下载: 全尺寸图片 幻灯片

(1)明确人脐带间充质干细胞（hUCMSC）外泌体通过减轻过度炎症反应及促进微血管新生，从而促进小鼠全层皮肤缺损创面愈合。

(2)证实创缘皮下注射是采用hUCMSC外泌体治疗小鼠全层皮肤缺损创面的最佳给药途径，为临床应用hUCMSC外泌体治疗创面提供了理论依据。

Highlights:

(1)It was clarified that human umbilical cord mesenchymal stem cell (hUCMSC) exosomes promoted the wound healing of full-thickness skin defects in mice through alleviating excessive inflammatory response and promoting microvascular neogenesis.

(2)It was confirmed that subcutaneous injection at the wound margin was the optimal route of administration of hUCMSC exosomes for treating full-thickness skin defect wounds in mice, providing a theoretical basis for the clinical application of hUCMSC exosomes in wound treatment.

烧创伤、糖尿病足、压疮等造成的创面是烧伤及创面修复领域研究的重要方向，创面的迁延不愈给患者及社会带来了沉重的负担 ^{［ 1］} ，快速促进创面愈合对于减少严重并发症和提高患者生活质量具有十分重要的意义。目前，最常见的创面修复方法有清创、皮片/皮瓣移植及VSD等 ^{［ 2］} ，但这些措施与瘢痕形成和感染易感性增加等潜在不良反应有关。研究表明，人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUCMSC）及其相关的衍生物hUCMSC外泌体可通过改善创面局部的微环境发挥促皮肤创面愈合和减轻瘢痕形成的作用 ^{［ 3, 4, 5, 6, 7］} ，但截至目前，针对hUCMSC外泌体单一给药途径的研究较多，而关于其不同给药途径治疗效果的对比研究甚少。因此，本实验比较不同途径应用hUCMSC外泌体对小鼠全层皮肤缺损创面的治疗效果，旨在为探究临床应用hUCMSC外泌体治疗创面的最佳给药途径提供理论依据。

1.   资料与方法

本实验研究经解放军总医院第四医学中心动物保护委员会审批通过（批号：2021KY033-KS001），严格遵守国际医学科学动物保护委员会的相关规定，并按照国际生物医学研究指导原则进行。脐带组织标本采集获得产妇及其家属的同意（签署了知情同意书），同时获得内蒙古包钢医院伦理委员会的批准（批号：2023-MER-019），医疗和人体废弃物处理按国家标准执行。

1.1   主要材料来源

脐带组织取自3名于内蒙古包钢医院妇产科经阴道或剖宫产分娩的25~35岁产妇，产妇术前传染病检查确定均无甲肝、乙肝、梅毒、获得性免疫缺陷综合征等传染性疾病。健康无特殊病原体级6~8周龄雄性BALB/c小鼠120只，体重25~30 g，购于北京斯贝福生物科技有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0010。DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜、PBS、Ⅱ型胶原蛋白酶购自美国Gibco公司，聚乙二醇6000粉末购自国药集团化学试剂有限公司，免疫组织化学染色试剂盒购自北京谷歌生物科技有限公司，HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，IL-6、TNF-α的ELISA试剂盒购自赛默飞生物制药（杭州）有限公司，Tecnai G2 Spirit BioTwin型透射电子显微镜购自美国FEI公司，IzonqNano型纳米分析系统购自新西兰Izon公司。

1.2   hUCMSC的分离、培养及鉴定

将获取的脐带组织均匀剪碎至1 mm ³大小，放入1 g/L Ⅱ型胶原蛋白酶溶液中，于37 ℃条件下搅拌消化20 min之后转移至1 g/L胰蛋白酶溶液中继续搅拌消化25 min。用200目细胞筛过滤前述溶液后，将获得的细胞悬液于37 ℃条件下以半径为10 cm、1 000 r/min离心5 min，去除上清液，用DMEM/F12完全培养基（培养基中加入体积分数20%胎牛血清、25 mmol/L谷氨酰胺、常规浓度的青霉素与链霉素）重新悬浮细胞。将重新悬浮的细胞以1×10 ⁶个/cm ²的密度接种于含DMEM/F12完全培养基的培养瓶中，培养3 d后更换新鲜DMEM/F12完全培养基，之后2 d换液1次，取第3~8代细胞进行后续实验。取第3代细胞，经流式细胞术鉴定为阳性表达CD29与CD90和CD105、阴性表达造血细胞系标志物CD34的hUCMSC。

