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(1)论述了脓毒症免疫抑制时树突状细胞的变化和作用。

(2)以树突状细胞为靶点，从调控数目和功能等多个方面，论述了脓毒症治疗的免疫调理策略。

严重烧创伤、感染等因素引起的脓毒症是目前急危重症患者的主要死亡原因之一。据不完全统计，仅2017年全球就有4 890万人罹患脓毒症，其中死亡人数高达1 100万 ^{［ 1］} 。脓毒症患者病死率高且发病机制十分复杂，如何有效提高该类患者的救治水平是创烧伤外科和急危重症医学面临的重大难题。随着对脓毒症病理生理学机制研究的不断深入，人们认识到免疫功能紊乱是影响脓毒症患者不良预后的关键因素之一。因此，以改善机体免疫抑制状态为目标的调理策略日益受到关注与重视。树突状细胞（DC）是具有强大抗原提呈功能的天然免疫细胞，参与激活获得性免疫反应过程，是脓毒症免疫调理治疗的重要靶细胞，目前已成为干预严重感染并发症研究的热点与焦点。

1.   DC及其免疫学效应

业已明确，骨髓造血干细胞可在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的诱导下分化成未成熟DC，释放入血并驻留在外周组织和血液循环中。未成熟DC具有较强的吞噬能力和较弱的抗原提呈能力。机体遭受病原微生物感染后，DC接收信号刺激并分化成熟，此过程中逐渐高表达抗原提呈分子［主要组织相容性复合体Ⅰ（MHC-Ⅰ）和MHC-Ⅱ］、共刺激分子（CD80、CD86、CD40、CD40L）、黏附分子［细胞间黏附分子1（ICAM-1）、ICAM-2、ICAM-3、淋巴细胞功能相关抗原1（LFA-1）、LFA-3］和IL-12等。在趋化因子的作用下，DC迁移进入次级淋巴器官，接触并激活初始T淋巴细胞，完成天然免疫向获得性免疫的信号传递 ^{［ 2］} 。

近年来的研究提示，DC实际上是一个由表型和功能各异的细胞群组成的生物系统，根据表面分子和功能不同，DC可分为不同亚群，在不同组织器官和免疫环境下发挥抗原提呈作用。DC亚群主要包括经典DC（cDC）和浆细胞样DC（pDC），其中cDC系承担抗原提呈功能的主要亚群，可进一步分为cDC1和cDC2表型。cDC1专门用于交叉提呈或在MHC-Ⅰ类分子上提呈外源抗原，诱导初始CD8 ⁺T淋巴细胞活化，激活对细胞内病原体和肿瘤细胞的免疫反应；cDC2则通过MHC-Ⅱ类分子提呈抗原和共刺激分子诱导初始CD4 ⁺T淋巴细胞活化，激活机体对细胞外病原微生物的获得性免疫反应。虽然DC数量不足外周血单核细胞的1%，但它是迄今为止唯一能激活初始T淋巴细胞的抗原提呈细胞，在机体感染时发挥关键调节效应。

2.   脓毒症状态下DC变化的特征

不同环境下，DC的成熟程度不同，其细胞亚群比例也各异，这决定了DC免疫调控反应的多样性和复杂性。脓毒症时，由于感染病原菌的种类、感染部位、机体异质性等多种因素的影响，DC的生物学效应也存在差异，这可能是决定疾病进程和预后的重要因素。总体而言，在脓毒症状态下，未成熟DC会大量凋亡，造成DC数目持续减少；DC成熟障碍，人白细胞抗原DR（HLA-DR）、CD80、CD86表达降低，导致抗原提呈能力下降；DC分泌促炎性细胞因子（如IL-12等）减少，而分泌抗炎细胞因子（IL-10等）增多，这均使得DC诱导T淋巴细胞增殖活化能力严重受损 ^{［ 3］} 。因此，天然免疫向获得性免疫传递的信号通路受阻会造成T淋巴细胞反应低下，甚至无能，从而使机体呈现持续的免疫抑制状态。

目前临床上尚未常规开展DC数目和功能检测，仅在临床研究中采用流式细胞分析仪检测患者外周血中DC的相对比例和HLA-DR的表达量。目前认为HLA-DR的表达降低与脓毒症免疫抑制直接相关 ^{［ 4］} 。因此，将每个CD14 ⁺单核细胞表面HLA-DR数目<5 000个或HLA-DR表达量减少30%认定为免疫麻痹 ^{［ 5］} 。

