Effects of immune responses mediated by topological structures of three-dimensional bioprinted scaffolds on hair follicle cycle in mice
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摘要:
目的 探讨具有不同拓扑结构的三维生物打印支架介导的免疫反应对小鼠毛囊周期的影响。 方法 该研究为实验研究。将海藻酸钠-明胶复合水凝胶用三维生物打印机打印成3种支架，并按照支架的3种拓扑结构（打印时打印喷头的旋转角度分别为45°、60°、90°），分别命名为T45支架、T60支架、T90支架，肉眼观察3种支架交联后的形态。取9只8周龄雌性C57BL/6J小鼠，按随机数字表法分为T45组、T60组、T90组，每组3只，分别于背部皮下埋植T45、T60、T90支架。于植入后7 d，观察小鼠背部脱毛区毛发生长情况，行苏木精-伊红染色观测支架周围的纤维囊厚度，行免疫荧光染色检测支架周围组织中CD68、骨形态发生蛋白2（BMP-2）、肿瘤坏死因子（TNF）蛋白的表达水平。以上实验样本数均为3。 结果 3种支架交联后均拓扑结构明显，保真度高。植入后7 d，T45组、T90组小鼠背部脱毛区毛发均生长明显；T60组小鼠支架植入区毛发生长缓慢，与未植入区差别明显。植入后7 d，与T90组［（18±4）μm］相比，T45组、T60组小鼠支架周围的纤维囊厚度［（39±4）、（55±8）μm］均明显增加（ P<0.05）；与T45组相比，T60组小鼠支架周围的纤维囊厚度明显增加（ P<0.05）。植入后7 d，T60组小鼠支架周围组织中CD68蛋白的表达水平明显高于T45组和T90组（ P值均<0.05）；T60组小鼠支架周围组织中BMP-2蛋白的表达水平明显高于T45组、T90组（ P值均<0.05），T45组小鼠支架周围组织中BMP-2蛋白的表达水平明显高于T90组（ P<0.05）；T60组小鼠支架周围组织中TNF蛋白的表达水平明显低于T45组和T90组（ P值均<0.05）。 结论 具有不同拓扑结构的三维生物打印支架植入小鼠体内后会介导不同程度的免疫反应。适度的免疫反应可促进小鼠脱毛区毛发生长，过强的免疫反应抑制毛囊进入生长期。 Abstract:Objective To explore the effects of the immune responses mediated by topological structures of three-dimensional bioprinted scaffolds on hair follicle cycle in mice. Methods The study was an experimental research. The alginate-gelatin composite hydrogels were printed into scaffolds using a three-dimensional bioprinter and named T45 scaffolds, T60 scaffolds, and T90 scaffolds according to the 3 topological structures of the scaffolds (the rotation angles of the printhead during printing were 45°, 60°, and 90°, respectively), and the morphology of the three scaffolds was observed after cross-linking by naked eyes. Nine 8-week-old female C57BL/6J mice were divided into T45 group, T60 group, and T90 group, according to the random number table, with three mice in each group, and the T45, T60, and T90 scaffolds were subcutaneously implanted on the back of mice, respectively. On post implantation day (PID) 7, the hair growth in the dorsal depilated area of mice was observed, the thickness of the fiber capsule around the scaffolds was observed by