11例创伤弧菌感染患者的临床特征及该病快速诊断流程的建立

林伟鹏; 穆旭; 陈胜华; 何春景; 李汉华; 孙传伟; 卞徽宁; 赖文; 黄志锋

doi:10.3760/cma.j.cn501225-20230803-00036

11例创伤弧菌感染患者的临床特征及该病快速诊断流程的建立

doi: 10.3760/cma.j.cn501225-20230803-00036

1.
广东药科大学附属第一医院普外一科，广州　　510062
2.
广东省心血管病研究所，广东省人民医院，广东省医学科学院，广州　　510080
3.
深圳市人民医院（暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院）烧伤与创面修复科，深圳　　518020
4.
南方医科大学附属广东省人民医院（广东省医学科学院）烧伤与创面修复科，广州　　510080

基金项目:

广东省基础与应用基础研究区域联合基金重点项目 2020B151520088

详细信息

通讯作者:
黄志锋，Email：13802938068@139.com

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出版历程
- 收稿日期: 2023-08-03

Clinical characteristics of 11 patients with Vibrio vulnificus infection and the establishment of a rapid diagnosis procedure for this disease

1.
The First Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510062, China
2.
Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China
3.
Department of Burns and Wound Repair, Shenzhen People's Hospital, the First Affiliated Hospital of Southern University of Science and Technology, the Second Clinical Medicine College of Jinan University, Shenzhen 518020, China
4.
Department of Burns and Wound Repair, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, Guangzhou 510080, China

Funds:

Key Project of Guangdong Province Basic and Applied Basic Research Regional Joint Fund 2020B151520088

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Corresponding author: Huang Zhifeng, Email: 13802938068@139.com

