Influence of pH value on tube formation of human dermal microvascular endothelial cells and its molecular mechanism
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摘要:
目的 探讨pH值对人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）成管的影响并研究其分子机制，为促进创面愈合过程中血管新生的研究提供理论依据。 方法 采用实验研究方法。取第4、5代对数生长期HDMEC进行实验，制备pH值分别为6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8的培养液，用其适应性培养细胞（培养方式下同）24 h后进行后续实验。另培养36 h，采用流式细胞仪测定胞质pH值的相对荧光值并对胞质pH值的相对荧光值与培养液pH值进行相关分析。另培养1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 d，采用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖活性。采用Oris TM细胞迁移检测试剂盒检测去掉播种塞后0（即刻）、24、48 h细胞迁移剩余面积。进行三维基质胶细胞成管实验，检测另培养48 h细胞成管的管腔直径。另培养48 h，采用蛋白质印迹法检测细胞中蛋白激酶B（Akt）磷酸化位点473、308的蛋白表达。样本数均为3。对数据行Pearson相关性分析、单因素方差分析、析因设计方差分析、重复测量方差分析与Bonferroni校正。 结果 另培养36 h，与pH值6.4培养液相比，pH值6.8~7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著升高（ P<0.05）；与pH值6.6~7.0培养液相比，pH值7.4~7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著升高（ P<0.05），且pH值6.6培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值明显低于pH值7.0、7.2培养液（ P值均<0.05）；pH值7.6、7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著高于pH值7.2、7.4培养液（ P<0.05）。胞质pH值的相对荧光值与培养液pH值呈显著正相关（ r=0.99， P<0.05）。8种pH值培养液另培养1.5 d细胞增殖活性相近（ P>0.05）。另培养2.5 d，与pH值7.6培养液相比，pH值6.4~6.8培养液培养细胞增殖活性均显著下降（ P<0.05）。另培养3.5 d，与pH值6.4~6.8培养液相比，pH值7.0~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高（ P<0.05）；与pH值7.6培养液相比，pH值7.0~7.4、7.8培养液培养细胞增殖活性均显著下降（ P<0.05）。另培养4.5、5.5 d，与pH值6.4培养液相比，pH值6.8~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高（ P<0.05）；与pH值6.6、6.8培养液相比，pH值7.0~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高（ P<0.05）。另培养4.5 d，pH值7.6培养液培养细胞增殖活性显著高于pH值7.0培养液（ P<0.05）。另培养5.5 d，与pH值7.0培养液相比，pH值7.2~7.6培养液培养细胞增殖活性均显著升高（ P<0.05）；与pH值7.2、7.4培养液相比，pH值7.6培养液培养细胞增殖活性显著升高（ P值均<0.05），pH值7.8培养液培养细胞增殖活性显著降低（ P值均<0.05）。去掉播种塞后0 h，8种pH值培养液培养细胞迁移剩余面积相近（ P>0.05）。去掉播种塞后24 h，与pH值6.4培养液相比，pH值6.6~7.8培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小（ P<0.05）；与pH值6.6、6.8培养液相比，pH值7.0~7.6培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小（ P<0.05）。去掉播种塞后48 h，与pH值6.4、6.6培养液相比，pH值7.0~7.8培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小（ P<0.05）；pH值7.2、7.4培养液培养细胞迁移剩余面积均显著小于pH值6.8、7.0、7.8培养液（ P<0.05），均显著大于pH值7.6培养液（ P<0.05）；pH值7.6培养液培养细胞迁移剩余面积显著小于pH值6.8、7.8培养液（ P值均<0.05）。另培养48 h，pH值7.0、7.2、7.4、7.6、7.8培养液培养细胞成管的管腔直径分别为（5.0±0.5）、（7.6±0.9）、（8.5±0.7）、（11.0±0.8）、（5.3±0.8）μm，均显著长于pH值6.4培养液的（2.8±0.8）μm（ P<0.05）；pH值6.6［（4.2±0.3）μm］、6.8［（4.5±0.6）μm］、7.0、7.8培养液培养细胞成管的管腔直径均显著短于pH值7.6培养液（ P<0.05）。另培养48 h，与pH值6.4、6.6培养液相比，pH值6.8~7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473、308蛋白表达均明显升高（ P<0.05），且pH值6.6培养液培养细胞中Akt磷酸化位点308蛋白表达明显高于pH值6.4培养液（ P<0.05）；与pH值6.8培养液相比，pH值7.0、7.4~7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473蛋白表达均明显升高（ P<0.05）；与pH值7.6培养液相比，pH值7.0~7.4、7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与pH值7.8培养液相比，pH值7.0~7.6培养液培养细胞中Akt磷酸化位点308蛋白表达均明显升高（ P<0.05）。 结论 pH值可调控HDMEC形成毛细血管的管腔直径，该调控作用与Akt的激活密切相关；7.2~7.6为构建组织工程毛细血管的适宜pH值。 