Influences and mechanism of extracellular vesicles from dermal papilla cells of mice on human hypertrophic scar fibroblasts
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摘要:
目的 探讨小鼠真皮毛乳头细胞外囊泡（DPC-EV）对人增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）的影响及其机制。 方法 该研究为实验研究。取10只6周龄雄性C57BL/6J小鼠，提取触须的原代真皮毛乳头细胞（DPC）并成功鉴定。取第3~5代DPC，于培养24 h采用超高速离心法提取DPC-EV，采用透射电子显微镜观察形态、纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径（样本数为3）。将第3代HSF分为DPC-EV组和磷酸盐缓冲液（PBS）组，分别加入DPC-EV、PBS培养，行细胞划痕试验并计算划痕后24 h细胞迁移率（样本数为5），采用细胞计数试剂盒8检测培养0（行饥饿处理12 h后、加入DPC-EV或PBS前）、24、48、72、96 h细胞增殖水平（样本数为4），采用免疫荧光法、蛋白质印迹法检测培养24 h细胞中α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）的蛋白表达情况，采用蛋白质印迹法检测培养24 h细胞中Krüppel样因子4（KLF4）的蛋白表达情况。取第3代HSF，加入DPC-EV培养24 h后，采用随机数字表法将HSF分为空白对照组、KLF4敲低组和KLF4过表达组，其中空白对照组细胞仅常规培养48 h，KLF4敲低组和KLF4过表达组细胞均先加入KLF4敲低病毒培养24 h，而后KLF4敲低组细胞常规培养24 h，KLF4过表达组细胞加入KLF4过表达病毒培养24 h。于培养48 h，采用蛋白质印迹法检测细胞中KLF4、α-SMA、ColⅠ的蛋白表达情况。 结果 培养24 h，提取的DPC-EV为囊泡状结构，平均粒径108.8 nm。划痕后24 h，PBS组HSF的迁移率为（54±10）%，明显高于DPC-EV组的（29±8）%（ t=4.37， P<0.05）。培养48、72、96 h，DPC-EV组HSF的增殖水平均明显低于PBS组（ t值分别为4.06、5.76、6.41， P<0.05）。培养24 h，DPC-EV组HSF中α-SMA和ColⅠ的蛋白表达均明显低于PBS组，而KLF4的蛋白表达明显高于PBS组。培养48 h，与空白对照组比较，KLF4敲低组HSF中KLF4的蛋白表达下调，α-SMA及ColⅠ的蛋白表达均上调；与KLF4敲低组比较，KLF4过表达组HSF中的KLF4的蛋白表达上调，ColⅠ和α-SMA的蛋白表达均下调。 结论 小鼠DPC-EV可抑制人HSF的增殖和迁移，并通过激活KLF4抑制人HSF中纤维化标志物α-SMA和ColⅠ的表达。 -
关键词:
- 瘢痕 /
- 胞外囊泡 /
- 成纤维细胞 /
- Krüppel样因子4 /
- 真皮毛乳头细胞
Abstract:Objective To investigate the influences and mechanism of extracellular vesicles from dermal papilla cells (DPC-EVs) of mice on human hypertrophic scar fibroblasts (HSFs). Methods The study was an experimental research. The primary dermal papilla cells (DPCs) of whiskers were extracted from 10 6-week-old male C57BL/6J mice and identified successfully. The DPC-EVs were extracted from the 3 rd to 5 th passage DPCs by ultracentrifugation, and the morphology was observed through transmission electron microscope and the particle diameter was detected by nanoparticle tracking analyzer ( n=3) at 24 h after culture. The 3 rd passage of HSFs were divided into DPC-EV group and phosphate