摘要

摘要: 目的分析创伤弧菌感染患者的临床特征，分享诊疗经验，建立该病的快速诊断流程。方法该研究为回顾性病例系列研究。2009年1月—2022年11月，南方医科大学附属广东省人民医院烧伤与创面修复科收治11例符合入选标准的创伤弧菌感染患者。统计所有患者的性别，年龄，发病时间，入院时间，确诊时间，感染途径，基础疾病，受累肢体，入院时的临床表现及体征，入院时的白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、C反应蛋白（CRP）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酐、降钙素原、白蛋白、N端-B型钠尿肽前体（NT-proBNP）、血钠水平，住院期间的病原菌培养结果与宏基因组二代测序（mNGS）结果及创伤弧菌药物敏感试验结果，治疗方式，住院时间，转归。对比分析有、无海水/海产品接触史患者的入院时间和确诊时间，是、否早期接受足量抗生素治疗患者的病死比和截肢/指比。对存活的手部受累患者，统计末次随访时使用Brunnstrom分期评定的手功能情况。综合患者临床特征和救治情况，建立创伤弧菌感染的快速诊断流程。结果患者中男7例、女4例，年龄（56±17）岁，多在夏、秋季发病，入院时间为发病后3.00（1.00，4.00）d，确诊时间为发病后4.00（2.00，8.00）d。有、无海水/海产品接触史患者分别有7、4例，这2类患者的入院时间相近（ P>0.05）；有海水/海产品接触史患者确诊时间为发病后2.00（2.00，5.00）d，明显短于无海水/海产品接触史患者的发病后9.00（4.25，13.00）d（ Z=-2.01， P<0.05）。10例患者有基础疾病。患肢为右手者8例、左手者1例、下肢者2例。入院时，发热患者共9例；11例患者感染部位均伴疼痛、患肢红肿，有瘀斑/坏死、水疱/血疱的患者各9例；6例患者发生休克，2例患者发生多器官功能障碍综合征。入院时，白细胞计数、血红蛋白、白蛋白水平异常的患者数均为8例，CRP、降钙素原、NT-proBNP水平异常的患者数均为10例，肌酐、血钠水平异常的患者数均为5例，血小板计数、ALT、AST水平异常者少。住院期间，11份创面组织/分泌物标本的病原菌培养结果中4份阳性，结果回报时间为5.00（5.00，5.00）d；9份血液标本的病原菌培养结果中4份阳性，结果回报时间为3.50（1.25，5.00）d；7份创面组织/分泌物或血液标本的mNGS结果均为阳性，结果回报时间为1.00（1.00，2.00）d。3株检测出的创伤弧菌对环丙沙星、左氧氟沙星、阿米卡星等10种临床常用抗生素敏感。共10例患者接受了手术治疗，其中4例患者截肢/指；所有患者均接受了抗感染治疗。11例患者住院时间为（26±11）d，其中9例患者治愈，2例患者死亡。与未早期接受足量抗生素治疗的6例患者比较，早期接受足量抗生素治疗的5例患者的病死比、截肢/指比均无明显变化（ P>0.05）。术后3个月~2年，对8例患者进行了手功能评定，结果为残废手者4例、不完全残废手者2例、功能恢复手者2例。当患者临床表现有肢体红肿且有海水/海产品接触史或创伤弧菌脓毒症预检分诊RiCH评分≥1分时，应立即启动病原学检测，从而快速诊断创伤弧菌感染。结论创伤弧菌感染在夏、秋季多发，临床表现及实验室检测结果有明显感染特征，可伴有多器官功能损害；病死比及致残比均较高，对患肢功能影响大；早期诊断困难，易延误治疗，mNGS有助于快速检测。对于有肢体红肿伴海水/海产品接触史或创伤弧菌脓毒症预检分诊RiCH评分≥1分的患者，应立即启动病原学检测以快速诊断创伤弧菌感染。
- 创伤弧菌 /
- 感染 /
- 临床特征 /
- 手功能 /
- 快速诊断 /
- 流程
Abstract: Objective To analyze the clinical characteristics of patients with Vibrio vulnificus infection, share diagnosis and treatment experience, and establish a rapid diagnosis procedure for this disease. Methods This study was a retrospective case series study. From January 2009 to November 2022, 11 patients with Vibrio vulnificus infection who met the inclusion criteria were admitted to the Department of Burns and Wound Repair of Guangdong Provincial People's Hospital Affiliated to Southern Medical University. The gender, age, time of onset of illness, time of admission, time of diagnosis, route of infection, underlying diseases, affected limbs, clinical manifestations and signs on admission, white blood cell count, hemoglobin, platelet count, C-reactive protein (CRP), alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), creatinine, procalcitonin, albumin, N-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP), and blood sodium levels on admission, culture results and metagenomic next-generation sequencing (mNGS) results of pathogenic bacteria and the Vibrio vulnificus drug susceptibility test results during hospitalization, treatment methods, length of hospital stay, and outcomes of all patients were recorded. Comparative analysis was conducted on the admission time and diagnosis time of patients with and without a history of exposure to seawater/marine products, as well as the fatality ratio and amputation of limbs/digits ratio of patients with and without early adequate antibiotic treatment. For the survived patients with hand involvement, the hand function was assessed using Brunnstrom staging at the last follow-up. Based on patients' clinical characteristics and treatment conditions, a rapid diagnosis procedure for Vibrio vulnificus infection was established. Results There were 7 males and 4 females among the patients, aged (56±17) years. Most of the patients developed symptoms in summer and autumn. The admission time was 3.00 (1.00, 4.00) d after the onset of illness, and the diagnosis time was 4.00 (2.00, 8.00) d after the onset of illness. There were 7 and 4 patients with and without a history of contact with seawater/marine products, respectively, and the admission time of these two types of patients was similar ( P>0.05). The diagnosis time of patients with a history of contact with seawater/marine products was 2.00 (2.00, 5.00) d after the onset of illness, which was significantly shorter than 9.00 (4.25, 13.00) d after the onset of illness for patients without a history of contact with seawater/marine products ( Z=-2.01, P<0.05). Totally 10 patients had underlying diseases. The affected limbs were right-hand in 8 cases, left-hand in 1 case, and lower limb in 2 cases. On admission, a total of 9 patients had fever; 11 patients had pain at the infected site, and redness and swelling of the affected limb, and 9 patients each had ecchymosis/necrosis and blisters/blood blisters; 6 patients suffered from shock, and 2 patients developed multiple organ dysfunction syndrome. On admission, there were 8 patients with abnormal white blood cell count, hemoglobin, and albumin levels, 10 patients with abnormal CRP, procalcitonin, and NT-proBNP levels, 5 patients with abnormal creatinine and blood sodium levels, and fewer patients with abnormal platelet count, ALT, and AST levels. During hospitalization, 4 of the 11 wound tissue/exudation samples had positive pathogenic bacterial culture results, and the result reporting time was 5.00 (5.00, 5.00) d; 4 of the 9 blood specimens had positive pathogenic bacterial culture results, and the result reporting time was 3.50 (1.25, 5.00) d; the mNGS results of 7 wound tissue/exudation or blood samples were all positive, and the result reporting time was 1.00 (1.00, 2.00) d. The three strains of Vibrio vulnificus detected were sensitive to 10 commonly used clinical antibiotics, including ciprofloxacin, levofloxacin, and amikacin, etc. A total of 10 patients received surgical treatment, 4 of whom had amputation of limbs/digits; all patients received anti-infection treatment. The length of hospital stay of 11 patients was (26±11) d, of whom 9 patients were cured and 2 patients died. Compared with that of the 6 patients who did not receive early adequate antibiotic treatment, the 5 patients who received early adequate antibiotic treatment had no significant changes in the fatality ratio or amputation of limbs/digits ratio ( P>0.05). In 3 months to 2 years after surgery, the hand function of 8 patients was assessed, with results showing 4 cases of disabled hands, 2 cases of incompletely disabled hands, and 2 cases of recovered hands. When a patient had clinical symptoms of limb redness and swelling and a history of contact with seawater/marine products or a pre-examination triage RiCH score of Vibrio vulnificus sepsis ≥1, the etiological testing should be initiated immediately to quickly diagnose Vibrio vulnificus infection. Conclusions Vibrio vulnificus infection occurs most frequently in summer and autumn, with clinical manifestations and laboratory test results showing obvious infection characteristics, and may be accompanied by damage to multiple organ functions. Both the fatality and disability ratios are high and have a great impact on the function of the affected limbs. Early diagnosis is difficult and treatment is easily delayed, but mNGS could facilitate rapid detection. For patients with red and swollen limbs accompanied by a history of contact with seawater/marine products or with a pre-examination triage RiCH score of Vibrio vulnificus sepsis ≥1, the etiological testing should be initiated immediately to quickly diagnose Vibrio vulnificus infection.
- Vibrio vulnificus /
- Infection /
- Clinical characteristics /
- Hand function /
- Rapid diagnosis /
- Procedure
林伟鹏：整理数据、统计分析以及撰写论文；穆旭、陈胜华、何春景：数据整理与统计分析；李汉华、孙传伟、卞徽宁、赖文：研究指导、论文修改；黄志锋：研究指导、论文修改、经费支持

