exo的产生，且经过LPS预处理的脐带MSC-Exo比未经处理的脐带MSC-Exo具有更好的调节巨噬细胞平衡的能力；糖尿病大鼠创面研究结果显示，预处理的脐带MSC-Exo可递送 let- 7b，从而调节巨噬细胞向M2抗炎表型转化，最终促进创面修复 ^{［ 7］} 。类似地，有学者报道经褪黑素预处理的人骨髓MSC-Exo可通过激活人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）/Akt信号通路促进巨噬细胞向M2型极化，以缩短慢性创面炎症期，从而加速糖尿病动物模型创面修复过程 ^{［ 8］} 。另外，经一些药物预处理的MSC-Exo具有更强的促血管生成能力。吡格列酮作为噻唑烷二酮类降糖药，在炎症调节与抗氧化应激中发挥组织保护作用。有研究报道吡格列酮预处理的大鼠骨髓MSC-Exo可显著促进人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）的增殖，体内实验表明经吡格列酮预处理的骨髓MSC-Exo可通过激活PI3K/Akt信号通路，促进糖尿病大鼠创面血管生成，加速创面修复进程 ^{［ 9］} 。类似地，研究者分别从未经预处理的人骨髓MSC和经阿托伐他汀（ATV）预处理的人骨髓MSC培养基中分离出外泌体，比较二者作用于糖尿病大鼠创面的疗效。与未经预处理的人MSC-Exo组相比，经ATV预处理的人骨髓MSC-Exo组的大鼠创面显示出更好的再上皮化和血管成熟水平，且创面愈合率更高 ^{［ 10］} 。此外，有研究表明经去铁胺预处理的人骨髓MSC-Exo在创面修复中展现出较未处理人骨髓MSC-Exo更优异的促血管生成能力。体外实验表明，去铁胺预处理人骨髓MSC-Exo将更多的miR-126输送到HUVEC中，miR-126可以靶向调节，从而激活PI3K/Akt信号通路促进血管形成 ^{［ 11］} 。以上研究表明药物预处理MSC-Exo可更好地调节巨噬细胞向抗炎表型转化，促进创面血管新生，提高创面修复效率。然而，药物预处理MSC改善其衍生外泌体生物活性的详细机制仍需研究者进一步探索。

2.2   低氧预处理

标准细胞培养的常氧张力指体积分数21%氧气的大气压，迄今为止，各种研究中用于预处理MSC的氧气体积分数为1%~5%，即低氧预处理 ^{［ 12］} 。低氧环境可促进MSC的缺氧诱导因子表达上调，激活下游调控细胞周期、凋亡、分化等的缺氧敏感基因的表达，导致MSC-Exo具有更优越的生物学功能 ^{［ 12］} 。低氧培养显著提高了MSC-Exo的总核酸及蛋白含量，例如上调一些miR及长链非编码RNA的含量，可提高外泌体治疗疾病的潜力 ^{［ 13］} 。在创面修复方面，许多研究表明与常氧培养的MSC-Exo相比，经低氧预处理的MSC-Exo促进创面修复的能力更强 ^{［ 14, 15］} 。有研究报道，缺氧预处理的人脐带MSC-Exo通过递送miR-125b靶向调节 TP53INP1促进HUVEC存活和迁移，加速小鼠全层皮肤缺损创面修复过程，其疗效比常氧条件下培养的人脐带MSC-Exo更好 ^{［ 14］} 。类似地，有研究报道与常氧条件下培养的人脂肪MSC-Exo相比，低氧预处理人脂肪MSC-Exo可加速糖尿病裸鼠创面的高质量愈合。体外实验表明缺氧预处理人脂肪MSC-Exo可通过PI3K/Akt信号通路促进人皮肤Fb增殖并调节胶原合成，诱导Fb产生趋化因子从而促进血管新生。进一步糖尿病裸鼠创面研究表明，经低氧预处理的人脂肪MSC-Exo治疗的裸鼠创面组织中TGF-β、VEGF和血小板衍生生长因子表达明显增加，血管生成率提高，且低氧预处理人脂肪MSC-Exo可调节创面ECM重塑，提高创面愈合质量 ^{［ 15］} 。因而低氧预处理MSC是提高MSC-Exo创面修复疗效的有效措施。