1.3   hUCMSC外泌体的分离、提取及鉴定

按照文献［ 8, 9］中的聚乙二醇沉淀结合超速离心法分离、提取hUCMSC外泌体。用聚乙二醇6000和超纯水配制质量浓度为100 g/L的聚乙二醇溶液，与第3~8代hUCMSC培养上清液混合孵育过夜，于4 ℃条件下，以半径为10 cm、10 000 r/min离心60 min，弃去上清液，所得沉淀即为hUCMSC外泌体。取适量hUCMSC外泌体，在透射电子显微镜20 000倍放大倍数下观察外泌体形态，采用纳米分析系统分析外泌体粒径。

1.4   小鼠全层皮肤缺损创面模型的建立及动物分组处理

取120只小鼠禁食、水12 h后，对每只小鼠按10~20 μL/g的剂量腹腔注射3 g/L戊巴比妥钠麻醉（麻醉方法下同），利用眼科手术剪在小鼠背部正中制备直径为1.5 cm的圆形全层皮肤缺损创面，直至暴露深筋膜层，拍照记录每只小鼠的原始创面情况。

伤后即刻，按随机数字表法将造模成功后小鼠分为对照组、创面局部涂抹组、创缘皮下注射组、尾静脉注射组，每组30只小鼠。对照组：不进行给药处理；创面局部涂抹组：将0.2 mL含200 μg hUCMSC外泌体的PBS均匀涂抹于小鼠创面上；创缘皮下注射组：将0.2 mL含200 μg hUCMSC外泌体的PBS利用胰岛素注射器抽吸后，于距创周0.5 cm的圆周上将周长分为4等份的4个位点均匀皮下注射至创基及创缘 ^{［ 3］} ；尾静脉注射组：将0.2 mL含200 μg hUCMSC外泌体的PBS利用胰岛素注射器沿小鼠尾静脉缓慢注入 ^{［ 10］} 。于创面处理5 min后，在小鼠背部皮肤创面上覆盖1层凡士林纱布，用棉球压住创面，再用医用自粘绷带缠绕1圈固定（对照组小鼠于相同时间点接受相同处理）。术后将小鼠单笼饲养。

1.5   观测指标

1.5.1   创面愈合率

每组取10只小鼠，于伤后7、14、21 d拍照记录创面愈合情况，采用Image Pro Plus图像分析软件（美国国立卫生研究院）进行愈合率分析。创面愈合率=（原始创面面积-伤后各时间点创面面积）÷原始创面面积×100%。

1.5.2   创面组织的病理学变化和胶原纤维情况

伤后7、14、21 d，每组分别取10只小鼠（伤后21 d各组10只小鼠为完成创面愈合情况观察的小鼠）麻醉，采集创面及创周皮肤组织。取部分组织，用40 g/L多聚甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，制成5 µm厚切片。取部分切片，分别行常规HE和Masson染色，于光学显微镜40倍放大倍数下观察创面组织的病理学变化和胶原纤维情况。

1.5.3   创面组织中新生微血管数量

取1.5.2中各组小鼠各时间点剩余创面组织切片，采用免疫组织化学法检测微血管密度。一抗为兔抗小鼠CD31多克隆抗体（稀释比为1∶600），二抗为即用型辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体，二氨基联苯胺显色，苏木精复染，中性树胶封片。于光学显微镜200倍放大倍数下观察CD31的阳性表达（棕褐色，指示新生微血管）并计数。每张切片任取3个视野，结果取均值。