Abstract:Objective To explore the influence of pH value on tube formation of human dermal microvascular endothelial cells (HDMECs) and study its molecular mechanism, so as to provide theoretical basis for the study of promoting angiogenesis in the process of wound healing. Methods The experimental study methods were applied. HDMECs of 4 or 5 passages in the logarithmic growth phase were collected for experiments. Culture mediums with pH values of 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, and 7.8 were prepared, and the cells were adaptively cultured (the same culture method below) for 24 h before further experiments being carried out. After another 36 h of culture, the relative fluorescence value of cytoplasmic pH value was measured by flow cytometry, and the correlation analysis between the relative fluorescence value of cytoplasmic pH value and the medium pH value was carried out. After another 1.5, 2.5, 3.5, 4.5, and 5.5 days of culture, the cell proliferation activity was detected with cell counting kit 8. Oris TM cell migration detection kit was used to detect the remaining area of cell migration at 0 (immediately), 24, and 48 h after removing the cell seeding stopper. Three-dimensional stromal gel cell tube formation experiment was carried out to detect the lumen diameter of tube formed by cells after another 48 h of culture. The protein expressions of phosphorylation sites 473 and 308 of protein kinase B (Akt) were detected by Western blotting after another 48 h of culture. The sample number was 3. Data were statistically analyzed with Pearson correlation analysis, one-way analysis of variance, analysis of variance for factorial design, analysis of variance for repeated measurement, and Bonferroni correction. Results After another 36 h of culture, the relative fluorescence values of cytoplasmic pH value of cells cultured in pH 6.8-7.8 mediums were significantly higher than the level in pH 6.4 medium ( P<0.05); compared with those in pH 6.6-7.0 mediums, the relative fluorescence values of cytoplasmic pH value of cells cultured in pH 7.4-7.8 mediums were significantly increased ( P<0.05), and the relative fluorescence value of cytoplasmic pH value of cells cultured in pH 6.6 medium was significantly lower than that in pH 7.0 or 7.2 mediun (with P values all <0.05); the relative fluorescence values of cytoplasmic pH value of cells cultured in pH 7.6 and 7.8 mediums were significantly higher than those in pH 7.2 and 7.4 mediums ( P<0.05). The relative fluorescence value of cytoplasmic pH value was significantly positively correlated with the medium pH value ( r=0.99, P<0.05). The proliferation activity was similar among cells cultured in 8 mediums of different pH values for another 1.5 days ( P>0.05). After another 2.5 days of culture, the proliferation activity of cells cultured in pH 6.4-6.8 mediums was significantly decreased compared with that in pH 7.6 medium ( P<0.05). After another 3.5 days of culture, the proliferation activity of cells cultured in pH 7.0-7.8 mediums was significantly