Effects and mechanism of glycine on rat cardiomyocytes pretreated with serum from burned rats
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摘要:
目的 探讨甘氨酸对经烧伤大鼠血清（以下简称烧伤血清）干预的大鼠心肌细胞的作用及其机制。 方法 采用实验研究方法。取30只7~8周龄雌雄各半Wistar大鼠，其中10只用于制备正常大鼠血清（以下简称正常血清），将另20只造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤后制备烧伤血清；从180只1~3 d龄雌雄不拘Wistar大鼠心尖组织中分离培养原代心肌细胞用于后续实验。按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为用相应血清处理的正常血清组、烧伤血清组，于处理1、3、6、9、12 h进行锥虫蓝染色检测细胞存活率；将细胞分为用烧伤血清处理6 h后常规培养30 min的单纯烧伤血清组和用烧伤血清处理6 h后加相应终物质的量浓度甘氨酸培养30 min的0.4 mmol/L甘氨酸组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组、2.0 mmol/L甘氨酸组，即干预6.5 h，同前检测细胞存活率。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组，分别同前干预6.5 h，采用高效液相色谱法检测腺苷一磷酸（AMP）和ATP含量并计算AMP/ATP比值，采用蛋白质印迹法检测磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（p-mTORC1）、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶（p-p70 S6K）、磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1（p-4E-BP1）、磷酸化AMP活化蛋白激酶（p-AMPK）蛋白表达。将细胞分为同前干预的正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组和用烧伤血清处理后加2种试剂培养的0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组，于处理1、3、6 h行相应培养30 min，即干预1.5、3.5、6.5 h，采用免疫荧光法检测热休克蛋白70（HSP70）、金属硫蛋白（MT）和微管蛋白表达并观察干预6.5 h微管形态。各时间点样本数均为10。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验、LSD检验及Bonferroni校正。 结果 处理1、3、6、9、12 h，烧伤血清组细胞存活率均明显低于正常血清组（ t值分别为4.96、16.83、35.51、34.33、27.88， P<0.05）。在烧伤血清组中，处理3、6、9、12 h细胞存活率均较处理1 h明显降低（ P<0.05），处理6、9、12 h细胞存活率均较处理3 h明显降低（ P<0.05），处理6 h细胞存活率与处理9 h相近（ P>0.05）但明显高于处理12 h（ P<0.05）；选择处理6 h作为后续烧伤血清干预时间。干预6.5 h，与单纯烧伤血清组比较，各甘氨酸组细胞存活率均明显升高（ P<0.05）。0.8 mmol/L甘氨酸组细胞存活率最高，选择0.8、1.2、1.6 mmol/L作为后续甘氨酸的干预浓度。干预6.5 h，单纯烧伤血清组细胞AMP/ATP比值较正常血清组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组明显升高（ P值均<0.05），1.6 mmol/L甘氨酸组细胞AMP/ATP比值较0.8 mmol/L甘氨酸组明显降低（ P<0.05）。干预6.5 h，正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L 甘氨酸组、1.2 mmol/L 甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K、p-4E-BP1蛋白表达水平分别为1.001±0.037、0.368±0.020、1.153±0.019、1.128±0.062、1.028±0.037，0.96±0.07、0.63±0.12、1.17±0.13、1.13±0.16、1.11±0.11，0.98±0.06、0.45±0.08、1.13±0.05、0.77±0.12、0.51±0.13。与单纯烧伤血清组比较，正常血清组与各甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K和p-4E-BP1蛋白表达均明显升高（ P<0.05），p-AMPK蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较，1.2 mmol/L甘氨酸组细胞p-4E-BP1蛋白表达以及1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1与p-4E-BP1蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与1.2 mmol/L甘氨酸组比较，1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-4E-BP1蛋白表达均明显降低（ P<0.05），p-AMPK蛋白表达明显升高（ P<0.05）。