Effects and mechanisms of zinc ion-loaded composite hydrogel on infected full-thickness skin defect wounds in diabetic mice
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摘要:
目的 探讨负载锌离子的复合水凝胶（以下简称含锌水凝胶）对糖尿病小鼠全层皮肤缺损感染创面的作用及其机制。 方法 该研究为实验研究。制备聚（甘油癸二酸酯）-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶（以下简称单纯水凝胶）和在单纯水凝胶的基础上添加锌离子的疏松多孔且具有良好黏附性的固态含锌水凝胶。计算用磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡14 d后含锌水凝胶中锌离子的释放率。检测用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养2 h后耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）浓度。利用酶标仪检测单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除率,反映清除氧自由基能力。测量用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养24 h后人脐静脉内皮细胞（HUVEC）形成的血管长度。采用细胞计数试剂盒8检测用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养24 h后L929细胞的活力。将小鼠红细胞悬液分为用PBS处理的空白对照组和用相应溶液处理的单纯水凝胶组、含锌水凝胶组和Triton X-100组,利用酶标仪检测孵育2 h后红细胞的溶血情况并计算溶血率。以上实验样本数均为3。取21只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠,在背部脊柱对称位置各制备1个用MRSA感染的全层皮肤缺损创面。将小鼠分为滴加PBS的空白对照组和用相应水凝胶处理的单纯水凝胶组和含锌水凝胶组。伤后3 d,检测空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面中的细菌浓度,样本数为4。于伤后0（即刻）、3、7、14 d,大体观察小鼠创面感染情况并计算伤后3、7、14 d创面愈合率,样本数为5。伤后14 d,行苏木精-伊红染色和Masson染色分别检测小鼠创面中的新生上皮和胶原生成情况,行免疫荧光染色检测小鼠创面中血管新生及M2型巨噬细胞分布情况。 结果 浸泡14 d后,含锌水凝胶中锌离子的释放率为（70.5±4.6）%。与用含锌水凝胶比较,用PBS和单纯水凝胶培养2 h后细菌浓度均明显升高（P<0.05）。含锌水凝胶对DPPH的清除率明显高于PBS、单纯水凝胶（P值均<0.05）。与用PBS比较,用含锌水凝胶培养24 h后HUVEC形成的血管长度明显增长（P<0.05）。与用含锌水凝胶比较,用PBS和单纯水凝胶培养24 h后L929细胞的活力均明显降低（P<0.05）。孵育2 h后,与Triton X-100组相比,空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组红细胞的溶血率均显著降低（P<0.05）；而后3组的红细胞溶血率相近（P>0.05）。伤后3 d,含锌水凝胶组小鼠创面中的细菌浓度明显低于空白对照组和单纯水凝胶组（P值均<0.05）。伤后3~14 d,3组小鼠创面均逐渐愈合,含锌水凝胶组小鼠伤后14 d创面基本愈合。伤后7 d,含锌水凝胶组小鼠创面愈合率为（72.4±8.4）%,明显高于空白对照组和单纯水凝胶组的（31.6±6.7）%、（44.7±5.4）%（P值均<0.05）。伤后14 d,含锌水凝胶组小鼠创面愈合率为（92.7±4.3）%,明显高于空白对照组的（73.5±7.4）%,P<0.05。伤后14 d,与空白对照组和单纯水凝胶组相比,含锌水凝胶组小鼠创面的新生表皮长度更长、厚度更厚,胶原沉积更多,新生血管和M2型巨噬细胞分布更丰富。 结论 含锌水凝胶具有良好的生物相容性、清除氧自由基能力和体内外抗菌效果、促血管生成能力,可持续缓释锌离子,促进创面再上皮化及胶原合成,从而促进小鼠全层皮肤缺损感染创面愈合。 Abstract:Objective To investigate the effects and mechanisms of zinc ion-loaded composite hydrogel (hereinafter referred to as the zinc-containing hydrogel) on infected full-thickness skin defect wounds in diabetic mice. Methods This study was an experimental study. A poly (glycerol sebacate)-co-poly(ethylene glycol)-g-catechol prepolymer/quaternized-chitosan hydrogel (hereinafter referred to as the simple hydrogel) and