higher than that in pH 6.4-6.8 mediums ( P<0.05); compared with that in pH 7.6 medium, the proliferation activity of cells cultured in pH 7.0-7.4 and 7.8 mediums was significantly decreased ( P<0.05). After another 4.5 or 5.5 days of culture, the proliferation activity of cells cultured in pH 6.8-7.8 mediums was significantly higher than that in pH 6.4 medium ( P<0.05); compared with that in pH 6.6 and 6.8 mediums, the proliferation activity of cells cultured in pH 7.0-7.8 mediums was significantly increased ( P<0.05). After another 4.5 days of culture, the proliferation activity of cells cultured in pH 7.6 medium was significantly higher than that in pH 7.0 medium ( P<0.05). After another 5.5 days of culture, the proliferation activity of cells cultured in pH 7.2-7.6 mediums was significantly increased compared with that in pH 7.0 medium ( P<0.05); the proliferation activity of cells cultured in pH 7.2 and 7.4 mediums was significantly lower than that in pH 7.6 medium (with P values all <0.05) but significantly higher than that in pH 7.6 medium (with P values all <0.05). Immediately after removing the cell seeding stopper, the remaining migration areas were similar among cells cultured in 8 mediums of different pH values ( P>0.05). At 24 h after removing the cell seeding stopper, the remaining migration areas of cells cultured in pH 6.6-7.8 mediums were significantly smaller than the area in pH 6.4 medium ( P<0.05); compared with those in pH 6.6 and 6.8 mediums, the remaining migration areas of cells cultured in pH 7.0 to 7.6 mediums were significantly reduced ( P<0.05). At 48 h after removing the cell seeding stopper, compared with those in pH 6.4 and 6.6 mediums, the remaining migration areas of cells cultured in pH 7.0-7.8 mediums were significantly reduced ( P<0.05); the remaining migration areas of cells cultured in pH 7.2 and 7.4 mediums were significantly smaller than those in pH 6.8, 7.0, and 7.8 mediums ( P<0.05) but significantly larger than the area in pH 7.6 medium ( P<0.05); the remaining migration area of cells cultured in pH 7.6 medium was significantly smaller than that in pH 6.8 or 7.8 medium (with P values all <0.05). After another 48 h of culture, the lumen diameters of tubes formed by cells cultured in pH 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, and 7.8 mediums were (5.0±0.5), (7.6±0.9), (8.5±0.7), (11.0±0.8), and (5.3±0.8) μm, respectively, which were significantly longer than (2.8±0.8) μm in pH 6.4 medium ( P<0.05); the lumen diameters of tubes formed by cells cultured in pH 6.6 ((4.2±0.3) μm), 6.8 ((4.5±0.6) μm), 7.0, and 7.8 mediums were significantly shorter than the diameter in pH 7.6 medium ( P<0.05). After another 48 h of culture, compared with those in pH 6.4 and 6.6 mediums, the protein expressions of Akt phosphorylation sites 473 and 308 of cells cultured in pH 6.8 to 7.8 mediums were significantly increased ( P<0.05). Moreover, the protein expression of Akt phosphorylation site 308 of cells cultured in