2.3   物理因素干预

磁性纳米粒子是一类高饱和磁化强度、超顺磁性、生物相容性好和低生物毒性的纳米材料。它们可以通过静磁场对细胞施加持续的弱磁力，以帮助组织再生 ^{［ 16］} 。有学者使用四氧化三铁纳米粒子联合静磁场刺激来预处理人骨髓MSC获得外泌体。研究表明，与未处理的骨髓MSC-Exo相比，经静磁场预处理的骨髓MSC-Exo可通过促进血管生成和改善Fb功能，从而加速大鼠全层皮肤缺损创面的修复，其机制与骨髓MSC-Exo中上调的miR-21-5p靶向抑制 SPRY2，进而激活PI3K/Akt信号通路有关 ^{［ 17］} 。另外，光驱动法通过激活特定的光敏剂或提供热能来操纵细胞行为，是一种非侵入式提高组织再生能力的策略 ^{［ 18］} 。研究报道，蓝光（波长455 nm）光照可通过增强人脐带MSC-Exo促血管生成能力，从而促进小鼠深Ⅱ度创面修复，其机制与蓝光处理的脐带MSC所提取的MSC-Exo含有更高水平的miR-135b-5p和miR-499a-3p，从而拥有更强的促血管生成能力有关 ^{［ 19］} 。目前关于物理干预MSC提升MSC-Exo生物功能的研究较少，如何控制最适条件，提高预处理效率，仍需进一步研究。

2.4   其他预处理方式

新近研究表明炎症因子如IL-1β、IL-6、γ干扰素和TNF-α预处理可促进MSC分泌免疫调节因子，调节靶组织免疫行为，例如抑制补体系统激活、引导巨噬细胞向M2表型分化、抑制细胞毒性T细胞增殖和增加调节性T细胞的数量等 ^{［ 20］} 。有学者报道人牙龈组织来源MSC-Exo可通过诱导巨噬细胞向M2抗炎表型极化促进小鼠皮肤创面修复，且TNF-α预处理可增加人牙龈MSC分泌外泌体数量，增强MSC-Exo抗炎作用 ^{［ 21］} 。以上研究证明炎症因子预处理可增强MSC-Exo抗炎特性，可能成为促进创面修复的手段，但该方法当前在动物创面模型上的研究较少，尚需更多证据支持。

另外，三维培养MSC有助于提高MSC-Exo的治疗潜力。与传统贴壁细胞培养相比，三维球状细胞聚集体或球状体培养能更好地重现体内环境，可提高MSC分化潜能，提升其在免疫调节、血管生成、抗纤维化方面的能力。更重要的是，基于微载体或中空纤维生物反应器的三维培养有助于MSC-Exo的规模化生产 ^{［ 22］} 。有研究者基于中空纤维生物反应器三维培养生产人脐带MSC-Exo，得出与二维培养相比，三维培养系统可将外泌体的总产量提高至原来的19.4倍。进一步体内实验表明经三维培养脐带MSC-Exo治疗的急性肾损伤小鼠血清中炎症因子IL-6和TNF-α水平明显低于经二维培养治疗的小鼠，表明三维培养脐带MSC-Exo具有更强的抗炎功效 ^{［ 23］} 。此外，有研究比较了传统二维培养与三维培养人脐带MSC产生的外泌体用于软骨修复的疗效。结果表明，2种外泌体均能刺激人软骨细胞增殖、迁移和基质合成，然而三维培养MSC-Exo作用更强 ^{［ 24］} 。另外，研究人员在无血清培养基中三维培养人脐带MSC并提纯衍生的外泌体，体外实验表明三维培养人脐带MSC-Exo可显著提高小鼠Fb的迁移和增殖能力 ^{［ 25］} 。尽管在创面修复方面，目前尚缺乏三维培养MSC-Exo的相关研究，但这是一个值得深入探讨的新方向。