3.   靶向DC凋亡的过程

DC大量凋亡直接影响抗原提呈效率和T淋巴细胞增殖活化，进而导致获得性免疫应答障碍，这是脓毒症状态下机体发生免疫抑制的主要原因。目前，仅在动物实验中开展靶向DC凋亡的研究，旨在进一步揭示DC凋亡的发生机制与意义。

有研究证实，Toll样受体2（TLR2）和TLR4参与介导脓毒症状态下DC的凋亡。相较于野生型小鼠，由盲肠结扎穿孔术（CLP）诱发脓毒症的TLR2 ^-/-或TLR4 ^-/-小鼠体内DC凋亡显著下降，并且在TLR2和TLR4双敲除的脓毒症小鼠体内DC凋亡抑制现象更加明显 ^{［ 6］} 。B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）是细胞内重要的抗凋亡分子，DC过表达Bcl-2可有效抑制LPS诱导的DC凋亡，提高脓毒症小鼠的存活率 ^{［ 7］} 。TNF相关激活诱导细胞因子（TRANCE）与细胞核因子κB受体活化因子（RANK）结合可在DC分化过程中发挥抗凋亡作用，体外观察显示TRANCE与RANK结合后可上调Bcl-2表达，抑制未成熟DC凋亡 ^{［ 8, 9］} 。最近研究显示，脓毒症患者外周血中TRANCE的表达显著减弱，但其是否与DC凋亡相关尚待证实 ^{［ 10］} 。随着对细胞死亡方式研究的不断深入，研究者观察到脓毒症发生过程中DC还能够通过焦亡、铁死亡、坏死性凋亡等不同模式介导免疫功能障碍 ^{［ 11, 12］} ，这为未来干预DC死亡、调控DC数目的策略研究提供了新途径。

4.   促进DC功能分化

DC数目的减少一方面归因于大量细胞死亡，另一方面主要是由于DC功能分化不全。因此促进DC功能分化对维持机体正常免疫应答具有重要意义。

4.1   GM-CSF

GM-CSF是诱导DC分化的天然活化因子。脓毒症时，患者血清中GM-CSF水平下降，这可能是造成DC数目减少的主要原因之一。在体外诱导骨髓造血干细胞和单核细胞向DC分化过程中，GM-CSF是不可缺少的重要细胞因子。在小鼠体内实验中，补充外源性GM-CSF可明显增加DC数量，并促进DC分化成熟，增强其抗原提呈能力，从而降低脓毒症动物病死率 ^{［ 13］} 。在临床中，GM-CSF/粒细胞集落刺激因子（G-CSF）能否显著改善脓毒症患者预后尚无定论 ^{［ 14］} 。但在伴有严重免疫抑制［单核细胞HLA-DR（mHLA-DR）表达降低］的患者中，给予GM-CSF/G-CSF治疗显著缩短了患者机械通气时间和住ICU时间，并降低了急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ评分等 ^{［ 15］} 。值得注意的是，GM-CSF是所有髓系祖细胞分化的诱导因子，不仅可以促进DC分化，还能诱导其他免疫细胞（中性粒细胞和巨噬细胞等）成熟。因此，使用GM-CSF时存在可能引发过度炎症反应、中性粒细胞激活和器官组织浸润等不良反应的风险，只有在明确的免疫抑制状态时，GM-CSF治疗才能充分发挥其有效性。

4.2   人FMS相关酪氨酸激酶3配体（Flt3L）

人Flt3L是一种可促进多种骨髓造血干细胞和前体细胞分化的细胞因子，其通过与Flt3L受体（Flt3LR）结合发挥生理作用。DC只在未成熟状态时表达Flt3LR，因此Flt3L可选择性地扩增DC前体细胞（pre-DC）的数量。在生理状态下，Flt3L对pre-DC具有重要的促增殖效应。在健康小鼠皮下注射Flt3L，9~10 d后脾脏中DC绝对数量增加数倍 ^{［ 16］} 。在健康志愿者皮下注射Flt3L同样能够有效提高外周血CD34 ⁺髓系造血干细胞和外周血DC数量 ^{［ 17］} 。在烧伤脓毒症小鼠模型中观察到，腹腔注射Flt3L可显著提高脾脏中DC的绝对数量 ^{［ 18］} 。除DC外，Flt3L还可有效促进T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞的前体细胞增殖分化，具有广泛的免疫细胞扩增效应，从而对脓毒症动物发挥良好保护作用 ^{［ 19］} 。