pH 6.6 medium was significantly higher than that in pH 6.4 medium ( P<0.05); compared with the expression in pH 6.8 medium, the protein expressions of Akt phosphorylation site 473 of cells cultured in pH 7.0 and 7.4-7.8 mediums were significantly increased ( P<0.05); compared with the expression in pH 7.6 medium, the protein expressions of Akt phosphorylation site 473 of cells cultured in pH 7.0-7.4 and 7.8 mediums were significantly decreased ( P<0.05); compared with the expression in pH 7.8 medium, the protein expressions of Akt phosphorylation site 308 of cells cultured in pH 7.0 to 7.6 mediums were significantly increased ( P<0.05). Conclusions pH value can regulate the lumen diameter of HDMEC-formed capillaries, which is closely related to the activation of Akt. 7.2-7.6 is the appropriate pH value for constructing tissue engineered capillaries. -
(1)证实pH值对人真皮微血管内皮细胞形成新生血管管腔的直径具有调控作用，并且此调控作用与蛋白激酶B磷酸化密切相关。
(2)明确7.2~7.6为构建组织工程毛细血管的适宜pH值。
管腔直径直接影响毛细血管的生理功能，其调控机制对于构建功能性组织工程毛细血管具有重要指导意义 ［ 1, 2, 3］ 。若毛细血管管腔直径过小，会影响血液细胞的通过，导致血液细胞和血管内皮细胞损伤 ［ 4］ 。而当管腔直径过大时，组织与血液交换营养物质及代谢产物的无效腔增大，导致组织缺氧和代谢产物积聚；此外血液在扩大的毛细血管腔内形成涡流、淤滞，易形成血栓 ［ 5, 6, 7］ 。然而目前组织工程毛细血管管腔直径的调控机制还未被阐明，尚不能构建管腔直径可控的功能性组织工程毛细血管，极大限制了组织工程的进展 ［ 8］ 。
在创面愈合过程中，肉芽组织表层pH值较低，为5.8~6.0 ［ 9］ ；增殖期肉芽组织的pH值为6.4~7.0；组织重塑期，肉芽组织深层pH值接近于血浆pH值（7.3~7.6）。在肿瘤标本中，靠近肿瘤组织中心（pH值5.8~6.6）的毛细血管管腔较小，甚至没有明确的管腔形成 ［ 10］ ；而靠近肿瘤组织边缘（pH值7.3~7.4）的毛细血管管腔较大 ［ 11］ 。说明周围环境的pH值可能是影响新生毛细血管管腔大小的关键因素之一。然而，pH值对毛细血管形成过程中管腔直径的影响很少被报道，本研究对此进行探讨，希望能为组织工程血管化研究提供参考。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器来源
原代人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）、内皮细胞培养基均购自美国ScienCell公司，细胞计数试剂盒8（CCK-8）细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Oris TM细胞迁移检测试剂盒购自美国Platypus Technologies公司，兔抗人蛋白激酶B（Akt）磷酸化位点308多克隆抗体、兔抗人Akt磷酸化位点473多克隆抗体、兔抗人Akt多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体、pH敏感荧光素2'，7'-二-（2-羧乙基）-5（6）-羧基荧光素乙酰甲酯（BCECF-AM）购自英国Abcam公司，细胞示踪剂5-氯甲基荧光素二乙酸酯购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
iMark型酶标仪、凝胶成像系统购自美国伯乐公司，IX71型倒置相差显微镜购自日本奥林巴斯公司，Cytation3细胞成像微孔板检测系统购自美国伯腾仪器有限公司。
1.2 细胞传代培养及不同pH值培养液配制
取HDMEC，采用完全培养基（含体积分数5%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、体积分数1%内皮细胞生长因子的内皮细胞培养基）于37 ℃、含体积分数5%二氧化碳的培养箱中进行常规培养。每24小时更换1次培养液，采用第4、5代对数生长期的细胞进行后续实验。
在完全培养基、不含血清完全培养基中加入不同浓度的氢氧化钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，制备pH值分别为6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8的培养液和不含血清培养液，用孔径0.22 μm的无菌滤膜过滤，4 ℃保存备用，于每次使用前复测pH值并校准。
1.3 细胞适应性培养
取细胞，分别采用pH值6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8培养液适应性培养24 h后进行后续实验，各实验样本数均为3。培养过程中采用蠕动泵持续对培养皿内的培养液进行更新（5 mL/h），以尽量避免培养液pH值的降低（后续说明不更新情况，未说明者均照此更新处理）。
1.4 检测指标
1.4.1 胞质pH值的相对荧光值及其与培养液pH值的相关性
取各种pH值培养液培养的浓度为2×10 4个/mL的细胞，在6孔板（每孔2.5 mL）中用相应pH值培养液培养24 h（不进行培养液更新），更换相应pH值不含血清培养液培养12 h。即另培养36 h，加入pH敏感荧光素BCECF-AM，常规培养30 min。更换相应pH值培养液，在37 ℃、无二氧化碳的培养箱内培养12 h。常温下以离心半径10 cm、1 000 r/min离心5 min收集细胞，采用流式细胞仪分析胞质pH值的相对荧光值。另对胞质pH值的相对荧光值与培养液pH值进行相关分析。
1.4.2 细胞增殖活性