hematoxylin-eosin staining, and the expression levels of CD68, bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), and tumor necrosis factor (TNF) protein in the tissue surrounding the scaffolds were observed by immunofluorescence staining. The samples of the above experiments were all 3. Results The topological structures of the three scaffolds were all clear with high fidelity after cross-linking. On PID 7, the hair growth was obvious in the dorsal depilated area of mice in T45 group and T90 group, while hair growth was slow in the scaffold implantation area of mice in T60 group, which was significantly different from that of the unimplanted area. On PID 7, compared with (18±4) μm in T90 group, the thickness of both the fiber capsule around the scaffolds ((39±4) and (55±8) μm) of mice in T45 group and T60 group was significantly increased ( P<0.05); the thickness of the fiber capsule around the scaffolds of mice in T60 group was also significantly increased compared with that in T45 group ( P<0.05). On PID 7, the expression level of CD68 protein in the tissue surrounding the scaffolds of mice in T60 group was significantly higher than the levels in T45 group and T90 group (with both P values <0.05). The expression level of BMP-2 protein in the tissue surrounding the scaffolds of mice in T60 group was significantly higher than the levels in T45 group and T90 group (with both P values <0.05), and the expression level of BMP-2 protein in the tissue surrounding the scaffolds of mice in T45 group was significantly higher than that in T90 group ( P<0.05). The expression level of TNF protein in the tissue surrounding the scaffolds of mice in T60 group was significantly lower than the levels in T45 group and T90 group (with both P values <0.05). Conclusions Three-dimensional bioprinted scaffolds with different topological structures mediate different degrees of immune responses after being implanted in mice. A moderate immune response promotes hair growth in depilated area of mice, while an excessive immune response results inhibits the hair follicle entering into the anagen phase. -