所有作者均声明不存在利益冲突

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创面是临床常见病症^［1］，创面血管新生是创面修复的关键环节之一^［2］。血管新生是一个受到精确调控的病理生理过程^［3］，该过程涉及多种细胞与细胞因子^{［4, 5］}，其中微血管内皮细胞是参与此过程的主要功能细胞^［6］，它们在多种细胞因子及信号通路的精确调控下，通过迁移、增殖、芽生等形成新生血管^{［7, 8, 9］}。

P311，官方基因符号NERP，定位于人5号染色体和小鼠18号染色体上，编码分子量为8×10³的胞内蛋白，该蛋白是一种在种属间高度保守的多功能蛋白^［10］。研究表明，P311蛋白在组织纤维化^{［11, 12, 13, 14］}、神经系统疾病^［15］、肿瘤浸润^{［16, 17］}、血压维持^［18］、组织再生^{［19, 20］}等多方面发挥重要作用。近年来研究表明，P311在创面愈合中发挥重要作用^{［21, 22, 23］}。本课题组前期研究表明，人皮肤微血管内皮细胞在静息状态下低表达P311，在炎症刺激条件下高表达P311，进而参与创面血管新生^{［22，24］}，但目前P311参与血管新生的机制仍不清楚。因此，本课题组通过前期构建的P311腺病毒转染人微血管内皮细胞1（HMEC-1），使之高表达P311，从而模拟创面愈合过程中P311的表达模式，进而探讨P311对HMEC-1体外血管形成能力的影响及其可能的分子机制。

1. 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器来源

基质胶购自美国Corning公司，HMEC系购自美国典型培养物保藏中心，MCDB131培养基购自美国Gibco公司，二甲基亚砜（DMSO）购自德国Meck公司，脂质体2000购自北京索莱宝科技有限公司，细胞计数试剂盒8（CCK-8）、二辛丁酸蛋白浓度测定试剂盒购自海门市碧云天生物技术研究所，VEGF受体2（VEGFR2）、小干扰RNA（siRNA）和阴性对照siRNA均购自广州锐博生物科技有限公司，胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）抑制剂SCH772984购自上海蓝木化工有限公司，兔抗小鼠VEGFR2单克隆抗体、兔抗小鼠磷酸化VEGFR2单克隆抗体、兔抗小鼠ERK1/2单克隆抗体、兔抗小鼠磷酸化ERK1/2单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，小鼠源性GAPDH单克隆抗体购自上海康成生物工程有限公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体和山羊抗小鼠IgG多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。710 型多功能酶标仪购自美国Thermo Fisher公司，LSM510 Meta型活细胞工作站购自德国Zeiss公司，IX71型倒置相差显微镜购自日本Olympus公司，ChemiDoc XRS型凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 HMEC-1的培养和传代

将含有10 ng/mL EGF、10 mmol/L谷氨酰胺、1 µg/mL氢化可的松和体积分数10%胎牛血清的MCDB131培养基（以下称完全培养基）加入底面积25 cm²的培养瓶后，将1×10⁶个HMEC-1接种至该培养瓶中培养，每隔2 d换液1次，待细胞生长达85%融合以上，使用2.5 g/L胰蛋白酶+0.1 g/L乙二胺四乙酸消化后，按1∶3进行细胞传代。取第3~5代细胞用于后续实验。