与正常血清组比较，单纯烧伤血清组细胞干预1.5、3.5、6.5 h微管蛋白表达均明显降低（ P<0.05），干预1.5、3.5 h HSP70表达和干预3.5、6.5 h MT表达均明显升高（ P<0.05）；单纯烧伤血清组与0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞干预1.5、3.5、6.5 h HSP70、MT表达以及干预1.5、3.5 h微管蛋白表达均明显低于0.8 mmol/L甘氨酸组（ P<0.05）。干预6.5 h，与正常血清组比较，单纯烧伤血清组细胞微管结构紊乱；0.8 mmol/L甘氨酸组细胞边界较单纯烧伤血清组清晰，微管结构近核部位排列整齐；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较，0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞边界不清，微管结构紊乱。 结论 烧伤血清可导致大鼠心肌细胞受损，甘氨酸可通过AMP活化蛋白激酶显著上调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p70核糖体蛋白S6激酶/真核翻译起始因子4E结合蛋白1信号通路，促进心肌细胞保护性蛋白HSP70、MT和微管蛋白合成，稳定微管结构，实现心肌细胞保护作用。 Abstract:Objective To investigate the effect and mechanism of glycine on rat cardiomyocytes pretreated with serum from burned rats (hereinafter referred to as burn serum). Methods Experimental research methods were adopted. Thirty gender equally balanced Wistar rats aged 7 to 8 weeks were collected, 10 of which were used to prepare normal rat serum (hereinafter referred to as normal serum), and the other 20 were inflicted with full-thickness burn of 30% total body surface area to prepare burn serum. Primary cardiomyocytes were isolated and cultured from the apical tissue of 180 Wistar rats aged 1 to 3 days by either gender for follow-up experiments. Cells were divided into normal serum group and burn serum group treated with corresponding serum according to the random number table (the same grouping method below). Trypanosoma blue staining was performed at post treatment hour (PTH) 1, 3, 6, 9, and 12 to detect the cell survival rate. Cells were divided into burn serum alone group treated with burn serum for 6 h followed by routine culture of 30 min and 0.4 mmol/L glycine group, 0.8 mmol/L glycine group, 1.2 mmol/L glycine group, 1.6 mmol/L glycine group, and 2.0 mmol/L glycine group treated with burn serum for 6 h followed by culture of 30 min with corresponding final molarity of glycine, i.e., at post intervention hour (PIH) 6.5, the cell survival rate was detected as before. Cells were divided into normal serum group, burn serum alone group, 0.8 mmol/L glycine group, 1.2 mmol/L glycine group, and 1.6 mmol/L glycine group, with the same intervention of 6.5 h as before, respectively. The content of adenosine monophosphate (AMP) and adenosine triphosphate (ATP) was detected by high performance liquid chromatography, and the AMP/ATP ratio was calculated. The protein expressions of phosphorylated mammalian target of rapamycin complex 1 (p-mTORC1), phosphorylated p70 ribosomal protein S6 kinase (p-p70 S6K), phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 (p-4E-BP1), and phosphorylated AMP-activated protein kinase (p-AMPK) were