Key words:
- Tissue engineering /
- Printing, three-dimensional /
- Immunity /
- Tissue scaffolds /
- Hair follicle /
- Topology
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窦道型慢性创面是临床中比较常见的慢性创面，目前尚无统一定义［1］，通常是指开口于体表，向深部组织走行的慢性创面。近年来，窦道型慢性创面的诊断和治疗受到了多位学者的关注［2, 3, 4, 5］，也已引起各国卫生组织的高度重视［6］。创面测量在监测创面愈合过程和评估治疗效果方面具有重要意义［2，7, 8］，付小兵［9］院士也指出对创面进行客观准确的评估是判断疾病状况、评价各种治疗方式的根本。明确窦道型慢性创面的窦道长度、形态及内部病理学特征将有助于此类创面的诊治，但是传统方法通过探针凭经验探查创面，既无法充分获得窦道的真实长度［10］，又无法观测到窦道内部的病理特征。
本课题组引入了内镜联合CT造影检查的方法，其中CT造影检查基本可以反映窦道型慢性创面中窦道的真实长度，内镜通过窦道外口伸入可观察到窦道内部的情况，该方法有望成为此类创面有效且微创的诊治手段［11, 12］。本课题组前期研究使用的是硬性内镜，在临床实践中了解到当窦道型慢性创面的窦道出现一定程度的弯曲时，通过硬性内镜无法观察到完整的窦道内部情况［10］，因此本课题组进一步引入了软性内镜进行研究。本研究旨在比较软性内镜和硬性内镜在不同形态窦道型慢性创面临床检查中的应用价值。
1. 对象与方法
本回顾性观察性研究经上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准，批号：20170701。
1.1 入选标准
纳入标准：创面表现为皮肤表面溃疡并向深部组织走行者，病程30 d以上者，完成CT造影、硬性内镜及软性内镜全部检查者。排除标准：窦道型慢性创面已进入体腔者，有认知障碍无法配合研究者。
1.2 临床资料
2019年1月1日—12月23日，上海交通大学医学院附属瑞金医院创面修复中心收治的46例窦道型慢性创面患者符合入选标准，纳入本研究。患者中男、女各23例，年龄18~81（48±21）岁。窦道型慢性创面病因分类：医源性23例、感染性16例、压力性7例。在回顾性收集数据前，入组患者签署书面知情同意书。
1.3 主要材料来源
用于CT检查的对比剂为质量浓度350 mg/mL的碘海醇注射液，购自通用电气药业（上海）有限公司。uCT 510型CT机购自上海联影医疗科技有限公司，Mimics 17.0 CT图像测量软件购自比利时Materialise公司，千牧Q8000-L25型内窥镜系统（含长18 cm、0°、直径2.7 mm、光学放大倍率20倍的硬性内镜和图像显示仪及冷光源）购自广州市千牧电子有限公司，电子鼻咽喉内镜系统（含长51 cm、0°、直径2.6 mm、光学放大倍率20倍的软性内镜和图像显示仪及冷光源）购自日本奥林巴斯株式会社。
1.4 检测方法
入院时，对患者行CT造影、硬性内镜和软性内镜检查，其中硬性内镜和软性内镜检查免费。CT造影检查过程如下：（1）清除窦道内渗出物和脱落的坏死组织；（2）注射对比剂碘海醇注射液填充窦腔；（3）保持患者在一个适当的位置1 min；（4）采用CT机行CT检查。利用Mimics17.0 CT图像测量软件对图像进行三维重建，得到窦道的长度。硬性内镜检查过程如下：采用千牧Q8000-L25型内窥镜系统，将硬性内镜伸入窦道型慢性创面内部至可见视野最远端，并用直尺测量硬性内镜的进入长度。软性内镜检查过程如下：采用电子鼻咽喉内镜系统，将软性内镜伸入窦道型慢性创面内部至可见视野最远端，并用直尺测量软性内镜的进入长度。
1.5 统计分析指标
（1）根据CT造影及三维重建的形态结果，对窦道型慢性创面进行分类；将含明显弯曲、无明显弯曲窦道的创面分别归入曲线组、直线组。（2）记录“CT造影检查测得的创面窦道长度”（下称参考长度），计算各组创面中软性内镜或硬性内镜检查测得的“创面窦道长度与参考长度的偏差率”（下称长度偏差率），长度偏差率=（参考长度-软性内镜或硬性内镜检查测得的创面窦道长度）÷参考长度×100%，比较各组创面中软性内镜与硬性内镜检查测得的长度偏差率及二者与参考长度偏差率（0）之间的差异。
1.6 统计学处理
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料数据符合正态分布者以
2. 结果
2.1 窦道型慢性创面形态及分组