1.3 P311高表达对HMEC-1增殖、迁移和血管形成能力的影响

1.3.1 细胞分组及处理

用完全培养基调整HMEC-1浓度为1×10⁵个/mL，接种于6孔板中，每孔1 mL。待细胞生长达60%左右融合时，将其按随机数字表法（分组方法下同）分为P311腺病毒组和空载腺病毒组。P311腺病毒组细胞每孔加入10 μL P311腺病毒，空载腺病毒组细胞每孔加入10 μL空载腺病毒（P311腺病毒和空载腺病毒均由本课题组前期构建），转染48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.3.2 CCK-8法检测P311高表达对HMEC-1增殖活性的影响

取P311腺病毒组和空载腺病毒组细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2×10⁴个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，每组3个复孔。于培养1、3、5 d，分别使用CCK-8法检测2组细胞增殖活性。检测时，吸弃原有培养基，将完全培养基和CCK-8溶液按体积比10∶1混合，每孔加入混合液100 μL，37 ℃孵育2 h，使用多功能酶标仪测定波长450 nm处的吸光度值，以此代表细胞增殖活性。本实验重复6次。

1.3.3 划痕试验检测P311高表达对HMEC-1迁移能力的影响

取P311腺病毒组和空载腺病毒组细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2×10⁴个/mL，接种于24孔板中，每孔1 mL，每组3个复孔。待细胞生长达90%以上融合时，吸弃原有培养基，加入500 μL含2.5 μg/mL丝裂霉素C的完全培养基继续培养2 h。使用100 μL移液枪枪头和直尺在HMEC-1单细胞层上做一直线划痕。吸弃原有培养基，加入PBS冲洗2遍，加入新鲜完全培养基。将细胞置于活细胞工作站倒置相差显微镜200倍镜下观察11 h，记录细胞迁移情况。使用ImageJ 1.48V图像分析软件（美国国立卫生研究院）测量划痕后0（即刻）、6、11 h剩余划痕面积，并计算剩余划痕面积百分比。剩余划痕面积百分比=剩余划痕面积÷初始划痕面积×100%。本实验重复6次。

1.3.4 体外血管形成实验检测P311高表达对HMEC-1血管形成能力的影响

首先将50 μL基质胶加入预冷的96孔板中，在37 ℃培养箱中放置45 min。然后加入用无血清MCDB131培养基培养24 h的P311腺病毒组和空载腺病毒组细胞，用完全培养基调整细胞浓度为4×10⁵个/mL，每孔50 μL，每组3个复孔，在37 ℃培养箱中培养8 h，倒置相差显微镜200倍镜下观察血管形成情况并拍照，采用ImageJ 1.48V图像分析软件测量管状结构节点数和总长度。本实验重复6次。

1.3.5 蛋白质印迹法检测P311高表达对VEGFR2/ERK1/2信号通路的影响

取P311腺病毒组和空载腺病毒组细胞，充分裂解后，以离心半径10 cm、14 000 r/min离心15 min后收集上清液，二辛丁酸法进行蛋白定量。向上样孔内加入20 μg待测蛋白质样品，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜后，用30 g/L牛血清白蛋白溶液封闭3 h，分别加入兔抗小鼠VEGFR2单克隆一抗、兔抗小鼠磷酸化VEGFR2单克隆一抗、兔抗小鼠ERK1/2单克隆一抗、兔抗小鼠磷酸化ERK1/2单克隆一抗（稀释比均为1∶1 000）及小鼠源性GAPDH单克隆一抗（稀释比为1∶10 000），4 ℃孵育过夜。次日取出抗体孵育盒，室温下静置1 h，洗涤后分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆二抗和山羊抗小鼠IgG多克隆二抗（稀释比均为1∶2 000），室温孵育1 h。化学发光液浸泡条带后，凝胶成像仪下曝光，并采集图像，Quantity one软件进行灰度值分析，VEGFR2、ERK1/2的蛋白表达量分别以其与GAPDH灰度值比值表示，磷酸化VEGFR2、磷酸化ERK1/2的蛋白表达量分别以其与VEGFR2、ERK1/2的灰度值比值表示。本实验重复6次。

1.4 P311高表达对HMEC-1 VEGFR2/ERK1/2信号通路及体外血管形成能力的影响

1.4.1 蛋白质印迹法检测siRNA-VEGFR2对P311高表达引起的VEGFR2/ERK1/2信号通路活化的影响

用完全培养基调整HMEC-1浓度为1×10⁵个/mL，接种于6孔板中，每孔1 mL。待细胞生长达60%左右融合时，分为P311腺病毒+阴性对照siRNA组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组，每组3个复孔。P311腺病毒+阴性对照siRNA组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组细胞每孔分别加入10 μL P311腺病毒、空载腺病毒，24 h后，再采用脂质体2000转染终物质的量浓度50 nmol/L阴性对照siRNA；P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组细胞每孔分别加入10 μL P311腺病毒、空载腺病毒，24 h后，采用脂质体2000转染终物质的量浓度50 nmol/L的siRNA-VEGFR2（靶基因序列为5'-GGAAATCTCTTGCAAGCTA-3'）。转染24 h，同1.3.5采用蛋白质印迹法检测VEGFR2、磷酸化VEGFR2、ERK1/2、磷酸化ERK1/2的蛋白表达情况。本实验重复6次。