1.5.4   创面组织中TNF-α与IL-6的含量

取1.5.2中各组小鼠各时间点剩余创面组织，称重后常规匀浆离心并进行蛋白定量，按照ELISA试剂盒说明书检测创面组织中TNF-α及IL-6的含量。利用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值，根据样品的吸光度值计算出TNF-α和IL-6的含量。

1.6   统计学处理

采用SPSS 21.0统计软件进行数据的整理与分析。计量资料数据均符合正态分布，以 x ¯ ± s 表示，对多因素组间总体比较行重复测量方差分析或析因设计方差分析，对组间两两比较行Dunnett检验。 P<0.05表示差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   hUCMSC外泌体的形态与粒径

透射电子显微镜下，hUCMSC外泌体呈现大小均一的茶托状外观，具有脂质双分子层膜，见 图1A；hUCMSC外泌体的粒径分布于30~150 nm之间，峰值为100 nm左右，见 图1B。

注：图1B为横坐标经过lg处理后生成的图

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   创面愈合率

伤后7 d，4组小鼠创面均有一定程度的缩小，但对照组小鼠较3个给药组小鼠创面痂皮质韧，呈黑褐色改变。伤后14 d，与对照组相比，3个给药组小鼠创面面积进一步缩小，其中，创缘皮下注射组小鼠创面愈合最为显著，且创缘周围开始有毛发生长。伤后21 d，创缘皮下注射组小鼠创面基本愈合且有毛发生长覆盖；尾静脉注射组小鼠创面愈合情况次之，创周见部分毛发生长；但对照组及创面局部涂抹组小鼠仍残留较大创面未愈合，且创周毛发生长不明显。伤后7、14、21 d，3个给药组小鼠创面愈合率均显著高于对照组（ P<0.05）；与创面局部涂抹组比较，创缘皮下注射组及尾静脉注射组小鼠创面愈合率均显著升高（ P<0.05）；与尾静脉注射组比较，创缘皮下注射组小鼠创面愈合率均显著升高（ P<0.05）。见 图2与 表1。

注：对照组小鼠未接受给药处理；对其余3组小鼠均给予人脐带间充质干细胞外泌体，组名指示相应给药方式

下载: 全尺寸图片 幻灯片

表1  4组全层皮肤缺损小鼠伤后各时间点创面愈合率比较（%， x ¯ ± s ）

表1.  Comparison of wound healing rates of 4 groups of mice with full-thickness skin defects at each time point after injury

组别	鼠数（只）	7 d	14 d	21 d
创面局部涂抹组	10	26.1±4.3	45.7±8.3	85.4±5.0
创缘皮下注射组	10	36.0±5.4	66.8±4.1	99.7±3.4
尾静脉注射组	10	31.6±6.6	59.4±9.4	92.5±4.2
对照组	10	17.3±2.5	40.4±10.6	80.2±5.6
P 1值		<0.001	0.047	<0.001
P 2值		<0.001	<0.001	<0.001
P 3值		<0.001	<0.001	<0.001
P 4值		<0.001	<0.001	<0.001
P 5值		<0.001	<0.001	<0.001
P 6值		0.002	0.003	<0.001
注：对照组小鼠未接受给药处理；对其余3组小鼠均给予人脐带间充质干细胞外泌体，组名指示相应给药方式；时间因素主效应， F=3 051.01, P<0.001；处理因素主效应， F=179.96, P<0.001；两者交互作用， F=6.56, P<0.001； P 1值、 P 2值、 P 3值分别为创面局部涂抹组、创缘皮下注射组、尾静脉注射组与对照组各时间点比较所得； P 4值、 P 5值分别为创缘皮下注射组、尾静脉注射组与创面局部涂抹组各时间点比较所得； P 6值为创缘皮下注射组与尾静脉注射组各时间点比较所得