CT造影及三维重建显示，本组患者创面窦道形态大致可分为4种，包括管状（36/46）、片状（4/46）、棒槌状（4/46）及不规则状（2/46），其中，管状进一步分为I型（23/36）、L型（4/36）和Y型（9/36）。见图1。共31个含I型管状、片状或棒槌状窦道的创面归为直线组，占67.4%；共15个含Y型管状、L型管状或不规则状窦道的创面归为曲线组，占32.6%。
1 窦道型慢性创面CT造影及三维重建形态。1A.I型管状；1B.L型管状；1C.Y型管状；1D.片状；1E.棒槌状；1F.不规则状注：各图中左下角红框中图片为箭头指示处创面形态的放大图2.2 长度偏差率
在直线组中，硬性内镜、软性内镜检查测得的长度偏差率均为0。在曲线组中，软性内镜检查测得的长度偏差率为0（0，0.58%），明显低于硬性内镜检查测得的41.18%（31.68%，48.41%），Z=-3.408，P=0.001；硬性内镜检查测得的长度偏差率（40±19）%明显高于参考长度偏差率（t=8.343，P<0.001），软性内镜检查测得的长度偏差率与参考长度偏差率相近（Z=-1.342，P=0.180）。
2.3 典型病例
患者男，80岁，主诉骶尾部窦道创面形成3个月入院。该患者因大面积脑梗死卧床4年，3个月前骶尾部出现破溃，自行处置后未见愈合并形成窦道创面，无其他系统疾病和长期服药史，诊断为压力性窦道型慢性创面。门诊即行一般检查，骶尾部偏左侧可见约1.0 cm×0.5 cm皮肤破溃，创周质韧，色白，窦口未见明显渗出。入院时，CT造影及三维重建检查显示该创面窦道呈L型管状（曲线组），测得窦道长度为5.04 cm；应用硬性内镜只能检查从窦口到窦道拐点处，无法了解窦道内部全部情况，测得窦道长度为2.50 cm，长度偏光率为49.41%；应用软性内镜检查测得窦道长度为4.95 cm，与CT造影及三维重建检测结果相近，长度偏光率为1.79%。见图2。
2 不同方法检查患者压力性窦道型慢性创面情况。2A.骶尾部偏左侧可见约1.0 cm×0.5 cm皮肤破溃，创周色白，窦口未见明显渗出；2B.CT造影及三维重建检查显示窦道呈L型管状，长度为5.04 cm；2C.硬性内镜检查测得窦道长度为2.50 cm；2D.软性内镜检查测得窦道长度为4.95 cm3. 讨论
关于窦道型慢性创面的窦道实际长度及形态的获得方法，理论上应在外科完整切除窦道后测量［4］，但考虑到伦理要求和实际处理情况，不能为了测量而切除所有患者的窦道型慢性创面。研究显示CT造影及三维重建对创面的范围和形状有一定的判断价值，还可以明确其与周围组织器官的关系［13, 14, 15, 16, 17］，因此本研究选用了CT造影检查后三维重建来获得窦道的长度及形态，以做参考。随着硬性内镜的普及和成本的降低［18, 19］，本课题组在前期研究中将其引入窦道型慢性创面的诊治研究中，以获得窦道型慢性创面内部病理特征。将硬性内镜从窦道型慢性创面体表的伤口伸入窦道，可以清晰地观察到部分窦道型慢性创面的内部病理特征，包括渗出情况、有无异物、有无坏死组织及纤维增生等情况。
在前期研究的基础上，本课题组引入了一种能控制前端弯曲的软性内镜，在CT造影检查的配合下，希望可以利用其获得所有窦道型慢性创面的窦道有效长度、形态及内部病理特征。为了消除个体差异和主观偏倚，最大限度地提高统计效率［20］，本研究比较了同一个窦道型慢性创面通过硬性内镜和软性内镜检查测得的长度偏差率。本课题组前期研究已经证实硬性内镜测量的长度偏差率优于传统的探针测量［2］，所以如果软性内镜检查测得的长度偏差率优于硬性内镜，那么则可以说明软性内镜更适合用于窦道型慢性创面的诊疗。CT造影及三维重建检查结果显示，本组窦道型慢性创面可分为I型管状、L型管状、Y型管状、片状、棒槌状及不规则状，其中窦道路径表现出明显弯曲的占32.6%。本课题组观察到在曲线组窦道型慢性创面中，软性内镜检查测得的长度偏差率明显低于硬性内镜，进一步分析得知，软性内镜检查测得的长度偏差率与CT造影及三维重建所得相近，这说明软性内镜基本可以充分观察到弯曲型窦道型慢性创面的内部情况。在直线组窦道型慢性创面中，软性内镜、硬性内镜及CT造影检查所得的长度偏差率均为0，这说明硬性内镜及软性内镜均可以充分观察到直线型窦道型慢性创面的内部情况。
需要指出的是，虽然本研究结果证实软性内镜在窦道型慢性创面的测量和观察方面具有优势，有望成为窦道型慢性创面诊断和治疗的有效手段；但目前我国软性内镜相关市场几乎被国外内镜公司垄断［21］，导致软性内镜价格普遍高于硬性内镜，这可能不利于软性内镜在基层医院的推广和使用。软性内镜及硬性内镜在直线型窦道型慢性创面内部病理特征的观察方面无明显差异，此类创面可以选用成本较低的硬性内镜作为诊疗工具。对于弯曲型窦道型慢性创面，如无软性内镜条件，建议到上级医院检查，否则可能延误治疗。