1.4.2 体外血管形成实验检测siRNA-VEGFR2对P311高表达介导的血管形成作用的影响

取HMEC-1，同1.4.1分组及处理，同1.3.4检测各组细胞体外血管形成情况。本实验重复6次。

1.4.3 蛋白质印迹法检测ERK1/2抑制剂对P311高表达引起的ERK1/2信号通路活化的影响

取HMEC-1，用完全培养基调整HMEC-1浓度为1×10⁵个/mL，接种于6孔板中，每孔1 mL，待细胞生长达60%左右融合时，分为P311腺病毒+DMSO组、载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组，每组1孔。P311腺病毒+DMSO组和空载腺病毒+DMSO组细胞每孔分别加入10 μL P311腺病毒、空载腺病毒，24 h后，加入10 μL DMSO处理2 h；P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组细胞每孔分别加入10 μL P311腺病毒、空载腺病毒，24 h后，加入终物质的量浓度5 nmol/L ERK1/2抑制剂SCH772984处理2 h。同1.3.5采用蛋白质印迹法检测ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达情况。本实验重复6次。

1.4.4 体外血管形成实验检测ERK1/2抑制剂对P311高表达介导的血管形成作用的影响

取HMEC-1，同1.4.3分组及处理，同1.3.4检测各组细胞体外血管形成情况。本实验重复6次。

1.5 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。所有计量资料数据均符合正态分布，以x¯±s表示。2组多个时间点组间总体比较行重复测量方差分析，组间两两比较进行独立样本t检验；多组间单一时间点总体比较行单因素方差分析，组间两两比较行LSD检验（软件自动略去该统计量值）。P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1 P311高表达对HMEC-1增殖、迁移和血管形成能力的影响

2.1.1 细胞增殖活性

与空载腺病毒组比较，P311腺病毒组细胞培养各时间点增殖活性均没有明显改变（P>0.05），见表1。

表1 2组人微血管内皮细胞1培养各时间点增殖活性比较（x¯±s）

组别	样本数	1 d	3 d	5 d
P311腺病毒组	6	0.188±0.030	0.415±0.032	0.713±0.030
空载腺病毒组	6	0.185±0.019	0.392±0.030	0.687±0.031
t值		-0.23	-1.30	-1.52
P值		0.822	0.222	0.160
注：处理因素主效应，F=5.10，P=0.074；时间因素主效应，F=720.12，P<0.001；两者交互作用，F=0.81，P=0.473

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2.1.2 细胞迁移能力

P311腺病毒组细胞划痕后6、11 h剩余划痕面积百分比较空载腺病毒组明显降低（P<0.05），见表2、图1。

表2 2组人微血管内皮细胞1划痕后各时间点剩余划痕面积百分比比较（%，x¯±s）

组别	样本数	6 h	11 h
P311腺病毒组	6	47±7	9±5
空载腺病毒组	6	55±5	20±10
t值		-2.47	-2.62
P值		0.033	0.025
注：初始剩余划痕面积百分比均为100%；处理因素主效应，F=18.42，P=0.008；时间因素主效应，F=443.86，P<0.001；两者交互作用，F=7.89，P=0.041

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1 2组人微血管内皮细胞1划痕后各时间点剩余划痕面积倒置相差显微镜×200，图中标尺为100 μm。1A、1B、1C.分别为P311腺病毒组划痕后0（即刻）、6、11 h，随着划痕后时间的延长，剩余划痕面积逐渐减少，至划痕后11 h划痕基本愈合；1D、1E、1F.分别为空载腺病毒组划痕后0、6、11 h，图1E、1F剩余划痕面积分别较图1B、1C明显增大

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2.1.3 细胞血管形成能力

培养8 h，P311腺病毒组细胞管状结构节点数为（731±104）个，明显多于空载腺病毒组的（496±74）个（t=4.49，P=0.001）；P311腺病毒组细胞管状结构总长度为（19 231±2 647）μm，明显长于空载腺病毒组［（12 670±2 077）μm，t=4.78，P=0.001］。见图2。

2 2组人微血管内皮细胞1培养8 h血管形成情况倒置相差显微镜×200，图中标尺为100 μm。2A. P311腺病毒组管状结构节点数较多，管状结构总长度较长；2B.空载腺病毒组管状结构节点数少于图2A，管状结构总长度短于图2A