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.3   创面组织病理学变化与胶原纤维情况

HE染色显示，伤后7 d，对照组小鼠创面大部分创面裸露，血运欠佳，部分由肉芽组织覆盖，炎症反应重；创面局部涂抹组小鼠创面血运较为丰富，炎症反应较对照组轻；尾静脉注射组小鼠部分创面由肉芽组织覆盖，血运丰富，有轻度的炎症反应；创缘皮下注射组小鼠整个创面被肉芽组织覆盖，血运非常丰富，炎症反应最轻。伤后14 d，对照组小鼠创面肉芽组织较伤后7 d时变厚，血运仍较差，炎症反应仍较重；创面局部涂抹组小鼠创面全部由肉芽组织覆盖，血运较丰富，炎症反应较伤后7 d时减轻；创缘皮下注射组和尾静脉注射组小鼠大部分创面均上皮化，血运丰富，炎症反应较伤后7 d时明显减轻，其中尾静脉注射组改变尤为明显。伤后21 d，对照组小鼠大部分创面已上皮化，残留部分未愈合创面有肉芽组织覆盖，血运较伤后14 d时丰富，炎症反应较伤后14 d时减轻但仍重于3个给药组；创面局部涂抹组小鼠创面大部分已上皮化，残余创面较对照组小，血运丰富，炎症反应仍高于创缘皮下注射组及尾静脉注射组；创缘皮下注射组和尾静脉注射组小鼠创面均已完全上皮化，血运丰富，未见明显炎症反应，其中，创缘皮下注射组小鼠创面愈合处的毛发等生长更为旺盛。

Masson染色显示，伤后7 d，对照组与创面局部涂抹组小鼠创面组织中胶原纤维数量少且排列较为紊乱；创缘皮下注射组和尾静脉注射组小鼠创面组织中胶原纤维数量相对较多，排列相对整齐。伤后14 d，对照组小鼠创面组织中胶原纤维数量较伤后7 d时略增多但排列仍较紊乱，创面局部涂抹组小鼠创面组织中胶原纤维数量略高于对照组但排列也较紊乱，而创缘皮下注射组和尾静脉注射组小鼠创面组织中胶原纤维数量较其余2组明显增多且排列整齐。伤后21 d，对照组小鼠创面组织中胶原纤维数量未见明显增多且排列仍较紊乱；创面局部涂抹组小鼠创面组织中胶原纤维数量较对照组相对致密但排列也较紊乱；创缘皮下注射组和尾静脉注射组小鼠创面组织中胶原纤维数量较对照组明显增加且排列整齐，其中，创缘皮下注射组小鼠创面组织中胶原纤维的排列更加致密整齐。见 图3。

注：对照组小鼠未接受给药处理；对其余3组小鼠均给予人脐带间充质干细胞外泌体，组名指示相应给药方式；胶原纤维呈蓝色

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   创面组织中新生微血管数量

伤后7、14、21 d，与对照组比较，3个给药组小鼠创面组织中新生微血管数量均显著增多（ P<0.05）；与创面局部涂抹组比较，创缘皮下注射组及尾静脉注射组小鼠创面组织中新生微血管数量均显著增多（ P<0.05）；与尾静脉注射组比较，创缘皮下注射组小鼠创面组织中新生微血管数量均显著增多（ P<0.05）。见 图4及 表2。

注：对照组小鼠未接受给药处理；对其余3组小鼠均给予人脐带间充质干细胞外泌体，组名指示相应给药方式；新生微血管呈棕褐色

下载: 全尺寸图片 幻灯片

表2  4组全层皮肤缺损小鼠伤后各时间点创面组织中新生微血管数量比较（根， x ¯ ± s ）

表2.  Comparison of the number of new microvessels in the wound tissue of 4 groups of mice with full-thickness skin defects at each time point after injury