多种细胞因子具有刺激造血干细胞分化的能力，且具有协同效应，如Flt3L和GM-CSF联合应用可使骨髓和脾脏中DC前体细胞数量显著增加。在体外培养中，使用不同细胞因子刺激不同前体细胞向DC分化和扩增，可用于DC疫苗的制备。近年来，在肿瘤免疫治疗的临床试验中利用Flt3L辅助DC靶向疫苗的策略有效地促进了DC在体内的扩增 ^{［ 20］} 。目前脓毒症临床试验中，尚无以体内扩增DC为目标的调理研究。借鉴肿瘤领域的研究，GM-CSF和Flt3L均具有较好的安全性和耐受性，但要转化应用到脓毒症的临床治疗中，需考量患者免疫状态的异质性等因素，在获益人群、用药剂量和疗程选择等方面亟待进一步探索。

5.   改善DC免疫反应

减少DC死亡和促进DC分化是提高DC“量”的干预策略。在此基础上，改善DC的免疫反应是保证DC“质”的必要手段。

5.1   细胞因子

机体在感染病原微生物后，大量DC迅速成熟，一方面诱导T淋巴细胞活化，另一方面通过释放促炎性细胞因子IL-12等介导早期炎症反应。Oberholzer等 ^{［ 21］} 利用腺病毒将IL-10转染入DC，导致DC成熟障碍，持续低表达MHC-Ⅱ、CD86和IL-12；将此类DC输入脓毒症小鼠体内后，小鼠生存率得以改善。这可能是在脓毒症早期抑制了DC过度活化所致。但随着患者脓毒症病程进展，未成熟DC大量凋亡造成具有抗原提呈功能的成熟DC减少，同时DC分泌IL-10等抗炎细胞因子明显增多。

高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是重要的晚期炎症介质，本团队既往研究观察到适量HMGB1具有促进DC成熟的作用。但脓毒症后期，外周血中HMGB1高水平表达反而抑制DC成熟和功能发挥 ^{［ 22, 23］} 。由此可见，随着脓毒症病情进展，DC抗原提呈能力和细胞因子分泌水平是不断变化的，靶向细胞因子干预策略在治疗时间窗出现偏差的情况下有可能适得其反。例如，在γ干扰素的临床试验中亦应充分考虑患者的免疫状态。γ干扰素主要由活化的Th1分泌，能够促进单核细胞、DC成熟活化。脓毒症患者呈现免疫低下时，T淋巴细胞活化障碍，γ干扰素分泌随之减少。多项临床研究表明，在明确伴有免疫抑制（mHLA-DR降低>30%）的脓毒症患者中观察到γ干扰素治疗可有效提高mHLA-DR表达水平，但由于样本量有限，γ干扰素治疗患者的脓毒症相关性器官功能衰竭评价评分、病死率等指标与安慰剂对照患者间的差异并无统计学意义（ P>0.05） ^{［ 24, 25, 26］} 。这可能是由于脓毒症后期，机体已进入免疫抑制的恶性循环，γ干扰素虽然可以提升DC的抗原提呈能力，但仍无法逆转不良预后。

5.2   程序性死亡受体1（PD-1）及PD配体1（PD-L1）单克隆抗体

多项研究证实，共抑制分子PD-1及PD-L1广泛表达于免疫细胞表面，在免疫反应中发挥重要调控作用。其中PD-L1主要表达于DC等具有抗原提呈功能的细胞表面，通过结合T淋巴细胞表面PD-1传递负向调节信号，导致T淋巴细胞克隆无能。据报道，脓毒症患者的单核细胞表达PD-L1显著增多，并且与患者28 d病死率密切相关，是不良预后的独立危险因素 ^{［ 27］} 。目前已有多种商品化PD-1和PD-L1单克隆抗体药物进入临床应用，成为肿瘤患者的免疫辅助治疗药物。脓毒症患者外周血在体外经过PD-1和PD-L1单克隆抗体处理后，单核细胞吞噬能力明显增强；淋巴细胞凋亡减少，淋巴细胞分泌的IL-2和γ干扰素明显增多 ^{［ 28］} 。2019年Hotchkiss等 ^{［ 29, 30］} 首次在脓毒症患者群体中开展了2项临床Ⅰa期试验，初步观察了PD-1抗体（BMS-936559）和PD-L1抗体（BMS-936558）治疗的安全性。研究显示，脓毒症患者对2种药物均表现出良好的耐受性，未出现过度炎症反应等不良事件，且mHLA-DR的表达水平明显上调，初步说明靶向PD-1/PD-L1有助于改善脓毒症免疫抑制状态。这为进一步开展PD-1/PD-L1单克隆抗体治疗脓毒症的临床研究奠定了免疫学基础。