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2.1.4 细胞中VEGFR2/ERK1/2信号通路

转染48 h，与空载腺病毒组比较，P311腺病毒组细胞VEGFR2、ERK1/2蛋白表达量均无明显变化（t值分别为0.28、1.36，P值分别为0.786、0.202），磷酸化VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显升高（t值分别为17.27、16.08，P<0.001）。见图3。

3 蛋白质印迹法检测2组人微血管内皮细胞1转染48 h VEGFR2/ERK1/2信号通路相关蛋白的表达量。3A.条带图；3B.条图（样本数为6，x¯±s）

注：VEGFR2为血管内皮生长因子受体2，ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带图上方1、2分别为P311腺病毒组和空载腺病毒组；与空载腺病毒组比较，^aP<0.01

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2.2 P311通过VEGFR2/ERK1/2信号通路影响HMEC-1体外血管形成能力

2.2.1 siRNA-VEGFR2对P311高表达引起的VEGFR2/ERK1/2信号通路活化的影响

转染24 h，P311腺病毒+阴性对照siRNA组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组细胞磷酸化VEGFR2、VEGFR2和磷酸化ERK1/2蛋白表达量总体比较，差异均有统计学意义（F值分别为27.89、25.07、14.20，P<0.001）；4组间细胞ERK1/2蛋白表达量总体比较，差异无统计学意义（F=0.08，P=0.971）。

转染24 h，P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞磷酸化VEGFR2和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于空载腺病毒+阴性对照siRNA组（P值分别为<0.001、0.001），2组细胞VEGFR2和ERK1/2蛋白表达量相近（P值分别为0.063、0.640）。P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞VEGFR2、磷酸化VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组（P<0.001），2组细胞ERK1/2蛋白表达量相近（P=0.822）。空载腺病毒+阴性对照siRNA组细胞VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组（P值分别为<0.001、0.049），该2组细胞磷酸化VEGFR2和ERK1/2蛋白表达量相近（P值分别为0.071、0.761）。转染24 h，P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组细胞VEGFR2、磷酸化VEGFR2、ERK1/2和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均相近（P值分别为0.155、0.493、0.952、0.314）。见图4。

4 蛋白质印迹法检测4组人微血管内皮细胞1转染24 h VEGFR2/ERK1/2信号通路相关蛋白的表达量。4A.条带图；4B.条图（样本数为6，x¯±s）

注：VEGFR2为血管内皮生长因子受体2，ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带图上方1、2、3、4分别为P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA（siRNA）组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA- VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组；与P311腺病毒+阴性对照siRNA组比较，^aP<0.01；与空载腺病毒+阴性对照siRNA组比较，^bP<0.01，^cP<0.05

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2.2.2 siRNA-VEGFR2对P311高表达介导的血管形成能力的影响

转染24 h，P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞管状结构节点数明显多于空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组（P值均<0.01），管状结构总长度明显长于空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组（P值均<0.01）。转染24 h，空载腺病毒+阴性对照siRNA组细胞管状结构节点数明显多于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组（P<0.01），管状结构总长度明显长于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组（P<0.01）。P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组细胞管状结构节点数和管状结构总长度相近（P>0.05）。见图5、表3。

5 4组人微血管内皮细胞1转染24 h血管形成情况倒置相差显微镜×200，图中标尺为100 μm。5A.P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA（siRNA）组管状结构节点数较多，管状结构总长度较长；5B.空载腺病毒+阴性对照siRNA组管状结构节点数明显少于图5A，管状结构总长度明显短于图5A；5C.P311腺病毒+siRNA-血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）组管状结构节点数明显少于图5A，管状结构总长度明显短于图5A；5D.空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组管状结构节点数明显少于图5B，管状结构总长度明显短于图5B，且均与图5C相近

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表3 4组人微血管内皮细胞1转染24 h后血管形成情况（x¯±s）

组别	样本数	管状结构节点数（个）	管状结构总长度（μm）
P311腺病毒+阴性对照siRNA组	6	720±62	21 241±1 139
空载腺病毒+阴性对照siRNA组	6	428±38	17 005±1 156
P311腺病毒+siRNA- VEGFR2组	6	364±57	13 494±2 465
空载腺病毒+siRNA- VEGFR2组	6	310±75	11 600±2 776
F值		57.07	26.32
P值		<0.001	<0.001
P₁值		<0.001	0.002
P₂值		<0.001	<0.001
P₃值		0.002	<0.001
P₄值		0.127	0.121
注：F值、P值为4组间各指标总体比较所得；P₁值、P₂值分别为P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA（siRNA）组与空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）组比较所得，P₃值、P₄值分别为空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组与空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组比较所得

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2.2.3 ERK1/2抑制剂对P311高表达引起的ERK1/2信号通路活化的影响