组别	鼠数（只）	7 d	14 d	21 d
创面局部涂抹组	30	24.1±2.5	50.7±4.1	44.2±2.3
创缘皮下注射组	30	32.2±2.9	67.5±4.9	53.6±3.7
尾静脉注射组	30	27.8±2.4	59.1±3.7	49.6±2.6
对照组	30	20.6±1.7	46.7±3.4	40.9±2.8
P 1值		<0.001	0.001	<0.001
P 2值		<0.001	<0.001	<0.001
P 3值		<0.001	<0.001	<0.001
P 4值		<0.001	<0.001	<0.001
P 5值		<0.001	<0.001	<0.001
P 6值		<0.001	<0.001	<0.001
注：对照组小鼠未接受给药处理；对其余3组小鼠均给予人脐带间充质干细胞外泌体，组名指示相应给药方式；各组各时间点样本数为10；于200倍视野下计数新生微血管；时间因素主效应， F=2 889.44， P<0.001；处理因素主效应， F=355.25， P<0.001；两者交互作用， F=16.90， P<0.001； P 1值、 P 2值、 P 3值分别为创面局部涂抹组、创缘皮下注射组、尾静脉注射组与对照组各时间点比较所得； P 4值、 P 5值分别为创缘皮下注射组、尾静脉注射组与创面局部涂抹组各时间点比较所得； P 6值为创缘皮下注射组与尾静脉注射组各时间点比较所得

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.5   创面组织中TNF-α与IL-6的含量

伤后7、14、21 d，3个给药组小鼠创面组织中TNF-α和IL-6的含量均显著少于对照组（ P<0.05）；与创面局部涂抹组比较，创缘皮下注射组及尾静脉注射组小鼠创面组织中TNF-α和IL-6的含量均显著减少（ P<0.05）；与尾静脉注射组比较，创缘皮下注射组小鼠创面组织中TNF-α和IL-6的含量均显著减少（ P<0.05）。见 表3。

表3  4组全层皮肤缺损小鼠伤后各时间点创面组织中TNF-α与IL-6的含量比较（ng/L， x ¯ ± s ）

表3.  Comparison of the content of TNF-α and IL-6 in the wound tissue of 4 groups of mice with full-thickness skin defects at each time point after injury

组别	鼠数（只）	TNF-α			IL-6
		7 d	14 d	21 d	7 d	14 d	21 d
创面局部涂抹组	30	168±15	108±13	86±10	295±32	152±14	133±12
创缘皮下注射组	30	142±13	84±8	70±9	248±25	126±18	115±10
尾静脉注射组	30	156±15	92±13	78±9	278±22	140±15	124±15
对照组	30	205±15	143±15	101±10	332±30	162±19	142±16
P 1值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	0.042	0.019
P 2值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
P 3值		<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001
P 4值		<0.001	<0.001	0.001	<0.001	<0.001	<0.001
P 5值		0.004	<0.001	0.005	0.044	0.018	0.022
P 6值		<0.001	0.037	<0.001	<0.001	0.005	0.020
注：对照组小鼠未接受给药处理；对其余3组小鼠均给予人脐带间充质干细胞外泌体，组名指示相应给药方式；各组各时间点样本数为10；肿瘤坏死因子α（TNF-α）与白细胞介素6（IL-6）的时间因素主效应， F值分别为1 477.78、2 419.30， P值均<0.001；处理因素主效应， F值分别为282.78、73.30， P值均<0.001；两者交互作用， F值分别为17.30、13.30， P值均<0.001； P 1值、 P 2值、 P 3值分别为创面局部涂抹组、创缘皮下注射组、尾静脉注射组与对照组各指标各时间点比较所得； P 4值、 P 5值分别为创缘皮下注射组、尾静脉注射组与创面局部涂抹组各指标各时间点比较所得； P 6值为创缘皮下注射组与尾静脉注射组各指标各时间点比较所得

下载: 导出CSV 

| 显示表格

3.   讨论

皮肤作为人体最大的器官，在抵御外界环境刺激及病原微生物侵袭等方面发挥着关键作用。大面积烧创伤、撕脱伤等急性皮肤缺损以及糖尿病、慢性溃疡等相关的皮肤损伤严重影响患者的生存质量 ^{［ 11］} 。近年来研究表明，hUCMSC外泌体可通过向受体细胞投递多种蛋白质、脂质、核酸 ^{［ 12, 13］} 等活性物质，影响创面愈合的多个环节、多种细胞进而促进皮肤的修复与再生 ^{［ 14, 15］} 。本实验采用聚乙二醇沉淀结合超速离心法分离获取的囊泡结构通过透射电子显微镜及粒径分析鉴定为hUCMSC外泌体。本研究比较了创面局部涂抹、创缘皮下注射和尾静脉注射hUCMSC外泌体对小鼠全层皮肤缺损创面的治疗效果，结果显示，3种途径给药均较不给药的对照显著提高伤后各时间点创面的愈合率，其中，创缘皮下注射hUCMSC外泌体后创面愈合率提高最为显著，炎症反应最轻，创面血运最为丰富，胶原排列最为整齐致密且皮肤的附属器也有部分恢复和生长。