a solid-state zinc-containing hydrogel with porous and good adhesion by adding zinc ions to the simple hydrogel were prepared. The release rate of zinc ions from the zinc-containing hydrogel after immersion in phosphate buffer solution (PBS) for 14 days was calculated. The concentration of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) cultured for 2 hours with the simple hydrogel, zinc-containing hydrogel, and PBS was measured. The scavenging ability of the simple hydrogel, zinc-containing hydrogel, and PBS for 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2, 4, 6-trinitrophenyl) hydrazyl (DPPH) was detected using microplate reader to reflect the ability of oxygen free radical removal. The length of vessels formed by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) cultured for 24 hours with the simple hydrogel, zinc-containing hydrogel, and PBS was measured. The cell viability of L929 cells cultured for 24 hours with the simple hydrogel, zinc-containing hydrogel, and PBS was detected using the cell counting kit-8. The mouse red blood cell suspension was divided into blank control group treated with PBS, simple hydrogel group, zinc-containing hydrogel group, and Triton X-100 group treated with corresponding solution. Hemolysis was detected using microplate reader after 2 hours of treatment, and the hemolysis rate was calculated. All experiments had a sample size of 3. Twenty-one C57BL/6J mice aged 6-8 weeks were taken, and a full-thickness skin defect wound was prepared in the symmetrical position on the back spine and infected with MRSA. Mice were divided into blank control group treated with PBS, simple hydrogel group, and zinc-containing hydrogel group treated with the corresponding hydrogel. Three days after injury, bacterial concentration in the wounds were measured in all groups of mice (n=4). On day 0 (immediately), 3, 7, and 14 after injury, the wound infection status of mice was generally observed and the wound healing rate was calculated (n=5). Hematoxylin-eosin staining and Masson staining were used to detect new epithelium and collagen formation in the wounds of mice on day 14 after injury. Immunofluorescence staining was used to detect neovascularization and distribution of M2 macrophages in the wounds of mice. Results After immersion for 14 days, the release rate of zinc ions of the zinc-containing hydrogel was (70.5±4.6)%. Compared with the zinc-containing hydrogel, the bacterial concentration was significantly increased after 2 hours of culture with PBS and the simple hydrogel (P<0.05). The DPPH scavenging rate of the zinc-containing hydrogel was significantly higher than that of PBS and the simple hydrogel (with P values all <0.05). The length of vessels formed by HUVECs cultured for 24 hours with the zinc-containing hydrogel was significantly longer than that cultured with PBS (P<0.05). Compared with PBS and the simple hydrogel, the cell viability of L929 cells cultured for 24 hours with the zinc-containing hydrogel was significantly higher (P<0.05). After 2 hours of incubation, compared with that in Triton X-100 group, the hemolysis rate of red blood cells in blank control, simple hydrogel, and zinc-containing hydrogel groups was significantly reduced (P<0.05); and the hemolysis rate of red blood cells in the latter three groups was similar (P>0.05). On day 3 after injury, the bacterial concentration in the wounds of mice in zinc-containing hydrogel group was significantly lower than that in blank control and simple hydrogel groups (with P values all <0.05). From day 3 to day 14 after injury, the wounds of mice in all the three groups were gradually healing, and on day 14 after injury, the wounds of mice in the zinc-containing hydrogel group were basically healed. On day 7 after injury, the wound healing rate of mice in zinc-containing hydrogel group was (72.4±8.4)%, which was significantly higher than that of blank control and simple hydrogel groups, being (31.6±6.7)% and (44.7±5.4)%, respectively(with P values all< 0.05). On day 14 after injury, the wound healing rate of mice in zinc-containing hydrogel group was (92.7±4.3)%, which was significantly higher than (73.5±7.4)% in blank control group (P<0.05). On day 14 after injury, compared with that in blank control and simple hydrogel groups, the newly formed epidermis in mice wound of zinc-containing hydrogel group was longer and thicker, with more collagen deposition, and a more abundant distribution of new vessels and M2 macrophages. Conclusions The zinc-containing hydrogel exhibits good biocompatibility, oxygen free radical scavenging capacity, and antimicrobial effects both in vitro and in vivo, as well as angiogenic promotion capability. It can provide sustained release of zinc ions to promote re-epithelialization and collagen synthesis, thus enhancing the healing of infected full-thickness skin defect wounds in diabetic mice. -