3.   水凝胶生物支架装载外泌体

尽管外泌体治疗创面具有很大的潜力，然而施加于创面的外泌体将很快被机体清除，外泌体在体内的低保留率增加了其治疗成本，限制了外泌体疗法的临床应用。基于生物支架材料的外泌体递送和保留系统可在不影响外泌体生物功能的情况下延长其在创面的作用时间，开发安全稳定的外泌体递送生物支架系统已成为当前的研究热点。近年来，水凝胶体系因具有非黏性、延展性、活组织相似性及可为细胞提供持续湿润环境等特点而广受学者青睐 ^{［ 26］} 。研究表明，装载于水凝胶系统中的人脂肪MSC-Exo可维持更长时间的生物活性，且在治愈创面方面较单独使用外泌体或水凝胶疗效更好 ^{［ 27, 28］} 。近年来用于负载MSC-Exo帮助创面修复的水凝胶包括以下几类：Pluronic F-127（PF-127）类、甲基纤维素壳聚糖类、海藻酸盐类等。PF-127是一种热敏性水凝胶，已被美国食品药品监督管理局批准用于人体。在PF-127中使用MSC-Exo可提高外泌体递送效率，保持MSC-Exo的生物活性，并优化MSC-Exo的性能。研究表明，负载人MSC-Exo的PF-127水凝胶可通过促进再上皮化、刺激血管新生、调节胶原合成、增加皮肤屏障蛋白表达，加速皮肤创面修复 ^{［ 27］} 。然而PF-127亲水性的特点使其易被体液侵蚀，难以从创面剥离，增加了感染的风险，需加入合适的辅料以提升其性能。有学者开发了一种由PF-127、氧化透明质酸和聚-ε-L-赖氨酸组成的可注射多肽基抗菌水凝胶，并证明负载人脂肪MSC-Exo的该种抗菌水凝胶可以提高糖尿病小鼠创面愈合率，且其缓释特性有助于保护皮肤附件完整，提高创面愈合质量 ^{［ 28］} 。

另外，基于天然多糖，如甲基纤维素、壳聚糖及其衍生物的多功能复合水凝胶，因良好的生物相容性和抗菌性、无毒性作用或不良反应及对环境刺激敏感和受控的药物释放特性，被认为是促进创面修复的新型材料。有研究者构建了一种可注射的负载人胎盘MSC-Exo的甲基纤维素-壳聚糖复合水凝胶，并证明该复合水凝胶可通过促进血管生成和抑制细胞凋亡促进糖尿病小鼠创面修复，且疗效比单独使用外泌体或水凝胶更好 ^{［ 29］} 。类似地，有研究者设计了一种负载大鼠骨髓MSC-Exo的乙基壳聚糖-二醛羧甲基纤维素水凝胶用于大鼠糖尿病创面。结果表明，该复合水凝胶可有效促进血管新生，诱导巨噬细胞向M2抗炎表型转化，从而促进糖尿病创面修复 ^{［ 30］} 。

此外，海藻酸盐是一种来源于褐藻或细菌的线性阴离子多糖，因其盐链具有游离羧基，可以赋予水凝胶良好的导电性而走入研究者视野。海藻酸盐基水凝胶具备优异的生物相容性和良好的液体吸收能力，特别是可以调节巨噬细胞功能，加速慢性创面修复的特性，使其成为备受关注的新型创面敷料 ^{［ 31］} 。有研究报道将大鼠脂肪MSC-Exo封装于海藻酸盐水凝胶中可促进血管形成及胶原蛋白合成，加速大鼠皮肤创面闭合 ^{［ 32］} 。综上，外泌体搭载水凝胶体系给药可有效提高创面修复疗效，如何依据实际需求设计智能化的自愈水凝胶负载MSC-Exo是今后亟待探讨的方向。

4.   工程化外泌体

工程化外泌体目前尚无明确定义，可理解为根据治疗目的而对外泌体进行修饰、改造，提高其功能特性而获得外泌体的特称。对亲本MSC进行修饰，赋予外泌体新的特征；或利用生物工程手段将特定核酸、药物、蛋白质装载于外泌体，是近年来提高外泌体创面修复疗效的新方式。