buffer solution (PBS) group, which were cultured with DPC-EVs and PBS, respectively. The cell scratch test was performed and cell migration rate at 24 h after scratching was calculated ( n=5). The cell proliferation levels at 0 (after 12 h of starvation treatment and before adding DPC-EVs or PBS), 24, 48, 72, and 96 h after culture were detected by using cell counting kit 8 ( n=4). The protein expressions of α-smooth muscle actin (α-SMA) and collagen typeⅠ (ColⅠ) in cells at 24 h after culture were detected by immunofluorescence method and Western blotting, and the protein expression of Krüppel-like factor 4 (KLF4) in cells at 24 h after culture was detected by Western blotting. After the 3 rd passage of HSFs were cultured with DPC-EVs for 24 h, the cells were divided into blank control group, KLF4 knockdown group, and KLF4 overexpression group according to the random number table. The cells in blank control group were only routinely cultured for 48 h. The cells in KLF4 knockdown group and KLF4 overexpression group were incubated with KLF4 knockdown virus for 24 h, then the cells in KLF4 knockdown group were routinely cultured for 24 h while the cells in KLF4 overexpression group were incubated with KLF4 overexpression virus for 24 h. The protein expressions of KLF4, α-SMA, and ColⅠ in cells were detected by Western blotting at 48 h after culture. Results At 24 h after culture, the extracted DPC-EVs showed vesicular structure with an average particle diameter of 108.8 nm. At 24 h after scratching, the migration rate of HSFs in PBS group was (54±10)%, which was significantly higher than (29±8)% in DPC-EV group ( t=4.37, P<0.05). At 48, 72, and 96 h after culture, the proliferation levels of HSFs in DPC-EV group were significantly lower than those in PBS group (with t values of 4.06, 5.76, and 6.41, respectively, P<0.05). At 24 h after culture, the protein expressions of α-SMA and ColⅠ of HSFs in DPC-EV group were significantly lower than those in PBS group, while the protein expression of KLF4 was significantly higher than that in PBS group. At 48 h after