Key words:
- Biocompatible materials /
- Hydrogel /
- Infection /
- Diabetes mellitus, experimental /
- Zinc ions /
- Bacterial resistance /
- Wound repair
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糖尿病足溃疡患者常伴有不同程度的疼痛，本研究分析显示，其与创面标本细菌培养结果、白细胞计数密切相关，这为医护人员进行针对性干预提供了依据，具有一定的临床应用价值。
糖尿病足是指患者因糖尿病或持续高血糖状态引起踝关节以下足部血管、神经病变相关的皮肤、软组织、深部组织感染或溃疡性病变。其主要表现为足部供血不足/感觉异常，以及皮肤感染、坏死或破溃。严重的糖尿病足可引起深部软组织及骨骼坏死，导致截肢。糖尿病神经病变是DFU的重要致病因素之一，相关研究表明，高达66%的糖尿病患者可患有不同程度的下肢周围神经病变 ［ 1］ ，疼痛是其中的特征性表现之一。糖尿病足溃疡（DFU）对患者日常活动产生严重限制，而疼痛更加迫使其减少主动活动，不仅给患者带来躯体上的痛苦，也给其造成巨大的心理压力，明显降低患者生活质量 ［ 2］ 。虽然疼痛对于DFU创面的作用机制尚未完全明确，但受疼痛刺激时创面会释放大量的炎症因子，这些炎症因子可能会抑制组织修复与再生 ［ 3］ 。创面疼痛可以同时触发下丘脑-垂体-肾上腺素轴，提高加压素和氢化可的松的表达，这些物质的表达会抑制内皮细胞增殖，进而延缓胶原蛋白合成，从而延迟创面愈合 ［ 4, 5］ 。为促进创面愈合及提高患者生存质量，需要对疼痛的程度和其对患者产生的相关影响进行精准化管理。鉴于此，本研究应用简明疼痛量表（brief pain inventory，BPI） ［ 6］ 对住院治疗的DFU患者的疼痛状况进行调查，并收集相关临床资料和实验室指标，以期为临床制订和采取针对性的干预措施，改善DFU患者疼痛状况和促进其康复提供参考依据。
1. 对象与方法
本单中心横断面调查研究通过解放军总医院第四医学中心（以下简称本单位）伦理委员会审批，批号：2022KY080-KS001。患者均自愿参与本研究并签署知情同意书。
1.1 调查工具
1.1.1 一般资料调查问卷
研究者自行设计调查问卷，内容包括（1）人口学资料，如性别、年龄、文化程度、体重指数、自理能力评分（0~49分：日常生活基本自理，但有些困难，部分依赖他人；50~80分：日常生活有较大困难，需要帮助，甚至完全依赖他人）等；（2）疾病相关资料，如糖尿病病程、创面Wagner分级 ［ 7］ ；（3）实验室指标，如创面标本细菌培养结果、糖化血红蛋白、白蛋白、前白蛋白、血红蛋白水平和白细胞计数等。
1.1.2 BPI
评估内容包括疼痛程度和疼痛的相关影响2个维度，患者疼痛均为创面或创周疼痛。疼痛程度为患者过去24 h内疼痛的程度，有4个条目，依次为最重疼痛、最轻疼痛、平均疼痛和当前疼痛，每个条目得分为0~10分，对应最轻疼痛至最重疼痛，总评分取值范围为0~40分。疼痛的相关影响有7个条目，包括对日常生活、情绪、行走能力、日常工作、与他人关系、睡眠、生活兴趣的影响，影响程度从“没有影响”到“完全影响”，对应的分值为0~10分，总得分取值范围是0~70分。
1.2 调查对象及入选标准
选择2021年5月—2022年2月收入本单位的DFU患者作为调查对象。纳入标准：（1）患足符合中华医学会糖尿病学分会提出的糖尿病足诊断标准 ［ 8］ ；（2）按照Wagner分级（0~5级）标准 ［ 8］ ，足溃疡为Wagner 1~5级者；（3）自愿参加本研究者。排除标准：（1）非糖尿病导致的足部溃疡；（2）患者合并其他影响糖尿病足疼痛的疾病，如血管炎、肿瘤等；（3）意识不清及各种精神病患者。
1.3 调查方法及质量控制
成立调查小组，调查员由4名糖尿病足小组成员组成，经统一培训后，负责对入院后24 h内患者的疼痛状况进行评估和一般资料收集（2个问卷同时发放）。调查评估时使用统一的指导用语，调查完成后进行问卷质量审核，及时补充遗漏信息并采取双人复核方式将数据输入Excel表中。回收问卷中，资料不完整视为无效问卷，该患者的2个问卷均不纳入统计。
1.4 统计学处理
使用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。计数资料数据以频数（百分比）表示；计量资料数据均不符合正态分布，以 M（ Q 1， Q 3）描述。将患者按照一般资料分类，统计疼痛程度和疼痛的相关影响的总得分，对数据行Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验。选取单因素分析中差异有统计学意义的指标作为自变量，以疼痛程度和疼痛的相关影响为因变量建立广义线性模型，筛选影响DFU患者疼痛的独立危险因素。 P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
共发放调查问卷44份，收回有效问卷42份，有效回收率为95.45%。
2.1 DFU患者疼痛状况