detected by Western blotting. Cells were divided into normal serum group, burn serum alone group, 0.8 mmol/L glycine group intervened as before and 0.8 mmol/L glycine+25 ng/mL rapamycin group treated with burn serum followed by culture with two reagents. The expressions of heat shock protein 70 (HSP70), metallothionein (MT), and tubulin were detected by immunofluorescence method after 30 min of corresponding culture at PTH 1, 3, and 6, i.e., at PIH 1.5, 3.5, and 6.5, and the microtubule morphology was observed at PIH 6.5. The sample number at each time point was 10. Data were statistically analyzed with analysis of variance for factorial design, one-way analysis of variance, least significant difference (LSD)- t test, LSD test, and Bonferroni correction. Results At PTH 1, 3, 6, 9, and 12, the cell survival rates in burn serum group were significantly lower than those in normal serum group (with t values of 4.96, 16.83, 35.51, 34.33, and 27.88, P<0.05). In burn serum group, the cell survival rate at PTH 3, 6, 9, or 12 was significantly lower than that at PTH 1 ( P<0.05), the cell survival rate at PTH 6, 9, or 12 was significantly lower than that at PTH 3 ( P<0.05), and the cell survival rate at PTH 6 was similar to that at PTH 9 ( P>0.05) but significantly higher than that at PTH 12 ( P<0.05). Treatment of 6 h was selected as the follow-up intervention time of burn serum. At PIH 6.5, compared with that in burn serum alone group, the cell survival rate in each glycine group was significantly increased ( P<0.05). The cell survival rate in 0.8 mmol/L glycine group was the highest, and 0.8, 1.2, and 1.6 mmol/L were selected as subsequent glycine intervention concentrations. At PIH 6.5, the AMP/ATP ratio of cells in burn serum alone group was significantly higher than that in normal serum group, 1.2 mmol/L glycine group, or 1.6 mmol/L glycine group ( P values all <0.05), and the AMP/ATP ratio of cells in 1.6 mmol/L glycine group was significantly lower than that in 0.8 mmol/L glycine group ( P<0.05). At PIH 6.5, the protein expressions of p-mTORC1, p-p70 S6K, and p-4E-BP1 of cells in normal serum group, burn serum alone group, 0.8 mmol/L glycine group, 1.2 mmol/L glycine group, and 1.6 mmol/L glycine group were 1.001±0.037, 0.368±0.020, 1.153±0.019, 1.128±0.062, 1.028±0.037, 0.96±0.07, 0.63±0.12, 1.17±0.13, 1.13±0.16, 1.11±0.11, and 0.98±0.06, 0.45±0.08, 1.13±0.05, 0.77±0.12, 0.51±0.13. Compared with those in burn serum alone group, the protein expressions of p-mTORC1, p-p70 S6K, and p-4E-BP1 of cells in normal serum group and each glycine group were significantly