culture, compared with those in blank control group, the protein expression of KLF4 of HSFs in KLF4 knockdown group was down-regulated, while the protein expressions of α-SMA and ColⅠ were both up-regulated; compared with those in KLF4 knockdown group, the protein expression of KLF4 of HSFs in KLF4 overexpression group was up-regulated, while the protein expressions of ColⅠ and α-SMA were down-regulated. Conclusions The DPC-EVs of mice can inhibit the proliferation and migration of human HSFs and significantly inhibit the expressions of fibrosis markers α-SMA and ColⅠ in human HSFs by activating KLF4. -
Key words:
- Cicatrix /
- Extracellular vesicles /
- Fibroblasts /
- Krüppel-like factor 4 /
- Dermal papilla cells
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(1)足底内侧游离皮瓣整复手掌电烧伤创面及瘢痕挛缩符合整复外科“组织近似原则”，在同源无毛皮肤修复的同时提供更好的手部抓握力，相比其他皮瓣拥有更好的耐用性和美观性。
(2)带皮神经的足底内侧游离皮瓣可以通过血流桥接的形式重建手掌远端血运和感觉神经。
(3)皮瓣供区隐蔽，且切取过程不损伤足底主干血管及神经，对皮瓣供区功能无明显影响。
Highlights:
(1)The medial plantar free flap for repairing electric burn wound and scar contracture in the palm was in line with the "like with like principle" of plastic surgery, and provided better grip strength of hand while repairing with homologous hairless skin, and had better durability and aesthetics than other flaps.
(2)The medial plantar free flap with cutaneous nerve could be used to reconstruct the blood transport and sensory nerve of the distal palm through the form of flow-through.
(3)The flap donor site was concealed, and the excision process did not damage the main blood vessels or nerves of the plantar, and had no obvious impact on the function of flap donor area.
手部电烧伤以手掌部为重，手掌部皮肤厚、电阻高，电烧伤常使手掌深部的软组织坏死甚至骨坏死，即便是手掌电烧伤后软组织缺损面积不大，经换药或皮片移植修复后仍会遗留严重的瘢痕挛缩畸形 ［ 1］ 。修复手掌皮肤软组织缺损的方法较多，但由于手掌具有皮肤结构复杂、感觉丰富、功能多样、大量垂直纤维束与掌腱膜相连导致皮肤滑动性小且修复要求高等特点，整复手掌电烧伤后创面及瘢痕挛缩一直是一项极具挑战的工作 ［ 2］ 。以往采用的游离皮片移植术往往会导致手掌耐磨性差，甚至出现严重的瘢痕挛缩畸形等并发症而饱受诟病 ［ 3］ 。随着显微外科技术的发展，传统的游离皮瓣能修复手掌创面，但存在术后外观臃肿、感觉及功能恢复差、供区损伤重等不足 ［ 4］ 。手掌皮肤与足底内侧皮肤组织结构类似，采用足底内侧游离皮瓣修复手掌皮肤软组织缺损是较为理想的方案 ［ 5］ 。为此，本研究团队采用吻合皮神经的足底内侧皮瓣游离移植整复手掌电烧伤创面及瘢痕挛缩，取得了良好的临床效果。
1. 对象与方法
本回顾性观察性研究符合《赫尔辛基宣言》的基本原则和要求。