42例DFU患者的最重疼痛、最轻疼痛、平均疼痛、当前疼痛得分分别为5（0，10）、2（0，6）、3（0，8）、2（0，8）分，疼痛程度总得分为11（0，24）分；疼痛对患者日常生活、情绪、行走能力、日常工作、与他人关系、睡眠、生活兴趣的影响得分分别为4（0，10）、4（0，10）、5（0，10）、5（0，10）、3（0，10）、4（0，10）、4（0，10）分，疼痛的相关影响总得分为30（0，63）分。
2.2 一般资料及其单因素分析
纳入分析的42例患者以男性居多；年龄39~87（67±10）岁，以60~69岁为主；大多数为初中学历；糖尿病病程20年以上者居多；半数患者创面Wagner分级为4级；大多数患者体重指数和白细胞计数在正常范围内；大多数患者自理能力存在部分依赖；绝大多数患者创面标本细菌培养结果为阳性；约半数患者白蛋白水平异常，大多数患者糖化血红蛋白、前白蛋白和血红蛋白水平异常。不同血红蛋白水平、白细胞计数患者的疼痛程度总得分比较，差异均有统计学意义（ P<0.05）；不同血红蛋白水平、白细胞计数、创面标本细菌培养结果患者的疼痛的相关影响总得分比较，差异均有统计学意义（ P<0.05）。见 表1。
表1 42例糖尿病足溃疡患者不同一般资料下疼痛程度和疼痛的相关影响总得分的比较项目与类别 例数 构成比（%） 疼痛程度总得分［分， M （ Q 1， Q 3）］疼痛的相关影响总得分［分， M （ Q 1， Q 3）］统计量值1 P 1值 统计量值2 P 2值 性别 Z=-0.77 0.443 Z=-0.91 0.365 男 30 71.43 12（0，24） 29（0，61） 女 12 28.57 10（0，24） 34（4，63） 年龄（岁） χ 2=0.49 0.782 χ 2=0.45 0.800 39~59 9 21.43 11（4，22） 36（11，59） 60~69 21 50.00 11（0，24） 27（0，61） ≥70 12 28.57 12（1，24） 32（4，63） 文化程度 χ 2=5.89 0.117 χ 2=7.46 0.059 小学及以下 8 19.05 10（0，24） 26（0，60） 初中 21 50.00 10（2，22） 25（2，63） 中专或高中 8 19.05 16（9，22） 47（33，59） 大专及以上 5 11.90 10（1，24） 33（4，56） 体重指数（kg/m 2） Z=-0.17 0.869 Z=-1.29 0.197 18.5~23.9 23 54.76 11（1，24） 34（4，61） ≥24 19 45.24 11（0，24） 27（0，63） 自理能力评分（分） Z=-2.02 0.142 Z=-1.92 0.055 0~49 26 61.90 10（0，24） 26（0，61） 50~80 16 38.10 14（4，24） 38（7，63） 糖尿病病程（年） χ 2=0.56 0.757 χ 2=4.58 0.101 <10 12 28.57 11（2，22） 25（2，59） 10~20 12 28.57 12（1，22） 26（0，60） >20 18 42.86 11（0，24） 38（0，63） Wagner分级（级） χ 2=3.71 0.447 χ 2=3.62 0.460 1 2 4.76 6（5，7） 10（6，14） 2 5 11.90 8（0，24） 25（4，52） 3 13 30.95 10（0，24） 26（0，59） 4 21 50.00 13（2，22） 37（0，63） 5 1 2.38 16（16，16） 23（23，23） 创面标本细菌培养结果 Z=-1.73 0.083 Z=-2.12 0.034 阴性 5 11.90 6（2，18） 13（0，44） 阳性 37 88.10 12（0，24） 33（0，63） 糖化血红蛋白（%） Z=-0.44 0.664 Z=-0.47 0.644 ≤7 14 33.33 12（0，24） 28（0，61） >7 28 66.67 11（0，24） 31（0，63） 白蛋白（g/L） Z=-1.88 0.060 Z=-1.61 0.107 <35 20 47.62 16（0，24） 37（0，63） 35~50 22 52.38 9（0，22） 25（0，61） 前白蛋白（g/L） Z=-0.32 0.748 Z=-1.02 0.309 <0.20 30 71.43 11（0，24） 32（0，63） 0.20~0.40 12 28.57 11（2，22） 26（2，53） 血红蛋白（g/L） Z=-2.05 0.040 Z=-2.66 0.008 <120 34 80.95 12（0，24） 34（0，63） 120~160 8 19.05 7（2，22） 13（0，38） 白细胞计数（×10 9/L） Z=-2.55 0.011 Z=-2.02 0.043 4~10 24 57.14 9（0，22） 25（0，63） <4或>10 18 42.86 15（4，24） 37（7，61） 注：统计量值1、 P 1值，统计量值2、 P 2值分别为不同一般资料下疼痛程度、疼痛的相关影响总得分比较所得 2.3 DFU患者疼痛状况的广义线性模型分析
将单因素分析中差异具有统计学意义的指标作为自变量，分别赋值，创面标本细菌培养结果为阴性=1、阳性=2，血红蛋白水平<120 g/L=1、120~160 g/L=2，白细胞计数（4~10）×10 9/L=1、<4×10 9/L或>10×10 9/L=2，以患者疼痛程度、疼痛的相关影响为因变量建立广义线性模型。结果显示，白细胞计数是42例DFU患者疼痛程度和疼痛的相关影响的独立危险因素（ P<0.05），创面标本细菌培养结果是疼痛的相关影响的独立危险因素（ P<0.05）。见 表2。