4.1   亲本MSC修饰

利用病毒、质粒、脂质体将特定核酸如环状RNA、miR或其模拟物转染至亲本MSC，提取富含该核酸的MSC-Exo治疗创面可获得较未经转染修饰MSC-Exo更好的疗效。研究者利用腺病毒系统将 Akt基因转染到人脐带MSC后收集外泌体，与未转染的人脐带MSC-Exo相比，经转染的人脐带MSC-Exo加速了HUVEC的增殖和迁移，并促进管状结构形成 ^{［ 33］} 。另外，经miR-126-3p模拟物转染修饰的人脂肪MSC所衍生的外泌体可释放miR-126-3p。miR-126-3p可通过调节磷脂酰肌醇酶调控亚基2促进人Fb与HUVEC增殖 ^{［ 34］} 。此外，环状RNA同源域相互作用蛋白激酶3（ciR-HIPK）可通过调节叉头框蛋白O3a基因抑制细胞损伤与焦亡。经ciR-HIPK模拟物mmu_circ_0001052修饰的小鼠脂肪MSC获得的MSC-Exo，可通过miR-106a-5p调节FGF-4/p38 MAPK信号通路促进HUVEC增殖，从而促进小鼠糖尿病足创面修复，且疗效优于未经修饰的脂肪MSC-Exo ^{［ 35］} 。类似地，将经mmu_circ_0000250修饰人脂肪MSC获得的外泌体用于糖尿病小鼠创面可获得比野生型外泌体更好的疗效，其机制与经修饰的外泌体可释放mmu_circ_0000250，从而调节miR-128-3p/去乙酰化酶sirtuin轴有关 ^{［ 36］} 。

4.2   外泌体装载系统

由于外泌体具备脂质双层膜结构且免疫原性低、生物相容性高，众多研究者将注意力转移到将外泌体作为新型药物输送系统。通过物理方法如电穿孔、超声处理、挤出、冷冻/解冻、透析或化学修饰的方法将蛋白质、肽、核酸和药物等治疗剂封装于载体外泌体，运用于疾病治疗 ^{［ 37］} 。研究人员通过电穿孔将miR-21-5p模拟物加载至人脂肪MSC-Exo中，得出尽管游离的miR-21-5p模拟物和脂肪MSC-Exo均可促进糖尿病创面修复，但装载miR-21-5p模拟物的MSC-Exo可以更好地抑制炎症，促进再上皮化、血管成熟与基质重塑，从而加速创面修复进程 ^{［ 38］} 。另外，有研究者使用改良氯化钙转染法将miR-155抑制剂封装在人骨髓MSC-Exo中，并证明载有miR-155抑制剂的人骨髓MSC-Exo可通过增强KC迁移、减少炎症因子、增加血管生成和再上皮化促进糖尿病小鼠创面修复，且创面闭合率较应用不负载miR-155抑制剂的人骨髓MSC-Exo的创面高 ^{［ 39］} 。此外，将工程化MSC-Exo与水凝胶等生物支架材料相结合，将赋予MSC-Exo长期治疗效果，为工程化MSC-Exo治疗创面开启一扇崭新的大门 ^{［ 40］} 。

工程化外泌体造价高，无论是操纵亲本MSC还是将MSC-Exo直接装载药物，二者推广至临床都将面临修饰装载效率低、缺乏规模化生产方案等问题。然而工程化外泌体使得靶向精准治疗成为可能，是外泌体治疗领域重要的里程碑。

5.   总结与展望

MSC-Exo在创面修复领域具有广阔的应用前景，然而，目前外泌体的研究多基于动物模型实验，仍需进一步开展以人为对象的临床研究，以清楚地证明MSC-Exo修复创面的潜力。为促进这一进程，近年来提高外泌体治疗潜力的策略，如预处理亲本MSC、水凝胶生物支架装载外泌体、工程化外泌体等得到发展并获得良好效果。然而，如何控制预处理条件、标准化水凝胶材料制造程序、确保工程化外泌体的治疗效力及安全性，尚需要进一步探讨。此外，各类MSC-Exo的异质性不容忽视，其作用于创面修复的机制及疗效仍需深入探讨，并且如何确定最佳给药方式及剂量，如何规模化生产符合临床需求的MSC-Exo有待进一步探索。