1.1 入选标准
纳入标准：（1）电烧伤致手掌部创面或瘢痕挛缩，清创或瘢痕切除松解后伴腱性组织甚至骨组织外露，形成创面面积为3 cm×3 cm~8 cm×8 cm者；（2）采用吻合皮神经的足底内侧游离皮瓣修复者。排除标准：（1）术后随访时间不足3个月者；（2）术中资料、随访资料不全者。
1.2 临床资料
2020年1月—2023年1月，空军军医大学第一附属医院收治6例符合入选标准的高压电烧伤致手掌创面或瘢痕挛缩患者，其中电烧伤创面患者4例且均为男性，电烧伤后手掌瘢痕挛缩患者2例且男女各1例；年龄35~55岁（平均43岁）；累及右手者4例、左手者2例；致伤电压为380 V~10 kV。4个电烧伤创面合并屈肌腱部分变性，2个瘢痕挛缩切除松解后创面伴有腱性组织外露。手术时间为入院后1~7 d。
1.3 治疗方法
1.3.1 皮瓣移植术前准备
术前常规完善血常规、凝血、肝肾功能等实验室检查。患者于气管插管全身麻醉下取仰卧位行手术，对4例患者的电烧伤创面行急诊清创探查修复术，去除失活组织，保留间生态组织、腱性组织及重要血管神经。2例瘢痕挛缩患者于入院后1~7 d接受瘢痕切除彻底松解修复术。清创及瘢痕切除后创面面积为5.0 cm×3.0 cm~8.0 cm×7.0 cm。
1.3.2 皮瓣设计与切取
在足底内侧非负重区标记内踝前线与足底内侧缘的交点，然后从这一交点出发标记一条直线到第1、2跖骨头之间，为足底内侧皮瓣的轴线。应用手持多普勒超声血流探测仪在此线的中点附近探查皮瓣穿支血管的穿出点并标记为皮瓣的轴心点。根据创面大小拓取皮瓣样布并将边缘线扩大0.5 cm后设计皮瓣大小。从皮瓣内侧缘切开皮肤并保留1根或2根优势浅静脉，然后向远端游离足够长度后结扎、切断备用。从足底腱膜表面掀起皮瓣达𧿹展肌，牵开𧿹展肌与趾短屈肌间隙寻找足底内侧动脉血管穿支及其伴行的足底内侧皮神经并予以保留 ［ 6, 7］ 。从皮瓣外侧缘切开后在足掌腱膜表面向内侧缘会师，切取时应注意保留皮瓣内侧部分垂直的皮系韧带与掌腱膜的连续性。游离足够长度穿支血管，保留足底内侧神经主干并无损伤束间分离足够长度的足底内侧皮神经。彻底游离皮瓣，仅保留足底内侧血管蒂，检查皮瓣血运良好后断蒂，本组患者皮瓣切取面积为5.5 cm×3.5 cm~8.5 cm×7.5 cm。皮瓣供区创面行腹部全厚皮移植修复后加压包扎，石膏固定踝关节于中立位。
1.3.3 皮瓣移植
修整皮瓣的多余脂肪组织使皮瓣厚度与行清创或瘢痕切除后的手掌创面相匹配，将皮瓣远端与手掌创面边缘固定，于显微镜下将足底内侧穿支动脉血管与患手桡动脉或尺动脉掌浅支血管行端端吻合，将穿支静脉血管与患手桡动脉或尺动脉伴行静脉行端端吻合，将足底内侧皮神经与正中神经或尺神经掌浅支近端外膜行端端吻合以重建皮瓣感觉。血管吻合完成后检查皮瓣血运恢复情况，待皮瓣充血反应正常后间断缝合创缘，于皮瓣下放置引流片3~5条。
1.3.4 术后处理及随访
术后常规给予抗炎、抗血管痉挛及抗血栓形成等对症支持治疗，保持患者病房室温>25 ℃，预留皮瓣观察窗并密切观察皮瓣血运变化。术后48 h拔除引流片。患者卧床1周。皮瓣供区皮片移植1周后换药，12 d拆线，踝关节石膏固定2周。下床后抬高患肢3周并穿戴弹力袜减轻皮瓣供区肢体远端水肿及瘢痕增生。出院后定期门诊随访。
1.4 观测指标
术后观察皮瓣和皮片存活情况。患者平均随访时间>12个月，随访观察皮瓣外形、质地及皮瓣供区情况，评估患手握持功能恢复情况。于末次随访时，测量皮瓣两点辨别觉距离并按照中华医学会手外科学会上肢部分功能评定试用标准 ［ 8］ 评定皮瓣感觉恢复情况，采用皮瓣术后功能评价量表评价皮瓣功能恢复情况，优：皮瓣成活好、外形匹配度高、感觉基本正常，良：皮瓣部分成活、感觉部分恢复，差：皮瓣未成活、感觉未恢复。
2. 结果
2.1 总体情况
术后5个皮瓣存活良好；1个皮瓣远端部分坏死，清创后移植大腿外侧中厚皮修复。皮瓣供区皮片均存活良好。患者均获随访，随访3~24个月，皮瓣不臃肿，质地、色泽好，与周围组织匹配度高；皮瓣供区无明显瘢痕挛缩发生；患手握持功能良好。末次随访时，皮瓣两点辨别觉距离为6~8 mm，皮瓣感觉恢复：5个皮瓣恢复到S3 ＋级、1个皮瓣恢复到S3级，皮瓣功能评定：优5个、良1个，患者基本恢复正常的生活和工作。
2.2 典型病例
例1
男，47岁，全身多处被10 kV高压电烧伤后3 h急诊入院。入院后行左手电烧伤创面清创探查修复术，清创后创面面积约7.5 cm×4.0 cm，伴屈肌腱变性。术中根据探查结果选择患手左侧尺动脉掌浅支为受区主要吻合血管，然后切取面积为8.0 cm×4.5 cm的同侧足底内侧游离皮瓣并移植于左手掌电烧伤创面，显微镜下将皮瓣足底内侧穿支动脉血管与患手尺动脉掌浅支血管行端端吻合，并将穿支静脉血管与患手尺动脉伴行静脉行端端吻合，将足底内侧皮神经与正中神经掌浅支近端外膜行端端吻合。移植腹部全厚皮修复皮瓣供区创面。行术后皮瓣和皮片均存活良好。术后随访，皮瓣外形、色泽好，皮瓣供区无明显瘢痕，患手握持功能好。术后6个月末次随访时，皮瓣两点辨别觉距离为7 mm，功能评定为优，感觉恢复到S3 ＋级。见 图1。