取各种pH值培养液培养的浓度为2×10 4个/mL的细胞，在96孔板（每孔100 μL）中用相应pH值培养液培养12 h（不进行培养液更新），更换各pH值培养液，之后每3小时换液1次。分别于培养1、2、3、4、5 d，即总另培养1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 d，每孔加入20 μL CCK-8溶液孵育4 h，采用酶标仪检测490 nm波长处吸光度值，以此表示细胞增殖活性。
1.4.3 细胞迁移剩余面积
取各种pH值培养液培养的浓度为2×10 4个/mL的细胞，通过Oris TM细胞迁移检测试剂盒培养板的播种塞侧孔接种于培养板（每孔100 μL）中，用相应pH值培养液培养，待细胞形成融合的单层，去掉播种塞。于细胞成像微孔板检测系统中10倍荧光显微镜下监测细胞示踪剂标记细胞的迁移情况，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）测量去掉播种塞后0（即刻）、24、48 h细胞迁移剩余面积。
1.4.4 细胞成管的管腔直径
取各种pH值培养液培养的浓度为2×10 5个/mL的细胞，与预冷的Matrigel基质胶以1∶1的体积比混合，置于48孔板（每孔250 μL）中常规培养1 h，加入相应pH值培养液100 μL。培养48 h，于100倍倒置相差显微镜下观察细胞成管情况，使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）测量管腔直径。
1.4.5 Akt磷酸化位点473、308的蛋白表达
取各种pH值培养液培养的浓度为2×10 4个/mL的细胞，在6孔板（每孔2 mL）中用相应pH值培养液培养48 h，采用蛋白质印迹法检测Akt磷酸化位点473、308的蛋白表达。一抗为兔抗人Akt多克隆抗体、兔抗人Akt磷酸化位点308多克隆抗体、兔抗人Akt磷酸化位点473多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体（稀释比均为1∶1 000），二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体（稀释比为1∶2 000）。采用凝胶成像系统分析图像，用ImageJ软件对条带进行灰度分析，以GAPDH为内参照，Akt磷酸化位点473、308的蛋白表达以其条带灰度值与Akt条带灰度值比值表示。
1.5 统计学处理
采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，计量资料数据均符合正态分布，以
2. 结果
2.1 胞质pH值的相对荧光值及其与培养液pH值的相关性
8种pH值培养液另培养36 h细胞胞质pH值的相对荧光值总体比较，差异有统计学意义（ F=67.08， P<0.001）。与pH值6.4培养液相比，pH值6.8~7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著升高（ P<0.05）；与pH值6.6~7.0培养液相比，pH值7.4~7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著升高（ P<0.05）；pH值7.0、7.2培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均明显高于pH值6.6培养液（ P<0.05）；与pH值7.2、7.4培养液相比，pH值7.6、7.8培养液培养细胞胞质pH值的相对荧光值均显著升高（ P<0.05）。胞质pH值的相对荧光值与培养液pH值呈显著正相关（ r=0.99， P<0.001）。见 图1。
注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测；与pH值6.4培养液相比，aP<0.05；与pH值6.6培养液相比，bP<0.05；与pH值6.8培养液相比，cP<0.05；与pH值7.0培养液相比，dP<0.05；与pH值7.2培养液相比，eP<0.05；与pH值7.4培养液相比，fP<0.052.2 细胞增殖活性
8种pH值培养液另培养1.5 d细胞增殖活性相近（ P>0.05）。另培养2.5 d，与pH值7.6培养液相比，pH值6.4~6.8培养液培养细胞增殖活性均显著下降（ P<0.05）。另培养3.5 d，与pH值6.4~6.8培养液相比，pH值7.0~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高（ P<0.05）；与pH值7.6培养液相比，pH值7.0~7.4、7.8培养液培养细胞增殖活性均显著下降（ P<0.05）。另培养4.5、5.5 d，与pH值6.4培养液相比，pH值6.8~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高（ P<0.05）；与pH值6.6、6.8培养液相比，pH值7.0~7.8培养液培养细胞增殖活性均显著升高（ P<0.05）。另培养4.5 d，pH值7.6培养液培养细胞增殖活性显著高于pH值7.0培养液（ P<0.05）。另培养5.5 d，与pH值7.0培养液相比，pH值7.2~7.6培养液培养细胞增殖活性均显著升高（ P<0.05）；与pH值7.2、7.4培养液相比，pH值7.6培养液培养细胞增殖活性显著升高（ P值均<0.05），pH值7.8培养液培养细胞增殖活性显著降低（ P值均<0.05）。见 表1。
表1 8种pH值培养液另培养各时间点人真皮微血管内皮细胞增殖活性比较（pH值 样本数 1.5 d 2.5 d 3.5 d 4.5 d 5.5 d 6.4 3 0.489±0.006 0.506±0.016 0.528±0.021 0.542±0.012 0.561±0.016 6.6 3 0.492±0.008 0.510±0.018 0.541±0.019 0.568±0.012 0.573±0.014 6.8 3 0.497±0.005 0.518±0.014 0.557±0.012 0.583±0.014 a 0.627±0.020 a 7.0 3 0.489±0.004 0.527±0.016 0.601±0.014 abc 0.652±0.016 abc 0.678±0.019 abc 7.2 3 0.495±0.004 0.543±0.020 0.638±0.012 abc 0.692±0.018 abc 0.768±0.014 abcd 7.4 3 0.496±0.008 0.556±0.016 0.655±0.016 abc 0.709±0.010 abc 0.811±0.013 abcd 7.6 3 0.486±0.003 0.562±0.014 abc 0.682±0.016 abcdef 0.725±0.019 abcd 0.832±0.016 abcdef 7.8 3 0.496±0.009 0.532±0.018 0.626±0.016 abcg 0.683±0.014 abc 0.707±0.020 abcef 注：先于相应pH值培养液中适应性培养24 h，再进行后续培养检测；处理因素主效应， F=152.35， P<0.001；时间因素主效应， F=683.95， P<0.001；两者交互作用， F=21.82， P<0.001；与pH值6.4培养液相比， a P<0.05；与pH值6.6培养液相比， b P<0.05；与pH值6.8培养液相比， c P<0.05；与pH值7.0培养液相比， d P<0.05；与pH值7.2培养液相比， e P<0.05；与pH值7.4培养液相比， f P<0.05；与pH值7.6培养液相比， g P<0.05 2.3 细胞迁移剩余面积