炎症反应是机体对各种有害刺激的一种防御应答，是调控创面愈合的重要环节。局部皮肤软组织受损后，单核巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞等炎症细胞以及TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子释放增加，启动炎症反应。适度的炎症反应有助于清除创面坏死组织及细胞碎片并刺激释放细胞生长因子，对抗感染促进创面愈合 ^{［ 16］} ；但过度和长时间的炎症反应可导致创面迁延难愈、病理性瘢痕增生 ^{［ 17］} 、多器官功能障碍甚至死亡 ^{［ 18］} 。有研究证实，慢性难愈性创面与局部持久、过度的炎症刺激有关，通过抑制局部炎症反应可显著加快创面愈合进程 ^{［ 19］} 。人骨髓间充质干细胞外泌体通过激活第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/蛋白激酶B信号通路，抑制促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的表达，促进抗炎细胞因子IL-10的表达，同时，促进巨噬细胞抗炎表型M2型极化，抑制促炎表型M1型极化，促进糖尿病小鼠皮肤缺损创面的愈合 ^{［ 20］} 。研究表明，hUCMSC外泌体富含的内源性微小RNA-181c通过抑制Toll样受体4信号通路，使中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞数量减少，TNF-α、IL-1β等促炎因子表达下降，减弱LPS介导的炎症反应并减轻创面瘢痕增生 ^{［ 21］} 。本研究结果也证实，通过尾静脉注射、创缘皮下注射及创面局部涂抹hUCMSC外泌体，随着小鼠背部创面逐渐愈合，创面组织中TNF-α及IL-6的含量较未用药对照明显减少，表明hUCMSC外泌体的应用可以有效调控创面的炎症反应，减少促炎因子的释放及炎症介质的产生，减轻创面炎症反应，促进创面愈合。相对而言，创缘皮下注射治疗效果最佳，考虑与经尾静脉注射给药导致的全身代谢损耗以及创面局部涂抹由于局部微环境造成的hUCMSC外泌体额外损耗、破坏等使创面局部有效浓度降低有关，具体因素需要进一步研究。

血管起着运送营养物质、促进细胞代谢的作用，血管生成在促进创面愈合及瘢痕增生方面均具有重要的作用，异常血管新生可能是导致瘢痕组织过度增生的关键因素 ^{［ 22］} 。相关研究证明，当通过尾静脉注射人脂肪间充质干细胞外泌体治疗大鼠全层皮肤缺损创面时，外泌体可促进创面血管新生及皮肤细胞的增殖和迁移等 ^{［ 23］} 。一项关于糖尿病小鼠创面模型的研究显示，与PBS对照相比，使用人脂肪间充质干细胞外泌体能明显促进创面微血管生成，使Fb增殖速度明显加快，后期胶原沉积增多，从而促进创面愈合 ^{［ 24］} 。本实验也证实，创缘皮下注射组、尾静脉注射组及创面局部涂抹组小鼠创面组织中新生微血管的数量显著多于对照组，其中，创缘皮下注射组小鼠创面组织中新生微血管的数量最多，但hUCMSC外泌体促创面血管新生的具体作用机制及是否可减轻创面瘢痕增生及其分子机制有待后续进一步研究。

综上所述，通过3种途径应用hUCMSC外泌体均可通过减轻炎症反应，促进血管新生，进而加快小鼠全层皮肤缺损创面愈合，其中，创缘皮下注射的治疗效果更佳。基于本实验结果可知，创缘皮下注射是应用hUCMSC外泌体治疗创面的最佳给药途径。