例2
男，37岁，左手掌380 V电烧伤行植皮术后瘢痕挛缩7个月入院。入院后2 d行左手掌瘢痕切除松解修复术，形成7.5 cm×4.5 cm大小创面，伴创基掌浅弓血管及腱性组织外露。切取面积为8.0 cm×5.0 cm的同侧足底内侧游离皮瓣，显微镜下将足底内侧穿支动脉血管与患手桡动脉掌浅支血管行端端吻合，将穿支静脉血管与患手桡动脉伴行静脉行端端吻合。将足底内侧皮神经与正中神经掌浅支近端外膜行端端吻合。移植腹部全厚皮修复皮瓣供区创面。术后皮瓣和皮片均存活良好。术后随访，皮瓣外形好，质地与周围组织匹配度高，皮瓣供区无明显瘢痕，患手握持功能好。术后10个月末次随访时，皮瓣两点辨别觉距离为8 mm，功能评定为优，感觉恢复到S3 ＋级。见 图2。
3. 讨论
在电烧伤意外发生时，由于上肢接触电流的机会大，手掌更是容易被电烧伤，造成明显的软组织损伤 ［ 9］ ，手掌因其功能重要性和组织结构特殊性在受伤后常常造成严重的后果 ［ 10］ 。手掌部位电烧伤创面往往深达肌肉深面甚至伴有腱性组织和骨质的破坏 ［ 11］ 。皮片移植并不适合手掌深度电烧伤创面的修复 ［ 12］ 。传统皮瓣如带蒂的腹部皮瓣 ［ 13］ 和前臂逆行岛状瓣 ［ 14］ 是常用的修复手部创面的皮瓣，但因其组织结构与手掌皮肤差异较大易出现诸多并发症，从而导致手术效果欠佳 ［ 2］ 。
在多数情况下，手掌皮肤软组织缺损修复绝非简单的皮瓣修复或单纯的感觉功能重建，手掌皮肤软组织缺损修复后的耐用性更加重要 ［ 15］ 。足底内侧皮肤在结构上与手掌最相近，有较厚的角化层及脂肪垫，垂直的皮系韧带将皮肤与掌腱膜相连，使足底内侧皮肤不易滑动，有利于其移植修复手掌皮肤软组织后恢复手部持、捏等功能，同时耐磨抗压 ［ 16］ 。足底皮肤的乳头层内有与手掌皮肤结构相似的感觉神经末梢及感受器，所以感觉十分灵敏。足底内侧区为非负重区，位置隐蔽，足底内侧皮瓣最早由被学者提出应用于足跟部皮肤软组织缺损的重建，该皮瓣切取不会损伤足部重要血管，且切取后对足部的血运及站立行走等功能并无明显影响 ［ 17］ 。显微外科技术的发展为足底内侧皮瓣游离移植奠定了一定的基础，而对足底及手掌解剖结构的进一步研究则为足底内侧游离皮瓣移植修复手掌创面提供了坚实的解剖学基础。足底内侧皮瓣也从起初的筋膜皮瓣发展到后续的感觉皮瓣，带有功能重建作用的肌皮瓣、穿支皮瓣、静脉皮瓣、折叠皮瓣以及和足内侧皮瓣联合的嵌合皮瓣等 ［ 18］ 。针对本组病例本研究团队采用吻合皮神经的足底内侧游离皮瓣整复手掌电烧伤创面及瘢痕挛缩，皮瓣移植后长期随访结果显示，皮瓣的外形、色泽良好，感觉恢复良好，同时患手握持功能恢复良好；皮瓣供区亦无明显瘢痕挛缩形成或影响肢体活动及行走的情况出现。
要推广应用本术式除了需要提高显微操作技术，还应该注意以下事项：（1）术前应采用手持多普勒超声血流探测仪探测足底内侧穿支血管的穿出点及走行，明确是否存在血管变异、闭塞或缺如等情况；（2）足底皮肤致密，皮瓣切取后回缩很少，因此在设计时皮瓣边缘仅较创面边缘扩大0.5 cm即可；（3）足底内侧皮神经与正中神经或尺神经掌浅支吻合和皮瓣的血管吻合同等重要，缺一不可；（4）皮瓣切取时应注意保留皮瓣内侧部分垂直的皮系韧带与掌腱膜的连续性，将垂直的皮系韧带与受区腱膜或创面基底缝合以更好地对抗皮瓣移植后的滑动；（5）皮瓣切取范围远端不宜超过第1跖骨头侧缘，近端不超过内踝尖，外缘不超过足外侧负重点内缘，以免损伤足部负重区，遗留功能障碍；（6）足底内侧神经是胫神经的重要分支，是足底感觉的主要神经，手术时应将足底内侧神经主干留于原位以保留前足感觉。
本术式优点如下：（1）足底内侧游离皮瓣整复手掌电烧伤创面及瘢痕挛缩符合整复外科“组织近似原则”，在同源无毛皮肤修复的同时提供更好的手部抓握力，相比其他皮瓣拥有更好的耐用性和美观性；（2）带皮神经的足底内侧游离皮瓣可以通过血流桥接的形式重建手掌远端血运和感觉神经；（3）皮瓣供区隐蔽，且位于足部非负重区域，对皮瓣供区功能无明显影响；（4）皮瓣切取不损伤主干血管与神经，且皮瓣回流静脉粗大，吻合难度相对较低。然而，本术式同样存在一些无法回避的不足：（1）足底内侧皮瓣可切取的范围有限，仅限于足弓非负重区；（2）穿支血管蒂长度有限，给手术操作增加一定难度；（3）皮瓣供区无法直接缝合，往往需要皮片或皮瓣移植修复。以上不足在一定程度上限制了这个术式的广泛应用。
综上所述，本研究团队采用吻合皮神经的足底内侧游离皮瓣整复手掌电烧伤创面及瘢痕挛缩取得了较好的效果，值得临床推广。但本研究纳入的病例数有限，且为单中心回顾性研究，故仍需总结更多的临床病例，积累更多的临床经验从而进一步提高疗效。
王运帷、张浩、曹鹏：实验操作、论文撰写；张万福、官浩：研究指导、论文修改、经费支持；佟琳、李少珲：技术和材料支持；陈阳、韩超：数据整理、统计分析所有作者均声明不存在利益冲突 -