处理2 h，P311腺病毒+DMSO组、空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达量总体比较，差异有统计学意义（F=16.79，P<0.001）；4组细胞ERK1/2 蛋白表达量总体比较，差异无统计学意义（F=0.99，P=0.419）。

P311腺病毒+DMSO组细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显高于空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组（P值均<0.001），P311腺病毒+DMSO组与空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组细胞ERK1/2蛋白表达量均相近（P值分别为0.806、0.467）。空载腺病毒+DMSO组细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显高于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组（P=0.030），2组细胞ERK1/2 蛋白表达量相近（P=0.140）。P311腺病毒+ERK1/2 抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组细胞磷酸化ERK1/2和ERK1/2蛋白表达量均相近（P值分别为0.591、0.373）。见图6。

6 蛋白质印迹法检测4组人微血管内皮细胞1处理2 h ERK1/2信号通路相关蛋白的表达量。6A.条带图；6B.条图（样本数为6，x¯±s）

注：F值、P值为4组间各指标总体比较所得；ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带图上方1、2、3、4分别为P311腺病毒+二甲基亚砜（DMSO）组、空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组；与P311腺病毒+DMSO组比较，^aP<0.01；与空载腺病毒+DMSO组比较，^bP<0.05

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2.2.4 ERK1/2抑制剂对P311高表达介导的促HMEC-1体外血管形成作用的影响

于处理2 h，P311腺病毒+DMSO组细胞管状结构节点数明显多于空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组（P值均<0.01），管状结构总长度明显长于空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组（P值均<0.01）。空载腺病毒+DMSO组管状结构节点数明显多于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组（P<0.01），管状结构总长度明显长于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组（P<0.01）。P311腺病毒+ERK1/2 抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组细胞管状结构节点数和总长度均相近（P>0.05）。见图7、表4。

7 4组人微血管内皮细胞1处理2 h血管形成情况倒置相差显微镜×200，图中标尺为100 μm。7A.P311腺病毒+二甲基亚砜（DMSO）组管状结构节点数较多，管状结构总长度较长；7B.空载腺病毒+DMSO组管状结构节点数少于图7A，管状结构总长度短于图7A；7C.P311腺病毒+胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）抑制剂组管状结构节点数少于图7A，管状结构总长度短于图7A；7D.空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组管状结构节点数和总长度与图7C相近

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表4 4组人微血管内皮细胞1处理2 h血管形成情况（x¯±s）

组别	样本数	管状结构节点数（个）	管状结构总长度（μm）
P311腺病毒+DMSO组	6	726±72	20 318±1 433
空载腺病毒+DMSO组	6	421±39	16 846±1 464
P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组	6	365±41	15 114±1 950
空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组	6	317±67	13 188±2 306
F值		63.49	16.53
P值		<0.001	<0.001
P₁值		<0.001	0.004
P₂值		<0.001	<0.001
P₃值		0.005	0.002
P₄值		0.162	0.083
注：F值、P值为4组间各指标总体比较所得；DMSO为二甲基亚砜，ERK1/2为胞外信号调节激酶1/2；P₁值、P₂值分别为P311腺病毒+DMSO组与空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组比较所得，P₃值、P₄值分别为空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组与空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组比较所得

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3. 讨论

创面愈合过程被划分为4个连续而又有重叠的阶段，包括凝血期、炎症期、增殖期和重构期^［25］。创面一旦形成，就开始了局部新的血液供应系统的建立，该进程贯穿整个创面修复过程^［2］，但其机制仍不完全清楚。本课题组前期研究表明，皮肤微血管内皮细胞在静息状态下低表达P311，在炎症刺激条件下高表达P311，进而参与创面血管新生^［22］。本研究进一步证实，P311能够通过激活VEGFR2/ERK1/2 信号通路，发挥促进HMEC-1血管形成的作用。

P311基因是一种损伤环境诱导型基因，即在静息状态下低表达或者不表达，当受到外界环境刺激时表达升高，从而发挥相关生物学功能^{［22, 23］}。该基因能够编码一种种属间高度保守的细胞内多功能蛋白^［10］。在创面愈合过程中，P311持续高表达，可增强表皮干细胞Rho A和Rac1蛋白的活性^［21］，并激活TGF-β₁/Smad信号通路^［23］，从而发挥促进创面修复作用。近年来研究表明，P311表达于创面皮肤微血管内皮细胞，P311基因敲除导致皮肤创面愈合过程中的血管新生减弱，进而导致创面愈合延迟；P311基因敲除皮肤微血管内皮细胞迁移及血管形成能力均减弱^［22］。这些研究结果提示P311可能通过影响微血管内皮细胞的迁移和血管形成能力参与血管新生。微血管内皮细胞具有正常有效的增殖能力在血管形成中也至关重要^［26］。