表2 42例糖尿病足溃疡患者疼痛程度和疼痛的相关影响的广义线性模型分析结果因变量 自变量 标准回归系数 标准误 95%置信区间 Wald值 P值 疼痛程度 血红蛋白（g/L） 1.29 2.52 -3.66~6.24 0.26 0.610 白细胞计数（×10 9/L） 6.17 2.90 0.28~11.87 4.51 0.034 疼痛的相关影响 创面标本细菌培养结果 21.00 9.23 2.92~39.09 5.18 0.023 血红蛋白（g/L） -7.32 6.62 - 20.28~5.651.22 0.269 白细胞计数（×10 9/L） 21.33 7.99 5.67~36.99 7.13 0.008 3. 讨论
痛性糖尿病周围神经病变（painful diabetic peripheral neuropathy，PDPN）是糖尿病患者周围神经系统发生病变引起的 ［ 9］ ，通常表现为刺痛、跳痛、刀割样疼痛、撕裂性疼痛等神经痛症状，有蚂蚁爬行样、灼烧样、针刺样的异常感觉，同时还伴有自主神经损害的其他相关症状，PDPN严重影响了患者的工作效率、机体功能和生活质量。即使在非运动状态下，DFU患者也会出现下肢不同程度的疼痛。研究显示，疼痛也会对创面愈合产生不良影响 ［ 10］ 。在疼痛管理中，最重要的一环是对疼痛进行评估 ［ 11］ 。疼痛的严重程度在一定程度上直接关系到患者对治疗和护理方案的配合度，也直接影响创面的愈合速度，所以在创面处理时需要特别重视对创面疼痛的评估 ［ 12, 13］ 。本研究显示，42例DFU患者均存在疼痛，且疼痛程度和疼痛的相关影响多处于轻中度水平。与以往有关研究报道的DFU患者疼痛程度难以忍受有所不同 ［ 14］ ，考虑可能与患者的年龄以及病程有关。本研究中的患者多为60岁以上老年患者，老年患者对痛觉的敏感程度较低，耐受性较好；患者糖尿病病程大多在10年以上，随着糖尿病病程的延长，神经病变可能加重，导致疼痛感觉减退。
在临床中治疗疼痛除需要应用有效的止痛药物外，也需要规范有效的辅助手段。有研究显示，量子刺激疗法能够明显改善DFU患者足部感觉和疼痛 ［ 15］ 。本研究团队采用红光治疗仪和发光二极管，每天照射DFU患者足部创面2次，每次15 min，连续照射7 d，有效地减少了局部组织炎症的发生，降低了DFU患者疼痛程度（另文发表）。针对DFU患者，每日至少2次评估患者的疼痛状况，包括发生疼痛时患者的生命体征、体位、表情、疼痛性质、发生频率、持续时间等是十分必要的。针对DFU患者疼痛治疗的措施有嘱患肢抬高制动，根据疼痛评分报告及时进行药物干预；如疼痛感较强，遵医嘱及时使用止疼药物，防止疼痛引起血压升高；如肢体疼痛是由幻觉导致的，可不使用镇痛药物治疗。此外，根据DFU患者的个人情况，鼓励患者进行适当的足部运动和相应强度的有氧运动，缓解患者疼痛、改善患者生活质量。
本研究结果显示，DFU患者的疼痛状况与患者白细胞计数、血红蛋白水平以及足溃疡创面是否有细菌生长有关，而与自身一般情况，如性别、年龄、文化程度、自理能力、体重指数、糖尿病病程、Wagner分级以及糖化血红蛋白、白蛋白、前白蛋白水平等因素关系不大。广义线性模型分析结果表明，足溃疡创面标本细菌培养结果、白细胞计数均是影响42例DFU患者疼痛的主要因素，而血红蛋白水平不是主要影响因素。白细胞计数与DFU患者的疼痛程度之间存在相关性，可能是由于DFU患者往往存在不同程度的感染，感染会引发一系列炎症反应进而加重痛觉敏感程度，而疼痛反过来也可加重患者炎症反应，这一点在相关文献中也有类似报道 ［ 16］ 。创面标本细菌培养结果也证实了感染对创面疼痛的影响。感染可能是引起DFU患者疼痛状况的重要因素之一。研究表明，细菌感染通过破坏和延长创面愈合的炎症阶段来改变创面正常的愈合过程，抑制白细胞发挥正常功能，进一步阻碍了新鲜肉芽组织的形成 ［ 17］ 。溃疡创面中各种细菌可通过黏附聚集形成微生态菌落，释放大量毒素，破坏正常的Fb、纤维蛋白等的结构和功能，干扰组织的供血和供氧，使创面长期处于炎症不愈阶段，最终加剧患者的疼痛。长期疾病消耗和创面不愈可导致血红蛋白水平下降，使血红蛋白携带养分的能力下降、组织细胞再生能力降低、免疫系统功能逐步受损并导致免疫活性物质的抗菌能力下降，最终导致感染难以控制及疼痛加重。近年来研究显示，许多红细胞衍生的生物活性肽具有镇痛作用 ［ 18］ 。足溃疡创面的感染可引起血红蛋白的消耗，与此同时，创面修复过程中需要消耗大量的营养物质，从而导致机体免疫功能下降，增加感染的发生率和严重程度 ［ 19］ ，感染与红细胞消耗之间形成恶性循环，从而加重DFU的愈合难度和疼痛程度。
黄昀和张雅君 ［ 20］ 观察到，糖尿病患者Wagner分级越高，疼痛程度越明显，可能与创面及疼痛的长期存在导致传递痛觉的递质乙酰胆碱大量消耗有关，患者对疼痛刺激的阈值升高，敏感性降低。而本研究结果表明，不同Wagner分级患者的疼痛程度和疼痛的相关影响比较，差异均无统计学意义（ P>0.05），原因可能如下：（1）绝大部分为重症患者，存在选样偏差，影响分析结果；（2）患者的主观感受和评价不太准确，影响调查结果；（3）此外，样本量应是问卷条目的5~10倍 ［ 21, 22］ ，本研究中的条目数为11，样本量应为55~110，但由于疫情影响患者就诊，病源减少，可能会对研究结果造成一定的偏差，影响到结论的可信度。