去掉播种塞后0 h，8种pH值培养液培养细胞迁移剩余面积相近（ P>0.05）。去掉播种塞后24 h，与pH值6.4培养液相比，pH值6.6~7.8培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小（ P<0.05）；与pH值6.6、6.8培养液相比，pH值7.0~7.6培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小（ P<0.05）。去掉播种塞后48 h，与pH值6.4、6.6培养液相比，pH值7.0~7.8培养液培养细胞迁移剩余面积均显著缩小（ P<0.05）；pH值7.2、7.4培养液培养细胞迁移剩余面积均显著小于pH值6.8、7.0、7.8培养液（ P<0.05），均显著大于pH值7.6培养液（ P<0.05）；pH值7.6培养液培养细胞迁移剩余面积显著小于pH值6.8、7.8培养液（ P值均<0.05）。见 图2与 表2。
表2 8种pH值培养液培养人真皮微血管内皮细胞去掉播种塞后各时间点细胞迁移剩余面积比较（mm 2，pH值 样本数 0 h（即刻） 24 h 48 h 6.4 3 2.636±0.023 2.240±0.064 1.491±0.052 6.6 3 2.608±0.028 1.900±0.073 a 1.491±0.062 6.8 3 2.608±0.030 1.756±0.068 a 1.246±0.058 7.0 3 2.608±0.027 1.131±0.072 abc 0.814±0.042 ab 7.2 3 2.637±0.025 0.970±0.068 abc 0.262±0.041 abcd 7.4 3 2.608±0.028 0.894±0.063 abc 0.188±0.040 abcd 7.6 3 2.608±0.030 0.684±0.050 abc 0.045±0.011 abcef 7.8 3 2.637±0.030 1.305±0.054 a 0.821±0.023 abefg 注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测；处理因素主效应， F=74.60， P<0.001；时间因素主效应， F=2 019.01， P<0.001；两者交互作用， F=24.28， P<0.001；与pH值6.4培养液相比， a P<0.05；与pH值6.6培养液相比， b P<0.05；与pH值6.8培养液相比， c P<0.05；与pH值7.0培养液相比， d P<0.05；与pH值7.2培养液相比， e P<0.05；与pH值7.4培养液相比， f P<0.05；与pH值7.6培养液相比， g P<0.05 2.4 细胞成管的管腔直径
8种pH值培养液另培养48 h细胞成管的管腔直径总体比较，差异有统计学意义（ F=43.27， P<0.001）。与pH值6.4培养液相比，pH值7.0~7.8培养液培养细胞成管的管腔直径均显著延长（ P<0.05）；与pH值7.6培养液相比，pH值6.6~7.0、7.8培养液培养细胞成管的管腔直径均显著缩短（ P<0.05）。见 图3、 4。
注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测；与pH值6.4培养液相比，aP<0.05；与pH值6.6培养液相比，bP<0.05；与pH值6.8培养液相比，cP<0.05；与pH值7.0培养液相比，dP<0.05；与pH值7.6培养液相比，eP<0.052.5 Akt磷酸化位点473、308的蛋白表达
8种pH值培养液另培养48 h细胞中Akt磷酸化位点473、308蛋白表达总体比较，差异均有统计学意义（ F值分别为85.09、132.88， P<0.001）。与pH值6.4、6.6培养液相比，pH值6.8~7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473、308蛋白表达均明显升高（ P<0.05），且pH值6.6培养液培养细胞中Akt磷酸化位点308蛋白表达明显高于pH值6.4培养液（ P<0.05）；与pH值6.8培养液相比，pH值7.0、7.4~7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473蛋白表达均明显升高（ P<0.05）；与pH值7.6培养液相比，pH值7.0~7.4、7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与pH值7.8培养液相比，pH值7.0~7.6培养液培养细胞中Akt磷酸化位点308蛋白表达均明显升高（ P<0.05）。见 图5与 表3。
注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测；Akt为蛋白激酶B，p-Akt-473、p-Akt-308分别为Akt磷酸化位点473、308，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带上方1、2、3、4、5、6、7、8分别指示pH值6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8培养液表3 8种pH值培养液另培养48 h人真皮微血管内皮细胞蛋白激酶B磷酸化位点蛋白表达比较（pH值 样本数 位点473 位点308 6.4 3 0.433±0.042 0.297±0.055 6.6 3 0.498±0.033 0.467±0.018 a 6.8 3 0.752±0.059 ab 0.826±0.047 ab 7.0 3 0.914±0.036 abc 0.938±0.033 ab 7.2 3 0.826±0.048 ab 0.902±0.028 ab 7.4 3 0.890±0.035 abc 0.935±0.021 ab 7.6 3 1.041±0.029 abcdef 0.901±0.037 ab 7.8 3 0.860±0.033 abcg 0.760±0.032 abdefg 注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测；与pH值6.4培养液相比， a P<0.05；与pH值6.6培养液相比， b P<0.05；与pH值6.8培养液相比， c P<0.05；与pH值7.0培养液相比， d P<0.05；与pH值7.2培养液相比， e P<0.05；与pH值7.4培养液相比， f P<0.05；与pH值7.6培养液相比， g P<0.05 3. 讨论