本研究用P311腺病毒转染HMEC-1，CCK-8法检测结果显示，P311腺病毒组和空载腺病毒组HMEC-1增殖能力没有明显差异；划痕试验结果显示，P311腺病毒组HMEC-1迁移能力较空载腺病毒组明显增强；体外血管形成实验结果显示，P311腺病毒组HMEC-1血管形成能力较空载腺病毒组明显增强。以上结果表明P311高表达能够显著提高HMEC-1的迁移能力和体外血管形成能力，而对HMEC-1增殖能力没有明显影响。

VEGFR2信号通路在启动血管内皮细胞各项生物学过程中发挥重要作用^［27］。VEGFR2活化是VEGFR2同二聚化或异二聚化导致酪氨酸激酶的活化和受体细胞内结构域中酪氨酸残基的自磷酸化^{［28, 29］}。VEGFR2活化后启动血管内皮细胞内多种信号通路^［30］。研究表明，在小鼠中VEGFR2 Tyr1173磷酸化（人类中Tyr1175磷酸化）对ERK1/2 激活至关重要^［31］。ERK1/2信号通路与细胞的成活^［32］、迁移^［33］、血管形成^［34］等生物学过程密切相关^［35］。然而，此前尚鲜见有关P311对VEGFR2活化和ERK1/2活化的影响的研究。本研究采用蛋白质印迹法检测P311腺病毒组和空载腺病毒组HMEC-1中VEGFR2、磷酸化VEGFR2、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的蛋白表达水平，结果显示，P311高表达对HMEC-1 VEGFR2、ERK1/2的蛋白表达没有明显影响，但是却能够促进VEGFR2、ERK1/2的磷酸化。根据上述结果可以得出，P311高表达可以激活VEGFR2/ERK1/2信号通路，该机制可能参与了P311促HMEC-1体外血管形成的作用。

为进一步探讨P311介导的促体外血管形成作用是否通过激活VEGFR2/ERK1/2信号通路而发挥作用，本研究分别采用siRNA-VEGFR2和ERK抑制剂SCH772984阻断VEGFR2/ERK1/2信号通路的活化，随后采用蛋白质印迹法检测细胞VEGFR2磷酸化和ERK1/2磷酸化水平的变化，采用体外血管形成实验检测细胞血管形成能力的变化。结果显示，P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞磷酸化VEGFR2和磷酸化ERK1/2蛋白表达水平均明显高于空载腺病毒+阴性对照siRNA组，提示P311高表达能够促进VEGFR2/ERK1/2信号通路活化。在阻断VEGFR2途径后，VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平均明显降低，HMEC-1体外血管形成能力明显减弱，提示siRNA-VEGFR2能够抑制P311高表达引起的VEGFR2/ERK1/2信号通路活化，进而抑制P311高表达介导的促HMEC-1体外血管形成作用。另外，在抑制ERK1/2信号通路后，ERK1/2磷酸化水平均明显降低，HMEC-1体外血管形成能力明显减弱，提示ERK1/2抑制剂能够抑制P311高表达引起的ERK1/2信号通路活化，进而抑制P311高表达介导的促HMEC-1体外血管形成作用。由此推测，P311通过激活VEGFR2/ERK1/2信号通路发挥促进HMEC-1血管形成的作用。

综上所述，P311在创面血管新生中发挥重要作用，能够通过激活VEGFR2/ERK1/2信号通路发挥促进HMEC-1血管形成的作用。本研究结果丰富了创面愈合理论，为促进皮肤创面修复提供了新思路、新线索与新靶点。

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林伟鹏：整理数据、统计分析以及撰写论文；穆旭、陈胜华、何春景：数据整理与统计分析；李汉华、孙传伟、卞徽宁、赖文：研究指导、论文修改；黄志锋：研究指导、论文修改、经费支持

所有作者均声明不存在利益冲突

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1 2例创伤弧菌感染患者创面情况及处理方法。1A.入院时，患肢可见水疱、瘀斑并伴红肿；1B.入院第2天行切开清创手术，可见深层筋膜、肌肉坏死；1C.入院第7天，因红肿扩散未能控制，将肢体全长切开减压；1D.入院第20天，感染得到控制，行缝合+左侧腹股沟区刃厚皮片移植修复创面；1E.末次术后1个月，手指仍肿胀，伸展动作受限；1F.入院时，患肢侧面见皮肤溃烂、有水疱，将手背局部切开；1G.入院时，患肢掌面见局部指端坏死，有不规则的小切口；1H.入院第1天，行切开清创手术，清除坏死皮肤、局部切开减压；1I、1J.分别为入院第21天，用右侧大腿刃厚皮片修复创面+截指手术后掌面、背面观

注：图1A~1E为一例患者患肢情况，图1F~1J为另一例患者患肢情况

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