综上，DFU患者疼痛程度和疼痛的相关影响均与患者的血红蛋白水平、白细胞计数相关。因此，医护人员不仅要关注DFU患者的基础药物治疗和创面处理，也要重视患者疼痛状况的评估和相关指标的动态监测，并根据个体差异，采取针对性的疼痛支持措施，促进创面的愈合，改善DFU患者的预后，提高患者的生活质量，同时减轻医疗经济负担。后期需要继续开展调查，对DFU患者进行大样本量的研究，为充分了解影响DFU患者疼痛的因素提供更加可靠的依据。
潘泽平、龚雅利：实施研究、采集数据、整理数据、统计分析、论文撰写、论文修改；石云龙、袁志强、安中莲：采集数据、整理数据、论文修改；彭毅志、乐率：研究指导、论文修改、经费支持所有作者均声明不存在利益冲突 -
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图 1 含锌水凝胶的表征及微观结构。1A.成胶前呈流动状态；1B.成胶后呈暗红色,倒立时可保持稳定不流动；1C.水凝胶可牢固黏附在手指上；1D.水凝胶呈多孔结构 扫描电子显微镜×500
注：含锌水凝胶指负载锌离子的聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶
图 2 3组糖尿病小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损感染创面的愈合情况。2A、2B、2C、2D.分别为空白对照组伤后0（即刻）、3、7、14 d创面情况；2E、2F、2G、2H.分别为单纯水凝胶组伤后0、3、7、14 d创面情况；2I、2J、2K、2L.分别为含锌水凝胶组伤后0、3、7、14 d创面情况,图2B、2F、2J的创面均被感染且情况相似,图2K剩余创面面积明显小于图2C、2G,图2L的创面基本愈合且剩余创面面积明显小于图2D、2H
注：空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌后分别用磷酸盐缓冲液、聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶、负载锌离子的聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶处理；每张分图底部为刻度尺刻度
图 3 3组糖尿病小鼠伤后14 d全层皮肤缺损感染创面组织学分析。3A、3B、3C.分别为空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面,图3C中的新生上皮较3A、3B更加完整 苏木精-伊红×100；3D、3E、3F.分别为空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面,图3F胶原沉积（蓝色区域）较图3D和图3E明显增多 Masson×100
注：空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌后分别用磷酸盐缓冲液、聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶、负载锌离子的聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶处理
图 4 3组糖尿病小鼠伤后14 d全层皮肤缺损感染创面中新生血管及M2型巨噬细胞分布情况 Alexa Fluor 594-4',6-二脒基-2-苯基吲哚×200。4A、4B、4C.分别为空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面,图4C中的新生血管明显较图4A、4B多；4D、4E、4F.分别为空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面,图4F中的M2型巨噬细胞明显较图4D、4E多
注：空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌后分别用磷酸盐缓冲液、聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶、负载锌离子的聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶处理；CD31和CD206（分别表示新生血管和M2型巨噬细胞）阳性染色为红色,细胞核阳性染色为蓝色
Table 1. 3组糖尿病小鼠伤后各时间点全层皮肤缺损感染创面的愈合率比较（%,
组别 样本数 3 d 7 d 14 d 空白对照组 5 8.8±2.9 31.6±6.7a 73.5±7.4a 单纯水凝胶组 5 8.2±2.0 44.7±5.4a 85.4±5.7 含锌水凝胶组 5 8.7±1.3 72.4±8.4 92.7±4.3 F值 0.11 168.00 13.28 P值 0.900 <0.001 <0.001 注：空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌后分别用磷酸盐缓冲液、聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶、负载锌离子的聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶处理；处理因素主效应,F=39.35,P<0.001；时间因素主效应,F=856.67,P<0.001；二者交互作用,F=22.64,P<0.001；与含锌水凝胶组相比,aP<0.05 
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