广泛认为血管化是限制组织工程进展的最大挑战 ［ 5， 12］ 。体内血管系统由管腔直径和血管壁结构各不相同的各级血管构成，大血管主要参与血液运输，管腔直径在0.3~1.0 mm的小血管和微血管主要通过响应交感神经的信号进而通过平滑肌的收缩和舒张调控血压 ［ 13］ ，而管腔直径5~10 μm的毛细血管是体内可与组织进行营养代谢产物交换的场所 ［ 14］ 。目前已可成功构建毫米级以上的组织工程血管 ［ 15, 16, 17］ ，但是组织工程毛细血管构建的进展较少 ［ 18, 19］ 。
已有研究表明，胞外pH值会影响胞质的pH值 ［ 20］ 。本研究结果显示胞质pH值的相对荧光值与培养液pH值呈显著正相关，即培养液pH值的增高可以导致HDMEC内pH值的增高，但胞质pH值并不完全与胞外pH值一致。当培养液pH值从6.8升高到7.0时胞质pH值的相对荧光值陡然增高，而培养液pH值为7.0~7.4时胞质pH值的相对荧光值增高较缓，培养液pH值从7.4升高到7.6时胞质pH值的相对荧光值又陡然增高，这可能与HDMEC存在pH缓冲能力有关。
在哺乳动物细胞中，较高的胞质pH值与细胞生长和增殖有关，本研究的结果也证实了这一点。培养液pH值在6.4~7.0时，随着pH值的增加，HDMEC增殖活性随时间延长增加缓慢；而培养液pH值为7.2~7.6时，随着pH值的增加，HDMEC增殖活性随时间延长出现较大幅度的升高；但在培养液pH值为7.8时，HDMEC增殖活性有降低的趋势，与培养液pH值为7.0时情况相近。细胞迁移实验的结果与增殖情况类似，在培养液pH值为6.4~6.8时，去掉播种塞后24 h采集的图像显示HDMEC迁移速率非常慢，到48 h时细胞覆盖率也不到50%；而在培养液pH值为7.0~7.6时，HDMEC迁移速率明显增快，尤其是pH值7.6培养液培养细胞在去掉播种塞后48 h时几乎完全覆盖空缺部分；然而，培养液pH值为7.8时，HDMEC迁移速率出现下降趋势。由此，本课题组推测培养液pH值7.2~7.6是HDMEC体外新生毛细血管的适宜条件。
同时，本课题组观察到培养液pH值为6.4~7.0时，HDMEC形成毛细血管管腔直径为2~5 μm；培养液pH值为7.2~7.6时，HDMEC形成毛细血管管腔直径为7~11 μm；培养液pH值为7.8时，形成毛细血管管腔直径约为5 μm。以上结果说明，培养液的pH值对Matrigel基质胶内毛细血管的管腔直径具有明确的调控作用。此外，一项研究报道了90例急慢性创面患者的植皮率，在pH值7.4及以上的情况下，99%的皮片移植于创面后成活；然而，在pH值低于7.0的情况下，皮片移植后均未成活 ［ 21］ 。综合本课题组的研究结果，这可能是由于pH值7.4~7.6时毛细血管的生长条件合适，血液供应充足，从而使创面愈合得更好。
Akt作为参与细胞增殖和迁移的一种极其重要的信号转导蛋白，其丝氨酸473位点或苏氨酸308位点的磷酸化通常被认为是Akt激活后的主要磷酸化形式。本研究结果显示Akt磷酸化水平与pH值关系密切。pH值为6.4~7.6时，随着培养液pH值的升高，Akt磷酸化位点473、308的蛋白表达均增加。与培养液pH值为6.4和6.6相比，pH值6.8~7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化位点473、308蛋白表达显著增高；与pH值7.6培养液相比，pH值7.8培养液培养细胞中Akt磷酸化水平显著下降。可见，在pH值为7.0~7.6时细胞Akt活性较高。这可能是因为血液和细胞外液的生理pH值接近，在7.35~7.45之间 ［ 22］ ，在这个适当的pH值范围内，Akt表现出更高的活性，能够更好地形成新的毛细血管。
鉴于pH值在7.2~7.6时内皮细胞所形成的毛细血管管腔直径为7~11 μm，最适于构建组织工程毛细血管，且在此pH值范围内Akt表达活性增高，本课题组认为pH值调控HDMEC形成的毛细血管管腔直径，且其调控作用与Akt的激活密切相关，7.2~7.6为构建组织工程毛细血管的适宜pH值。本研究初步揭示了组织工程毛细血管管腔直径的调控机制，为构建管腔直径可控的功能性组织工程毛细血管打下了基础，对于功能性组织工程毛细血管的构建以及组织工程器官的构建具有十分重要的意义。本研究提供了pH值可能通过Akt调控毛细血管管腔直径的证据，但由于新生血管涉及多种细胞类型和信号通路，Akt并不是pH值调控毛细血管管腔直径的唯一机制，因此本课题组将进行后续更加深入的研究。
王晓琳、边永钎：完成实验操作、论文撰写；李靖、李金清：数据整理、统计学分析；李学拥：研究指导、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 8种pH值培养液另培养36 h人真皮微血管内皮细胞胞质pH值的相对荧光值比较（样本数为3，
注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测；与pH值6.4培养液相比，aP<0.05；与pH值6.6培养液相比，bP<0.05；与pH值6.8培养液相比，cP<0.05；与pH值7.0培养液相比，dP<0.05；与pH值7.2培养液相比，eP<0.05；与pH值7.4培养液相比，fP<0.05
2 8种pH值培养液培养人真皮微血管内皮细胞去掉播种塞后各时间点细胞迁移剩余面积（黄色虚线标记区域） 5-氯甲基荧光素二乙酸酯×10。2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H与2I、2J、2K、2L、2M、2N、2O、2P和2Q、2R、2S、2T、2U、2V、2W、2X.分别为pH值6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8培养液培养细胞去掉播种塞后0（即刻）、24、48 h，图2A~2H细胞迁移剩余面积相近，图2M、2N、2O细胞迁移剩余面积明显较图2I~2L及2P小，图2U、2V、2W细胞迁移剩余面积明显较图2Q~2T及2X小，其中图2W细胞迁移剩余面积最小
注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测
3 8种pH值培养液另培养48 h人真皮微血管内皮细胞在Matrigel基质胶内成管（黄色箭头指示）情况 倒置相差显微镜×100。3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H.分别为pH值6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8培养液培养细胞，图3A、3B、3C、3D管腔直径较短，图3E、3F、3G、3H管腔直径较长，其中图3G管腔直径最长