increased ( P<0.05), while the protein expressions of p-AMPK were significantly decreased ( P<0.05). Compared with those in 0.8 mmol/L glycine group, the protein expression of p-4E-BP1 of cells in 1.2 mmol/L glycine group and the protein expressions of p-mTORC1 and p-4E-BP1 of cells in 1.6 mmol/L glycine group were significantly decreased ( P<0.05). Compared with those in 1.2 mmol/L glycine group, the protein expressions of p-mTORC1 and p-4E-BP1 of cells in 1.6 mmol/L glycine group were significantly decreased ( P<0.05), while the protein expression of p-AMPK was significantly increased ( P<0.05). Compared with those in normal serum group, the expression of tubulin of cells in burn serum alone group was significantly decreased at PIH 1.5, 3.5, and 6.5 ( P<0.05), while the expression of HSP70 of cells at PIH 1.5 and 3.5 and the expression of MT at PIH 3.5 and 6.5 were significantly increased ( P<0.05). The expressions of HSP70 and MT of cells at PIH 1.5, 3.5, and 6.5 and the expression of tubulin at PIH 1.5 and 3.5 in burn serum alone group and 0.8 mmol/L glycine+25 ng/mL rapamycin group were significantly lower than those in 0.8 mmol/L glycine group ( P<0.05). At PIH 6.5, compared with that in normal serum group, the cell microtubule structure in burn serum alone group was disordered; the cell boundary in 0.8 mmol/L glycine group was clearer than that in burn serum alone group, and the microtubule structure arranged neatly near the nucleus. Compared with that in 0.8 mmol/L glycine group, 0.8 mmol/L glycine+25 ng/mL rapamycin group had unclear cell boundaries and disordered microtubule structure. Conclusions Burn serum can cause cardiomyocytes damage in rats. Glycine can significantly up-regulate mammalian target of rapamycin/p70 ribosomal protein S6 kinase/eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1 signaling pathway through AMP-activated protein kinase, promote the synthesis of protective proteins HSP70, MT, and tubulin, stabilize the microtubule structure, and exert cardiomyocytes protection function. -
证明超声清创法可显著减轻烧伤残余创面的细菌负荷，减少术后血肿形成，促进移植皮片成活，从而缩短患者病程。
烧伤，尤其是深度烧伤会遗留严重瘢痕，对患者身心造成损害［1, 2, 3］。深度烧伤创面难以愈合或一次封闭困难，均会导致残余创面形成。临床上修复残余创面常采用清创+植皮术，而传统清创手术易误伤创面周围健康组织［4］，违背现代精准医学的治疗理念。近年来，超声清创技术在糖尿病足、下肢静脉溃疡、压疮、骨外露等创面修复［5, 6, 7, 8］中取得了良好效果，但目前国内鲜见将超声清创技术应用于烧伤残余创面的相关报告。解放军联勤保障部队第980医院（以下简称本单位）近年来将超声清创技术应用于烧伤残余创面，取得了良好的临床效果。
1. 对象与方法
本回顾性队列研究符合《赫尔辛基宣言》的基本原则，根据本单位伦理委员会政策，临床资料可以在不泄露患者身份信息的前提下分析、使用。
1.1 入选标准
纳入标准：（1）原发深Ⅱ度或Ⅲ度烧伤经清创植皮后仍存在残余创面；（2）创面分布相对集中，创面总面积≥1%TBSA，且至少存在1处残余创面直径≥5 cm。（3）对残余创面行传统清创法或超声清创法+植皮治疗者。排除标准：资料不全者。
1.2 患者一般资料及烧伤创面情况