参考文献
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1 小鼠真皮毛乳头细胞外囊泡（DPC-EV）的鉴定。1A.DPC-EV为囊泡状结构 透射电子显微镜×40 000；1B.DPC-EV平均粒径为108.8 nm，符合细胞外囊泡粒径
2 2组人增生性瘢痕成纤维细胞划痕后24 h的迁移情况 倒置相差显微镜×100。2A、2B.分别为PBS组在划痕后0（即刻）、24 h的划痕情况；2C、2D.分别为DPC-EV组在划痕后0、24 h的划痕情况，图2D的细胞迁移较图2B少
注：图中竖/斜线为细胞迁移的边缘线；磷酸盐缓冲液（PBS）组加入PBS，真皮毛乳头细胞外囊泡（DPC-EV）组加入DPC-EV
3 免疫荧光法检测的2组人增生性瘢痕成纤维细胞培养24 h后α-SMA和ColⅠ的蛋白表达 Alexa Fluor 488-4'，6-二脒基-2-苯基吲哚×10。3A、3B、3C.分别为PBS组细胞核染色、α-SMA染色、细胞核与α-SMA染色重叠图片，α-SMA的蛋白表达较多；3D、3E、3F.分别为DPC-EV组的细胞核染色、α-SMA染色、细胞核与α-SMA染色重叠图片，图3E细胞质中α-SMA的蛋白表达较图3B明显减少；3G、3H、3I.分别为PBS组细胞核染色、ColⅠ染色、细胞核与ColⅠ染色重叠图片，ColⅠ的蛋白表达较多；3J、3K、3L.分别为DPC-EV组细胞核染色、ColⅠ染色、细胞核与ColⅠ染色重叠图片，图3K细胞质中ColⅠ的蛋白表达较图3H明显减少
注：α-SMA为α平滑肌肌动蛋白，其阳性染色为绿色；ColⅠ为Ⅰ型胶原蛋白，其阳性染色为绿色；细胞核阳性染色为蓝色；磷酸盐缓冲液（PBS）组加入PBS，真皮毛乳头细胞外囊泡（DPC-EV）组加入DPC-EV
4 蛋白质印迹法检测的2组人增生性瘢痕成纤维细胞培养24 h后α-SMA和ColⅠ的蛋白表达
注：α-SMA为α平滑肌肌动蛋白，ColⅠ为Ⅰ型胶原蛋白，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶，PBS为磷酸盐缓冲液，DPC-EV为真皮毛乳头细胞外囊泡；条带上方1、2分别指示加入PBS的PBS组和加入DPC-EV的DPC-EV组
5 蛋白质印迹法检测的2组人增生性瘢痕成纤维细胞培养24 h后KLF4的蛋白表达
注：KLF4为Krüppel 样因子4，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶，PBS为磷酸盐缓冲液，DPC-EV为真皮毛乳头细胞外囊泡；条带上方1、2分别指示加入DPC-EV的DPC-EV组和加入PBS的PBS组
6 蛋白质印迹法检测的3组人增生性瘢痕成纤维细胞培养48 h后KLF4、ColⅠ、α-SMA的蛋白表达
注：KLF4为Krüppel样因子4，ColⅠ为Ⅰ型胶原蛋白，α-SMA为α平滑肌肌动蛋白，GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶；条带上方1、2、3分别指空白对照组、KLF4敲低组、KLF4过表达组；空白对照组细胞仅常规培养，KLF4敲低组细胞先加入KLF4敲低病毒培养再常规培养，KLF4过表达组细胞先加入KLF4敲低病毒培养再加入KLF4过表达病毒培养
表1 2组人增生性瘢痕成纤维细胞培养各时间点细胞增殖水平比较（
表1. Comparison of cell proliferation levels of human hypertrophic scar fibroblasts at different time points of cell culture between the two groups
组别 样本数 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h PBS组 4 0.213±0.012 0.607±0.100 0.907±0.088 1.287±0.065 1.504±0.064 DPC-EV组 4 0.216±0.018 0.444±0.051 0.672±0.075 1.033±0.059 1.195±0.073 t值 0.26 2.89 4.06 5.76 6.41 P值 0.999 0.181 0.035 0.006 0.004 注：0 h为行饥饿处理12 h后、真皮毛乳头细胞外囊泡（DPC-EV）组加入DPC-EV或磷酸盐缓冲液（PBS）组加入PBS前；处理因素主效应， F=80.93， P<0.001；时间因素主效应， F=391.40， P<0.001；两者交互作用， F=6.73， P<0.001 
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