B/T淋巴细胞衰减因子（BTLA）是一种与PD-1结构相似的共抑制分子。近年的研究显示DC表面也表达BTLA，脓毒症新生儿DC表达BTLA增加，并与病情严重程度呈正相关 ^{［ 31］} 。BTLA ^-/-脓毒症小鼠存活率较野生型小鼠明显提高，但利用BTLA抗体治疗野生型脓毒症小鼠却呈现出相反结果，其表现出过度炎症反应和组织器官损伤，病死率有所提高 ^{［ 32］} 。虽然BTLA作用机制与PD-1具有相似之处，但其表达分布并不主要集中于DC，在DC功能障碍中的作用和意义有待深入探究。

6.   外源性输注DC

将免疫细胞进行体外扩增、修饰后回输的方法，如嵌合抗原受体T细胞免疫治疗、DC细胞治疗等在肿瘤领域已被广泛研究并推广应用，这说明DC体外分离培养的技术已成熟完善，具备临床转化的基础。在脓毒症领域，DC回输的试验研究尚未在临床开展，仅在动物实验中进行。将分离后的小鼠骨髓细胞在体外利用GM-CSF和IL-4共同培养诱导分化为DC［即骨髓源性DC（BMDC）］，再输注至行CLP的小鼠肺中，可有效抵御真菌感染造成的肺损伤，降低二次打击后病死率 ^{［ 33］} 。将用同样方法诱导的BMDC通过腹腔注射的方式回输行CLP的小鼠体内，小鼠多个器官病理损伤和功能障碍均得到显著改善；T淋巴细胞呈现出向Th1分化的趋势，调节性T淋巴细胞分化减少 ^{［ 34］} 。由此可见，补充功能正常的DC能减轻脓毒症免疫抑制程度，显著提高动物生存率。在此基础上，将在体外利用肺炎链球菌减毒疫苗刺激的BMDC回输入小鼠体内可明显激活Th1和Th17反应 ^{［ 35］} 。以上研究均证实外源性补充DC治疗脓毒症在理论上具有可行性和有效性，但其临床应用仍面临诸多难题。首先，临床应用的DC来源于自体外周血单核细胞在体外诱导扩增，而脓毒症患者自体细胞已经发生功能性改变，而使用健康志愿者来源的异体DC输注的安全性和有效性尚待验证；其次，脓毒症治疗所使用的DC是否需要修饰，以及如何修饰才能更有效地改善免疫低下状态仍不明确；最后，需精准评估脓毒症患者的免疫功能，针对性选择外源性补充DC的时机、剂量、疗程等。

7.   问题与展望

如上所述，虽然目前的临床研究和动物实验已经指明调控DC的主要方向，但是各种方法均存在一定局限性。维持DC数量是解决问题的关键所在，DC数目减少的机制涉及凋亡、焦亡等多种细胞死亡途径，目前抑制细胞死亡的研究仅限于动物实验和体外观察。促进骨髓造血干细胞分化可有效补充DC的数量，但是由于DC与单核/巨噬细胞是由相同祖细胞分化的，GM-CSF和Flt3L等在体内发挥非特异性的促分化作用时可能诱导其他免疫细胞过度分化，由此引起的过度炎症反应等问题不可忽视，因而在明确存在免疫抑制的条件下应用DC更为安全。改善DC功能是目前更为有效的治疗策略。干预或补充细胞因子对DC功能有明显改善作用，但仍需要大量临床实践为应用时机和剂量提供依据。阻断PD-1/PD-L1共抑制分子信号的传递，有助于提高DC的抗原提呈能力和T淋巴细胞增殖活性，在临床安全性已得到证实的情况下，期待PD-1/PD-L1单克隆抗体在脓毒症免疫调理试验中取得新的进展。

以调节DC数目和功能为目标的靶向性治疗是严重烧创伤脓毒症免疫调理的重要方向，具有潜在的转化应用前景。值得说明的是，DC的亚群和功能在不同个体存在明显异质性，在同一个体中DC的分化和成熟程度也随时间呈动态变化。因此，以DC为靶点的治疗策略也应该是多元化的，在不同免疫状态下选择相应的调理方式。