2017年8月—2021年8月，本单位收治64例符合入选标准的患者，其中男41例、女23例，年龄为9个月~67岁，平均年龄31岁，烧伤总面积25%~90%TBSA，残余创面总面积1%~17%TBSA，致伤原因：火焰烧伤者36例，热液烫伤者23例，电烧伤者5例。根据创面清创方法，将患者分为超声清创组（34例）和传统清创组（30例）。2组患者性别、年龄、致伤原因、烧伤部位等一般情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；2组患者烧伤总面积、残余创面面积、伤后清创时间等创面情况均相似（P>0.05）。见表1。清创前，2组患者的所有创面中均有细菌感染：超声清创组创面中检出金黄色葡萄球菌者12例、铜绿假单胞菌者15例、鲍曼不动杆菌者5例、粪肠球菌者3例、阴沟肠杆菌者2例，其中复合感染者3例；传统清创组创面检出金黄色葡萄球菌者11例、铜绿假单胞菌者15例、鲍曼不动杆菌者3例、肺炎克雷伯菌者2例、阴沟肠杆菌者2例，其中复合感染者3例。
表1 2组烧伤残余创面患者一般资料及其烧伤创面情况比较组别 例数 性别（例） 年龄（岁， 致伤原因（例） 烧伤部位（例） 烧伤总面积（%TBSA， 残余创面面积（%TBSA， 伤后清创时间（d， 男 女 火焰烧伤 热液烫伤 电烧伤 头面颈部 前后躯干 四肢 超声清创组 34 22 12 31 19 12 3 4 20 10 51 10.9 32 传统清创组 30 19 11 32 17 11 2 3 19 8 50 10.1 33 统计量值 χ2=0.01 t=0.30 χ2=0.10 χ2=0.14 t=0.29 t=0.89 t=0.71 P值 0.909 0.972 0.949 0.932 0.707 0.907 0.169 注：TBSA为体表总面积 1.3 治疗方法
2组患者入院后均行常规补液、换药等治疗，术前纠正电解质紊乱、低蛋白血症、贫血、血糖和血压异常等情况，选择敏感抗生素防治感染，改善创面微循环。术中全身麻醉下对创面进行清创：（1）超声清创组创面，采用超声清创机根据创面大小使用500~2 000 mL生理盐水清除坏死组织或陈旧性肉芽至新鲜点状出血，清创后以1∶250 000肾上腺素盐水浸润的纱布覆盖创面以减少出血。超声机功率设置（50%~80%额定功率）及清创时长根据肉芽生长、坏死组织残存及感染情况确定。（2）传统清创组创面，采用传统锐性清创的方式，清创同时以1∶250 000肾上腺素盐水浸润的纱布湿敷，必要时行电凝止血。清创结束后，2组创面均使用过氧化氢、氯已定、生理盐水等冲洗3~5遍后植皮。功能部位或对容貌影响较大的暴露区创面首选大张皮片植皮；非功能部位创面，尤其是供皮困难者，选择移植邮票皮。植皮后四肢等部位采用无菌纱布适当加压包扎；面部等不易包扎的部位予缝线打包加压固定。术后行抗生素治疗，每2~3天换药1次。对于Ⅰ期手术后未愈合创面行二次清创+植皮术，2组创面的清创方式均分别同其Ⅰ期。
1.4 观察指标
1.4.1 创面分泌物细菌阳性率
术后3 d，于创面分泌物较多处选取标本行微生物培养及药物敏感试验检测细菌情况并计算细菌阳性率。创面细菌阳性率=细菌阳性患者例数÷患者总例数×100%。
1.4.2 皮片成活率及皮下血肿发生率
术后7 d，对于采用邮票皮治疗者，若面积较大，则统计5处约5 cm×5 cm植皮区内成活皮片数量；若面积较小，则统计所有植皮区域内成活皮片数量［4］。对于采用大张皮植皮者，行大体观察直接评估皮片成活情况。皮片成活标准为贴附良好、颜色红润、按压后充血明显、无明显滑动。皮片成活率=成活皮片数÷移植皮片总数×100%。术后7 d，大体观察创面皮下血肿发生率，皮下血肿发生率=皮下血肿形成患者例数÷患者总例数×100%。
1.4.3 创面愈合时间及二次清创率
出院时，统计患者创面愈合时长（二次清创者以Ⅱ期创面愈合时间为准）及清创次数并计算二次清创率，二次清创率=二次清创患者例数÷患者总例数×100%。
1.5 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料数据以
2. 结果
2.1 创面分泌物细菌阳性率
术后3 d，超声清创组创面感染金黄色葡萄球菌者2例、铜绿假单胞菌者2例，传统清创组创面感染金黄色葡萄球菌者5例、铜绿假单胞菌者3例、鲍曼不动杆菌者1例、肺炎克雷伯菌者1例、阴沟肠杆菌者1例；超声清创组患者创面细菌阳性率为11.8%（4/34）明显低于传统清创组的36.7%（11/30），χ2=5.51，P=0.019。
2.2 皮片成活率及皮下血肿发生率
术后7 d，超声清创组创面的移植皮片成活率为（92
2.3 创面愈合时间及二次清创率
出院时，超声清创组创面愈合时长为（11.0
2.4 典型病例
患者男，38岁，致伤原因为电烧伤，全身多处均为Ⅲ度烧伤，总面积为26%TBSA，主要位于左下肢（14%TBSA）及头面部（3%TBSA）、左上肢（3%TBSA）、背部（4%TBSA）、左臀部（2%TBSA），伤后被送至当地医院治疗，其间行全身多处创面削痂+Meek植皮术。患者于伤后25 d转入本单位。入院时，患者部分创面已经基本封闭，已愈合区域与肉芽创面相互交错；残余创面主要位于背部，面积为2%TBSA，其表面可见肉芽组织增生及稀薄分泌物。入院后，从患者创面分泌物中检出金黄色葡萄球菌，后续采用静脉输注抗生素抗感染、纠正电解质紊乱等措施改善患者全身状况，创面每2~3天换药1次。入院后第7天，在全身麻醉下采用超声清创机对患者背部残余创面进行清创，清创机功率设置为75%额定功率，使用约500 mL生理盐水冲洗创面。然后选择右侧背部皮肤为供皮区，切取相应大小刃厚皮片行邮票皮移植术并采用无菌纱布适当加压包扎。术后行抗生素治疗，每2~3天换药1次。术后3 d，取创面中少量分泌物行微生物培养，未检出细菌。术后7 d，创面皮片成活率约为98%，皮片下无明显血肿。术后12 d创面完全愈合。见图1。
1 超声清创法+邮票皮移植治疗背部烧伤患者残余创面的疗效。1A.伤后25 d入院时，创面中较少肉芽组织增生；1B.伤后32 d背部创面清创术前，见肉芽组织增生明显，突出皮面；1C.清创术中；1D.术后12 d，邮票皮片存活良好3. 讨论