综上所述，软性内镜在窦道型慢性创面的临床检查中能更大范围地观察窦道内部特征，尤其对于弯曲型窦道的探查具有明显优势，这种方法的推广将有利于窦道型慢性创面的诊断及治疗。本研究也存在一定的局限性，首先样本量较小，其次没有进行前瞻性研究，下一步本课题组将进行大样本、多中心的临床研究，以进一步说明软性内镜在窦道型慢性创面诊疗中的优势。此外，本研究仅提供了窦道型慢性创面窦道长度、形态及可视范围的相关诊断方法，此类创面的其他诊断内容，包括超声诊断、病理诊断等有待进一步研究。
刘清华：设计实验，实施研究，采集、分析、解释数据，撰写文章；李曌、恩和吉日嘎拉：对文章的知识性内容作批评性审阅，技术和材料支持，经费支持；张超、宋薇、王玉振、梁莉婷、张孟德、黄钰岩：实施研究，采集数据，统计学分析；李筱贺、黄沙：酝酿和设计实验，研究过程指导，经费支持，对文章的知识性内容作批评性审阅所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 3种拓扑结构的三维生物打印海藻酸钠-明胶复合水凝胶支架形态。1A、1B、1C.分别为交联后的T45、T60、T90支架，形态均与模型一致
注：T45、T60、T90中T指拓扑结构，45、60、90指三维生物打印支架时打印喷头的旋转角度，各图中右上角为模型图像
2 3组小鼠皮下埋植具有不同拓扑结构的三维生物打印海藻酸钠-明胶复合水凝胶支架7 d后的大体形态。2A、2B、2C.分别为T45组、T60组、T90组支架植入后的大体形态，图2A、2C中支架植入区与未植入区的毛发生长情况相似，图2B中支架植入区毛发生长缓慢、皮肤呈粉红色
注：T45、T60、T90中T指拓扑结构，45、60、90指三维生物打印支架时打印喷头的旋转角度；黄色虚线内区域为支架植入区
3 3组小鼠皮下埋植具有不同拓扑结构的三维生物打印海藻酸钠-明胶复合水凝胶支架7 d后支架周围组织病理变化 苏木精-伊红×100。3A、3B、3C.分别为T45组、T60组、T90组支架未降解部分及其周围的皮肤组织，各组支架周围均形成纤维囊，相对于图3A、3C，图3B中支架周围的纤维囊较厚
注：T45、T60、T90中T指拓扑结构，45、60、90指三维生物打印支架时打印喷头的旋转角度；红色箭头指示纤维囊，蓝色箭头指示未降解的支架
4 3组小鼠皮下埋植具有不同拓扑结构的三维生物打印海藻酸钠-明胶复合水凝胶支架7 d后支架周围组织中CD68、BMP-2、TNF蛋白的表达水平 Alexa Fluor 488-4′，6-二脒基-2-苯基吲哚×200。4A、4B、4C.分别为T45组、T60组、T90组支架周围组织中CD68蛋白的表达水平，图4B中CD68蛋白的表达水平高于图4A、4C；4D、4E、4F.分别为T45组、T60组、T90组支架周围组织中BMP-2蛋白的表达水平，图4E中BMP-2蛋白的表达水平高于图4D、4F；4G、4H、4I.分别为T45组、T60组、T90组支架周围组织中TNF蛋白的表达水平，图4H中TNF蛋白的表达水平低于图4G、4I
注：BMP-2为骨形态发生蛋白2、TNF为肿瘤坏死因子；CD68、BMP-2、TNF蛋白阳性表达均为绿色；T45、T60、T90中T指拓扑结构，45、60、90指三维生物打印支架时打印喷头的旋转角度
表1 3组小鼠皮下埋植具有不同拓扑结构的三维生物打印海藻酸钠-明胶复合水凝胶支架7 d后支架周围组织中3种蛋白的表达比较（
表1. Comparison of the expressions of 3 proteins in the tissue surrounding the scaffolds of subcutaneously implanted three-dimensional bioprinted scaffolds of alginate-gelation composite hydrogels with different topological structures in 3 groups of mice after 7 days
组别 样本数 CD68 BMP-2 TNF T45组 3 23.9±2.0 6.1±0.5 15.4±3.5 T60组 3 63.8±12.5 17.5±0.8 8.0±0.9 T90组 3 25.4±2.2 2.4±0.9 15.4±2.3 F值 27.58 177.60 8.95 P值 0.001 <0.001 0.016 P 1值 0.002 <0.001 0.032 P 2值 >0.999 0.003 >0.999 P 3值 0.002 <0.001 0.031 注：BMP-2为骨形态发生蛋白2，TNF为肿瘤坏死因子；T45、T60、T90中T指拓扑结构，45、60、90指三维生物打印支架时打印喷头的旋转角度； F值、 P值为3组间各指标总体比较所得； P 1值、 P 2值分别为T45组与T60组、T90组比较所得， P 3值为T60组与T90组比较所得 
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