注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测
4 8种pH值培养液另培养48 h人真皮微血管内皮细胞成管的管腔直径比较（样本数为3，
注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测；与pH值6.4培养液相比，aP<0.05；与pH值6.6培养液相比，bP<0.05；与pH值6.8培养液相比，cP<0.05；与pH值7.0培养液相比，dP<0.05；与pH值7.6培养液相比，eP<0.05
5 蛋白质印迹法检测的8种pH值培养液另培养48 h人真皮微血管内皮细胞Akt磷酸化位点蛋白表达
注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测；Akt为蛋白激酶B，p-Akt-473、p-Akt-308分别为Akt磷酸化位点473、308，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带上方1、2、3、4、5、6、7、8分别指示pH值6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8培养液
表1 8种pH值培养液另培养各时间点人真皮微血管内皮细胞增殖活性比较（
pH值 样本数 1.5 d 2.5 d 3.5 d 4.5 d 5.5 d 6.4 3 0.489±0.006 0.506±0.016 0.528±0.021 0.542±0.012 0.561±0.016 6.6 3 0.492±0.008 0.510±0.018 0.541±0.019 0.568±0.012 0.573±0.014 6.8 3 0.497±0.005 0.518±0.014 0.557±0.012 0.583±0.014 a 0.627±0.020 a 7.0 3 0.489±0.004 0.527±0.016 0.601±0.014 abc 0.652±0.016 abc 0.678±0.019 abc 7.2 3 0.495±0.004 0.543±0.020 0.638±0.012 abc 0.692±0.018 abc 0.768±0.014 abcd 7.4 3 0.496±0.008 0.556±0.016 0.655±0.016 abc 0.709±0.010 abc 0.811±0.013 abcd 7.6 3 0.486±0.003 0.562±0.014 abc 0.682±0.016 abcdef 0.725±0.019 abcd 0.832±0.016 abcdef 7.8 3 0.496±0.009 0.532±0.018 0.626±0.016 abcg 0.683±0.014 abc 0.707±0.020 abcef 注：先于相应pH值培养液中适应性培养24 h，再进行后续培养检测；处理因素主效应， F=152.35， P<0.001；时间因素主效应， F=683.95， P<0.001；两者交互作用， F=21.82， P<0.001；与pH值6.4培养液相比， a P<0.05；与pH值6.6培养液相比， b P<0.05；与pH值6.8培养液相比， c P<0.05；与pH值7.0培养液相比， d P<0.05；与pH值7.2培养液相比， e P<0.05；与pH值7.4培养液相比， f P<0.05；与pH值7.6培养液相比， g P<0.05 
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表2 8种pH值培养液培养人真皮微血管内皮细胞去掉播种塞后各时间点细胞迁移剩余面积比较（mm 2，
pH值 样本数 0 h（即刻） 24 h 48 h 6.4 3 2.636±0.023 2.240±0.064 1.491±0.052 6.6 3 2.608±0.028 1.900±0.073 a 1.491±0.062 6.8 3 2.608±0.030 1.756±0.068 a 1.246±0.058 7.0 3 2.608±0.027 1.131±0.072 abc 0.814±0.042 ab 7.2 3 2.637±0.025 0.970±0.068 abc 0.262±0.041 abcd 7.4 3 2.608±0.028 0.894±0.063 abc 0.188±0.040 abcd 7.6 3 2.608±0.030 0.684±0.050 abc 0.045±0.011 abcef 7.8 3 2.637±0.030 1.305±0.054 a 0.821±0.023 abefg 注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测；处理因素主效应， F=74.60， P<0.001；时间因素主效应， F=2 019.01， P<0.001；两者交互作用， F=24.28， P<0.001；与pH值6.4培养液相比， a P<0.05；与pH值6.6培养液相比， b P<0.05；与pH值6.8培养液相比， c P<0.05；与pH值7.0培养液相比， d P<0.05；与pH值7.2培养液相比， e P<0.05；与pH值7.4培养液相比， f P<0.05；与pH值7.6培养液相比， g P<0.05
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表3 8种pH值培养液另培养48 h人真皮微血管内皮细胞蛋白激酶B磷酸化位点蛋白表达比较（
pH值 样本数 位点473 位点308 6.4 3 0.433±0.042 0.297±0.055 6.6 3 0.498±0.033 0.467±0.018 a 6.8 3 0.752±0.059 ab 0.826±0.047 ab 7.0 3 0.914±0.036 abc 0.938±0.033 ab 7.2 3 0.826±0.048 ab 0.902±0.028 ab 7.4 3 0.890±0.035 abc 0.935±0.021 ab 7.6 3 1.041±0.029 abcdef 0.901±0.037 ab 7.8 3 0.860±0.033 abcg 0.760±0.032 abdefg 注：先于相应pH值培养液中进行24 h适应性培养，再进行后续培养检测；与pH值6.4培养液相比， a P<0.05；与pH值6.6培养液相比， b P<0.05；与pH值6.8培养液相比， c P<0.05；与pH值7.0培养液相比， d P<0.05；与pH值7.2培养液相比， e P<0.05；与pH值7.4培养液相比， f P<0.05；与pH值7.6培养液相比， g P<0.05
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