浅Ⅱ度烧伤经适当处理后可愈合，但深Ⅱ度及Ⅲ度等深度烧伤创面愈合困难，勉强愈合后也会遗留瘢痕或反复破溃，严重影响机体外观和功能［9, 10, 11］。因此，对深度烧伤常在早期行外科手术修复，常形成残余创面需在Ⅱ期行清创植皮术。理想的清创方式应具备高效且尽量保留健康组织、减少出血、降低住院费用、减轻创面中细菌负荷及提高愈合率等特点［12］。烧伤残余创面存在已愈合区域与坏死组织或肉芽组织相互交叉、镶嵌分布、边缘不规则等特点，清创难度大，传统锐性清创法的应变效能差，会造成周围正常组织不必要的损伤，出血较多。这导致经验较少的年轻医师在治疗残余创面的过程中存在较多突出问题［4］。
超声清创法是近年来兴起的清创方式，为残余创面清创提供了新的选择［13］。高频超声以热效应为主，低频超声以机械效应为主，即分别具有空化效应与声流作用［14, 15, 16］。超声清创机采用低频、高能超声波加载喷射流技术，在冲洗创面过程中会产生空化效应，即通过超声波形成的空化泡崩塌产生的微射流及高压可清除坏死组织［17, 18, 19］。超声清创机操作灵活，可用于平面或腔隙等不同类型创面；还可根据坏死组织或肉芽组织情况选择不同的功率，达到最佳清创效果。同时，超声清创机可将液体以雾化的形式喷出，使液体全面接触创面以更精确地清除非活性组织，又避免了对周围正常组织的附带损伤［5，17，20］。
创面细菌负荷的减轻程度是反映清创效果的一个重要指标。创面细菌负荷与细菌生物膜形成密切相关，生物膜可保护细菌免受抗生素、防腐剂和宿主免疫的影响，还可逐步释放浮游细菌导致创面持续感染，严重影响创面皮片成活率［21, 22, 23, 24, 25, 26］。有研究显示超声不仅对革兰阳性、革兰阴性、需氧和厌氧细菌具有明显抗菌作用［27, 28］，还可以有效清除细菌生物膜［21］，显著减少细菌负荷，改善创面条件［29, 30, 31］。本研究结果显示，超声清创组术后3 d创面细菌阳性率显著低于传统清创组，同时前者的二次清创率也显著低于后者，提示超声清创法在清除创面坏死组织，减轻细菌负荷等方面具有显著作用，其结果与前述既往国内外研究结果一致。
此外，超声清创法可有效减轻术后炎症反应和疼痛，还可促进伤口组织中碱性FGF和EGF的高表达，改善创面微循环，促进血管生成和胶原沉积，提升组织再生和修复能力，这可能与超声产生的空化效应和声流作用等机械能刺激信号转导，继发广泛的细胞效应有关［18, 19，32, 33, 34］。本研究中超声清创组的皮片成活率显著高于传统清创组，且创面愈合时间显著短于传统清创组。移植皮片的成活率与皮下积血、积液等密切相关。相关研究指出，超声清创机可通过热效应达到减少出血的效果［5，35, 36］，但由于术中出血与组织液、膨胀液或冲洗液等混合在一起，难以精确估计出血量。但是本研究显示，超声清创组皮下血肿发生率显著低于传统清创组，提示减少术中出血和皮下血肿形成可能是超声清创法提高皮片成活率，促进创面愈合的机制之一。
综上，与传统清创法相比，超声清创法可在烧伤残余创面清创中彻底清除坏死组织和陈旧性肉芽组织、减轻细菌负荷、降低皮下血肿发生率，促进移植皮片成活，从而缩短创面愈合时间，为烧伤残余创面的修复提供了新的方法和选择。超声清创法对于提高烧伤残余创面的修复效果具有重要意义，值得临床推广。
吕尚军、闫尊东：实验操作、论文撰写；范荣辉：数据整理、统计学分析；彭曦：研究指导、论文修改、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
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1 蛋白质印迹法检测的5组大鼠心肌细胞干预6.5 h时哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路上下游分子蛋白表达
注：正常血清组与单纯烧伤血清组细胞分别用正常大鼠血清与烧伤大鼠血清处理6 h并常规培养30 min，3个甘氨酸组细胞均用烧伤大鼠血清处理6 h并加相应终物质的量浓度甘氨酸培养30 min；p-mTORC1为磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1，p-p70 S6K为磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶，p-4E-BP1为磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1，p-AMPK为磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带上方1、2、3、4、5分别指示正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组
2 4组大鼠心肌细胞干预6.5 h微管形态 异硫氰酸荧光素-Hoechst 33342×800。2A.正常血清组细胞呈多边形，微管结构完整；2B.单纯烧伤血清组细胞皱缩呈圆形，微管结构紊乱；2C.0.8 mmol/L甘氨酸组微管破坏程度较图2B有所减轻；2D.0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组微管破坏程度比图2C严重
注：正常血清组与单纯烧伤血清组细胞分别用正常大鼠血清与烧伤大鼠血清处理6 h并常规培养30 min，另2组细胞均用烧伤大鼠血清处理6 h并加甘氨酸或甘氨酸+雷帕霉素培养30 min；心肌细胞微管阳性染色为红色，细胞核阳性染色为蓝色
表1 2组大鼠心肌细胞处理各时间点存活率比较（%，
组别 样本数 1 h 3 h 6 h 9 h 12 h F值 P值 正常血清组 10 90.0±3.0 88.3±3.4 91.8±2.7 90.9±3.1 90.4±1.3 1.60 0.089 烧伤血清组 10 83.3±5.6 61.3±4.4 a 44.9±2.9 ab 42.6±2.8 ab 41.2±3.7 abc 241.32 <0.001 t值 4.96 16.83 35.51 34.33 27.88 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：血清均来自大鼠；处理因素主效应， F=1 931.77， P<0.001；时间因素主效应， F=141.62， P<0.001；两者交互作用， F=135.76， P<0.001；与组内1 h比较， a P<0.05；与组内3 h比较， b P<0.05；与组内6 h比较， c P<0.05 
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表2 5组大鼠心肌细胞干预6.5 h时哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路上下游分子蛋白表达比较（
组别 样本数 p-mTORC1 p-p70 S6K p-4E-BP1 p-AMPK 正常血清组 10 1.001±0.037 0.96±0.07 0.98±0.06 0.42±0.08 单纯烧伤血清组 10 0.368±0.020 a 0.63±0.12 a 0.45±0.08 a 0.88±0.08 a 0.8 mmol/L甘氨酸组 10 1.153±0.019 b 1.17±0.13 b 1.13±0.05 b 0.73±0.09 b 1.2 mmol/L甘氨酸组 10 1.128±0.062 b 1.13±0.16 b 0.77±0.12 bc 0.63±0.11 b 1.6 mmol/L甘氨酸组 10 1.028±0.037 bcd 1.11±0.11 b 0.51±0.13 bcd 0.76±0.07 bd F值 706.31 34.47 84.14 39.88 P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 注：正常血清组与单纯烧伤血清组细胞分别用正常大鼠血清与烧伤大鼠血清处理6 h并常规培养30 min，3个甘氨酸组细胞均用烧伤大鼠血清处理6 h并加相应终物质的量浓度甘氨酸培养30 min；p-mTORC1为磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1，p-p70 S6K为磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶，p-4E-BP1为磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1，p-AMPK为磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶；与正常血清组比较， a P<0.05；与单纯烧伤血清组比较， b P<0.05；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较， c P<0.05；与1.2 mmol/L甘氨酸组比较， d P<0.05
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表3 4组大鼠心肌细胞干预各时间点HSP70与MT和微管蛋白表达比较（
组别与时间点 样本数 HSP70 MT 微管蛋白 正常血清组 30 1.5 h 3.63±1.26 5.5±0.9 16.2±1.4 3.5 h 3.52±0.35 5.6±1.0 15.7±1.2 6.5 h 3.44±0.39 5.5±0.7 15.5±1.1 单纯烧伤血清组 30 1.5 h 7.51±0.91 a 5.2±1.4 9.0±1.5 a 3.5 h 5.44±1.13 a 7.4±1.0 a 6.8±1.8 a 6.5 h 4.11±0.79 8.4±0.6 a 6.6±1.3 a 0.8 mmol/L甘氨酸组 30 1.5 h 9.73±1.19 b 11.3±0.7 b 10.9±1.3 b 3.5 h 12.37±1.43 b 12.7±1.8 b 7.9±1.3 b 6.5 h 15.21±1.14 b 16.2±1.3 b 7.2±1.1 0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组 30 1.5 h 1.34±0.29 c 3.1±1.1 c 7.8±1.4 c 3.5 h 1.69±0.49 c 2.9±0.4 c 6.3±0.7 c 6.5 h 2.28±0.73 c 2.8±1.2 c 6.4±1.7 F 1值 149.30 103.30 71.10 P 1值 <0.001 <0.001 <0.001 F 2值 191.22 125.93 108.17 P 2值 <0.001 <0.001 <0.001 F 3值 285.03 337.95 107.69 P 3值 <0.001 <0.001 <0.001 注：正常血清组与单纯烧伤血清组细胞分别用正常大鼠血清与烧伤大鼠血清处理6 h并常规培养30 min，后2组细胞均用烧伤大鼠血清处理6 h并加甘氨酸或甘氨酸+雷帕霉素培养30 min；HSP70为热休克蛋白70，MT为金属硫蛋白；各组各时间点样本数均为10；HSP70、MT和微管蛋白处理因素主效应， F值分别为493.27、479.79、720.29， P值均<0.001；时间因素主效应， F值分别为8.68、31.59、24.34， P值均<0.001；两者交互作用， F值分别为30.29、13.84、2.42， P值均<0.001； F 1值、 P 1值， F 2值、 P 2值， F 3值、 P 3值分别为4组细胞干预1.5、3.5、6.5 h各指标总体比较所得；与正常血清组比较， a P<0.05；与单纯烧伤血清组比较， b P<0.05；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较， c P<0.05
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